Name: De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Leer primaire neuronale culturen bereiden uit midgastrula-stadium Drosophila-embryo's. Deze methode onderzoekt elektrische excitabiliteit en synaptische transmissie in ontwikkelingsneurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​NS27501 naar DKOD. Extra ondersteuning voor dit werk vanuit een HHMI professor Grant naar DKOD.

I. Drosophila embryo <ol><li> Bereid ei collectie platen <ol><li> Kook 200 ml dH 2 O met 8 g agar </li><li> Afkoelen tot 50 ° C </li><li> Voeg 2 ml EtOH en 2 ml azijnzuur </li><li> Giet het mengsel in 35 mm plastic petrischaaltjes, tops </li><li> Cool en op te slaan in luchtdichte container bij 4 ° C </li><li> Maakt ongeveer 80 platen </li></ol></li><li> Bereid Gist plakken <ol><li> Los Fleishmans bakkersgist in water om vorm te plakken </li><li> Magnetron gedurende 20-30 seconden om gist te doden (pas op voor overkoken) </li><li> Op te slaan in 10 cc spuit (zonder naald) bij 4 ° C voor 2 weken </li></ol></li><li> Vliegen: De volwassenen worden gebruikt voor het verzamelen van eieren zijn over het algemeen het meest productief tussen 3 en 14 dagen na opkomst, op voorwaarde dat zij toegang hebben tot vers voedsel had. Veel mutant voorraden zijn afgenomen vruchtbaarheid dat zich kan manifesteren in een verlaagde tarief van de eileg en een verandering in de leeftijd waarop zij het meest productief zijn. In het algemeen, enkele honderden volwassenen te maken voor een goede leg bevolking. </li><li> Procedure: Spreid een laagje gist pasta op een ei collectie plaat. Dit zorgt voor een gunstige voedingsbodem voor het leggen van eieren. Overdracht volwassen vliegen om een ​​schone ei collectie fles en tape de collectie plaat aan de mond van de fles. Laat de vliegen in deze flessen langer dan 3-4 uur als de luchtvochtigheid stijgt en de vliegen blijven steken in plakken en aan de zijkanten van de fles. </li></ol> II. Embryo Dechorionation met Bleach <ol><li> Stel een Buchner-trechter is aangesloten op een filtreerkolf gekoppeld aan een afzuiger. Leg een stuk Whatman # 1 papier in de trechter. Met afzuiging draait, nat het papier met steriel gedestilleerd water. </li><li> Spoel embryo&#39;s uit de collectie van platen op het filter papier met een stroom van water uit een spuitfles. </li><li> Spoel ze in verschillende volumes steriel water, uit te schakelen afzuiger, en voeg vervolgens een trechter volume van 50% bleekwater. Laat de eieren zitten 5-10 minuten. De chorions zal worden opgelost in 1-2 minuten, maar hoe langer je laat de embryo&#39;s in het bleekmiddel het meer van de vervuilende gist zal worden vernietigd. Kiezen uit een volwassenen of larven die zijn afgespoeld schotel. </li><li> Spoel de embryo&#39;s in een steriele petrischaal (NIET weefselkweek) met steriel gedestilleerd water. Veel van de embryo&#39;s blijft plakken aan de bodem van de schaal, indien het niet vooraf bevochtigd. Spoel verschillende keren met steriel water in dit gerecht. </li><li> Onderzoek van de embryo&#39;s met doorgelaten licht te halen uit mid-gastrulastadium embryo&#39;s. </li></ol> III. De voorbereiding van single embryo culturen <ol><li> Maak DDM1 (zie de recepten in deel IV) </li><li> Giet het water af schotel van embryo&#39;s vlak voor het kweken. Bedek embryo&#39;s met steriele media. </li><li> Uiteengezet 3, 35 mm petrischaaltjes. Zet in 4 geautoclaveerde ronde dekglaasjes in elk gerecht. Op elke dekglaasje, zet 5 ul medium. Gebruik Bellco coverslips-low loodglas coverlips. Bellco Biologische Glaswerk 800-257-7043 Cat # 1943 tot 00,012 </li><li> Trek een aantal vrij goede pipetten. De pipetten die wij gebruiken zijn getrokken op een Narishige PP-83 trekker. De exacte afmetingen van de pipet niet cruciaal en we meestal trek ze fijner dan we willen en ze afbreken van de tip in hetzelfde gezichtsveld als het embryo om de grootte te meten. Je wilt niet op te zuigen al van de embryo&#39;s in een keer, en je niet wilt dat de tip zo klein dat het 5 minuten duurt om zuigen de cellen. Streven naar ergens tussenin. Onderzoek van de embryo&#39;s met doorvallend licht en gebruik van een mond zuigbuis aan de pipet om de inhoud van het embryo te verwijderen. De verspreiding van de cellen op de voorbereide dekglaasje door voorzichtig het verdrijven van de cellen als het dekglaasje dicht mogelijk. U kunt de dekglaasjes te onderzoeken bij een hogere macht en verder de cellen verspreiden op dezelfde manier. </li><li> Laat de cellen zitten voor niet langer dan 10 minuten. Flood de schotel met de media en zet in de broedstoof, 4-5% CO 2-omgeving, als u gedefinieerd medium. Temperatuur tussen 22-24 ° C. We routinematig gebruik van 23 ° C en 95% luchtvochtigheid. Luchtvochtigheid is belangrijk, als je wilt om verdamping te voorkomen. U kunt gebruik maken van een standaard zoogdieren incubator geplaatst in een coldroom met temperatuurregeling ingesteld op 23 ° C. </li></ol> IV. DDM1 Gedefinieerd medium voor het kweken van de culturen <ol><li> Maak DMEM: Aan 100 ml van Ham&#39;s F12/DME Media (DMEM) (Irvine Scientific # 9052). <ol><li> Voeg 0,476 g Hepes (20mm) (Sigma # H-3375). Mix. </li><li> Voeg 1,25 ml L-Glutamine 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mix. </li><li> Filter in kap met 0,2 micrometer acetaat spuitfilter (moeten 2 filters). </li><li> De pH is 6,64 en 288 Osm. </li><li> Maak porties van 10 ml in 15 ml centrifugebuis. </li><li> Bewaren bij 4 ° C gedurende niet meer dan 2 weken. Opmerking: Gebruik altijd geautoclaveerd gefilterd water en maken in containers die zijn voorbehouden voor Media en supplementen alleen. Zet nooit een pH-elektrode of een roerstaafje gebruikt voor andere doeleinden in Media.To maken DDM1: Voeg een aanvulling op onderstaandenaar DMEM vlak voor het kweken van. </li></ol></li><li> Tot 10 ml van DMEM toe te voegen: <ul><li> 100 ul Transferrine </li><li> 100 ul putrescine </li><li> 100 ul Selenium </li><li> 100 ul Progesteron </li><li> 50 ul Insuline </li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

In Drosophila culturen bereid uit midgastrula stadium embryo&#39;s van de neuronen ontstaan ​​uit neuroblast voorlopers, waarvan vele delen voorafgaand aan de differentiatie in vitro. Dit systeem biedt dus een unieke gelegenheid voor de exploratie van genetische en omgevingsfactoren belangrijk in een zeer vroege fase van neuronale ontwikkeling (Rohrbaugh et al.., 2003). We hebben aangetoond dat neuronen gekweekt in een eenvoudige beschreven medium differentiëren in elektrisch prikkelbare neuronen die vormen ook functionele synaptische verbi...

De culturen die in deze media moeten worden gehandhaafd in een 5% CO2 incubator op ongeveer 22-24 ° C. We maken gebruik van een standaard zoogdieren weefselkweek incubator geplaatst in een koude kamer en verwarmd tot 23 ° C. Altijd gebruikt geautoclaveerd gefilterd water en maken in containers die zijn voorbehouden voor de media en supplementen alleen. Zet nooit een pH-meter of een roerstaafje gebruikt voor andere doeleinden in de media.

de voorbereiding van neuronale culturen van midgastrula stage drosophila embryo&#39;s

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Deze video illustreert de procedure voor het maken van de primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo&#39;s. De methoden voor het verzamelen van embryo&#39;s en hun dechorionation met behulp van bleekwater worden gedemonstreerd. Met behulp van een glazen pipet aan een mond zuigbuis, illustreren we de verwijdering van alle cellen van een embryo&#39;s. De methode voor het dispergeren van cellen uit elk embyro in een kleine (5 l) druppel medium op een ongecoat glas dekglaasje is aangetoond. Een blik door de microscoop op 1 uur na plating illustreert de voorkeur celdichtheid. Het merendeel van de cellen die overleven wanneer ze groeien in beschreven medium zijn neuroblasts dat een of meer keer in de cultuur te verdelen voor de uitbreiding neuritische processen 12-24 uur. Een blik door de microscoop illustreert het niveau van de neurietuitgroei en vertakking naar verwachting in een gezonde cultuur in 2 dagen in vitro. De cultures worden gekweekt in een eenvoudige bicarbonaat op basis van beschreven medium, in een 5% CO 2 incubator bij 22-24 ° C. Neuritische processen verder uit te werken over de eerste week in de cultuur en wanneer ze contact maken met de neurieten van naburige cellen die ze vormen vaak functionele synaptische verbindingen. Neuronen in deze culturen te uiten voltage-gated natrium, calcium en kalium kanalen en worden elektrisch opgewonden. Deze cultuur systeem is nuttig voor het bestuderen van moleculaire genetische en omgevingsfactoren die neuronale differentiatie, prikkelbaarheid, en synapsvorming / functie te reguleren.

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo&#39;s. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

Deze video illustreert de procedure voor het maken van primaire neuronale culturen uit Drosophila-embryo's in het midgastrula-stadium. De methoden voor het verzamelen van embryo's ...

Mijn naam is Diana Dowd en ik ben professor bij de afdeling Ontwikkelings- en Celbiologie en Anatomie en Neurobiologie aan UC Irvine. Vandaag ga ik de preparatie van primaire neuronale culturen uit Drosophila-embryo's demonstreren. Dit houdt in dat alle cellen uit een Drosophila-embryo in het mid-gastrulatiestadium worden verwijderd en in een celcultuur worden geplaatst.We gebruiken deze culturen om echt te begrijpen welke genen en omgevingsfactoren belangrijk zijn voor de regulatie van de elektrische exciteerbaarheid en synaptische transmissie tussen drosophila-neuronen. Om deze procedure te starten, moeten we drosophila-embryo's verzamelen. Hiervoor nemen we platen voor eiverzameling en verspreiden we daarop een kleine hoeveelheid gistpasta.Het is een gunstig substraat voor de volwassen vliegen om hun eitjes op te leggen. We plaatsen deze platen op flessen die een populatie volwassen vliegen bevatten, gewoonlijk honderd tot 200 vliegen. Vervolgens laten we de volwassen vliegen gedurende ongeveer twee tot drie uur hun eitjes leggen.Vervolgens verwijderen we de platen voor de eierverzameling; dit zijn de embryo's die we gebruiken voor de kweekprocedure. De volgende stap in de proce

preparation-neuronal-cultures-from-midgastrula-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Standpunten van levende culturen tonen neurietuitgroei en beeldvorming van calcium niveaus met behulp van Fura-2.

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het bereiden van primaire cellen los...

Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo&#39;s

This video outlines a method for cultivating dopaminergic neurons from mouse embryonic brain tissue. The process includes treating the midbrain with a proteolytic enzyme, detaching the cells, and culturing them on polymer-coated coverslips in a nutrient-rich medium with antibiotics for their growth and long-term viability.

Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

This video demonstrates a protocol to identify exogenous factors that initiate the reactivation of Drosophila brain neural stem cells from their quiescent state. Freshly hatched larvae are dissected to isolate their brains, which are then cultured in media with or without a test hormone to evaluate the hormone's potential to induce neural stem cell reactivation and proliferation.

Analyzing Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

The video demonstrates the process of isolating and culturing dopamine neurons from the midbrain of mouse embryos. The isolated ventral midbrain floors are dissociated using enzymes. The resulting dopamine neurons are harvested and transferred into micro-islands inside multi-well plates. The cells are incubated with a dopamine neuron medium to maintain the cells at a high density inside the micro-islands.

Isolation and Culture of Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Source: Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the visualization of axonal projections in Drosophila embryos. Immunolabeling of motor neurons, precise dissection to expose neuronal structures, and differential interference contrast microscopy collectively reveal detailed neuronal architecture, emphasizing the axonal projection patterns.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.

Organel Transport in gekweekte Drosophila Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

De oorzaken van degeneratie van dopaminerge neuronen in de middenhersenen tijdens de ziekte van Parkinson zijn niet volledig begrepen. Cellulaire kweeksystemen bieden een essentieel hulpmiddel voor de studie van de neurofysiologische eigenschappen van deze neuronen. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol dat kan worden gebruikt voor in vitromodellering van neurodegeneratie.

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Er is een methode vastgesteld om rustige neurale stamcellen in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten te reactiveren. Met behulp van deze methode kan de rol van systemische signalen worden losgekoppeld van weefselintrinsieke signalen in de regulatie van neurale stamcelrust, in- en uitgang.

Neurale stamcelreactivatie in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten

Leer primaire neuronale culturen bereiden uit midgastrula-stadium Drosophila-embryo's. Deze methode onderzoekt elektrische excitabiliteit en synaptische transmissie in ontwikkelingsneurobiologie.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo's

Meer video's verkennen