Name: Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00.000+00:00
Duration: 17 min 12 s
Description: Leer methyltransferases profileren uit complexe eiwitmengsels met behulp van Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS). Deze methode maakt isolatie en identificatie van doeleiwitten uit Escherichia coli-cellysaten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Human Frontier Science Program Organization (HFSP Award 2007, RGP0058/2007-C). Wij danken prof. dr. Richard Roberts voor het initiëren van het project en voor de vruchtbare discussies.

<ol><li>Katayama, H., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+for+drug+discovery+based+on+compound-immobilized+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics for drug discovery based on compound-immobilized affinity chromatography.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 855, 21-27 (2007).</li>
<li>Barglow, K. T., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+for+the+functional+annotation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling for the functional annotation of enzymes.</a> Nat. Methods. 4, 822-827 (2007).</li>
<li>Koster, H., Little, D. P., Luan, P., Muller, R., Siddiqi, S. M., Marappan, S., Yip, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Dalhoff, C., Hueben, M., Lenz, T., Poot, P., Nordhoff, E., Koster, H., Weinhold, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+S-Adenosyl-L-homocysteine+Capture+Compounds+for+Selective+Photoinduced+Isolation+of+Methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of S-Adenosyl-L-homocysteine Capture Compounds for Selective Photoinduced Isolation of Methyltransferases.</a> ChemBioChem. 11, 256-265 (2010).</li>
<li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">S-Adenosylmethionine.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 32, 391-3952 (2000).</li>
<li>Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methylation%3A+selected+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biological methylation: selected aspects.</a> Annu. Rev. Biochem. 44, 435-451 (1975).</li>
<li>Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Watson+and+Crick%3A+DNA+methylation+and+molecular+enzymology+of+DNA+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases.</a> ChemBioChem. 3, 274-293 (2002).</li>
<li>Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+nucleotide+repertoire+of+the+ribosome+with+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding the nucleotide repertoire of the ribosome with post-transcriptional modifications.</a> ACS Chem. Biol. 2, 610-619 (2007).</li>
<li>Grillo, M. A., Colombatto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Adenosylmethionine+and+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">S-Adenosylmethionine and protein methylation.</a> Amino Acids. 28, 357-362 (2005).</li>
<li>Fujioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+small+molecule+methyltransferases%3A+their+structural+and+functional+features%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mammalian small molecule methyltransferases: their structural and functional features.</a> Int. J. Biochem. 24, 1917-1924 (1992).</li>
<li>Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorchardt%2C+RT+%22The+Biochemistry+of+S-Adenosylmethionine%22">The Biochemistry of S-Adenosylmethionine</a>. Salvatore, F., Borek, E., Zappia, V., Williams-Ashman, H. G., Schlenk, F. , Columbia University Press. New York, NY. 151-171 (1977).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S-adenosyl-l-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S-adenosyl-l-methionine.</a> Biochemistry. 25, 4444-4449 (1986).</li>
<li>Keller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empirical+statistical+model+to+estimate+the+accuracy+of+peptide+identifications+made+by+MS%2FMS+and+database+search%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identifications made by MS/MS and database search.</a> Anal. Chem. 74, 5383-5392 (2002).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+model+for+identifying+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A statistical model for identifying proteins by tandem mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 4646-4658 (2003).</li>
</ol>

ThomasLenz, OliviaGrabner, MirkoGlinski, MathiasDreger, en HubertKosterare in dienst van caprotec bioanalytics GmbH, Inc dat sommige van de gebruikte reagentia in dit artikel oplevert.

De volgende voorzorgsmaatregelen en opmerkingen kunnen nuttig zijn bij het volgen van het beschreven protocol: a) Een groot voordeel van CCS ligt in de vorming van een covalente binding tussen de CC en de MTase, omdat dit toelaat de volgende stringente wasomstandigheden. De covalente crosslink wordt bereikt door een fotoreactie veroorzaakt door UV-licht (310 nm max.). Normale overhead licht bevat slechts een kleine fractie van de UV, echter, de bescherming van de SAH-CC van langere blootstelling aan overhead of zelfs zonlicht tot de gecontroleerde en afgekoeld bestraling in de caproBox. b) De biologische monsters waaruit de MTases moeten worden geïsoleerd bevatten eiwitten die gevoelig zijn voor denaturatie, daarom is het verplicht om de monsters koel en om te voorkomen dat schuim op alle tijden. c) De caproBox koelt de monsters naar 0-4 ° C, de lampen die zo UV-licht, echter ook warmte uitstralen. Daarom is het noodzakelijk om in het kort de vaatjes voor de bestraling, zodat eiwitten zich te houden aan de doppen of injectieflacon wanden kunnen geen neerslag zaden. d) Indien re-schorsing van het magnetische korrels (bijvoorbeeld in de wasoplossingen) is niet mogelijk met de hand, kort van toepassing echo door het plaatsen van de monsters in een ultrasoon bad. e) vers bereiden de 0,2% TFA/60% ACN-oplossing. We vonden dat anders de gevangen eiwitten niet kan worden gesplitst van de kralen. f) De uiteindelijke analyse van de gevangen eiwitten wordt uitgevoerd door LC-MS/MS. Massaspectrometrie is een zeer gevoelige methode. Het is noodzakelijk om uitsluitend LC-MS kwaliteit reagentia te gebruiken in de laatste stappen (stap 2.11 en verder). Verontreiniging van de experimenten door externe bronnen van eiwit, bijvoorbeeld keratine die afkomstig zijn van stof of van de experimentator. Vooral tijdens de laatste spijsvertering stappen, is het raadzaam om aandacht te besteden aan een schone werkplek, om handschoenen en een laboratoriumjas en eventueel een haarnet dragen of ideaal voer de laatste stappen in een schone bank. Bereid de 50 mM ammoniumbicarbonaat buffer gebruikt voor tryptische digest in LC MS kwaliteit water, filteren door middel van 0,22 urn filter, aliquoot, bewaren bij -20 ° C, en gebruiken elk aliquot slechts een keer aan verontreinigingen te voorkomen. De trypsine oplossing (sequencing rang, Roche, bereiden een 0,5 ug / ul-oplossing door het toevoegen van 1 mM HCl tot gevriesdroogde trypsine) kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken. g) Voor het verkrijgen van betrouwbare massa spectra is het essentieel te beschikken over een stabiele spray in ESI-MS/MS analyse. h) Voor andere LC-MS/MS systemen dan degene gebruikt in de huidige studie, moeten meten parameters en peptide identificatie algoritmen individueel aangepast worden. De volgende wijzigingen mogelijk zijn met betrekking tot de beschreven protocol: a) Als alternatief voor het vrijgeven van de eiwitten van de kralen met 60% ACN/0.2% TFA (stap 2.11), kunnen de eiwitten tryptically direct worden verteerd in een kraal suspensie (dezelfde volumes als in stap 5.1) of, voor SDS-PAGE, kunnen de eiwitten worden vrijgegeven door schorsing en het verwarmen van de kralen verzameld na stap 2.9 tot 95 ° C gedurende 10 min in SDS sample buffer (zowel de volledige schorsing of alleen het supernatant kan worden geladen in de gel zak). Wij vonden dat de kralen langzaam kleine hoeveelheden polymeer introductie in de waterige oplossing tryptische verteren tijdens de on-bead tryptische verteren, zelfs na een aantal waterige wassen stappen. Het polymeer besmetting interfereert met MS peptide identificatie en kunnen gewassen uit de beads met 80% ACN (minstens drie keer). Na de 80% ACN wasstappen, moet de kralen een keer worden gewassen met water voorafgaand aan de on-bead tryptische verteren. b) de Western blots met behulp van streptavidine-peroxidase horseraddish en ECL substraat kan ook gebruikt worden om succesvol verknoping van de biotine met CC te visualiseren aan de eiwitten. Daarom, ofwel de gel verkregen na stap 3.2 kan worden uitgewist of, omdat de gevoeligheid is ongeveer een factor 10 hoger dan zilverkleuring van gels, kan 10 pi monsters na stap 2.7 ook worden geanalyseerd door western blot. Let erop dat in het laatste geval endogeneously gebiotinyleerd eiwitten ook worden gedetecteerd naast de eiwitten kunstmatig gebiotinyleerde door de SAH-CC. c) We vonden dat het afhangt van de bijzondere regeling (lysaat, gericht doeleiwitten, selectiviteit en reactiviteit functie van hij CC), of de &quot;off-hiel&quot; configuratie, waar de verknopingsreactie plaatsvindt tussen vrije CC en eiwit in oplossing 4 of de thans beschreven &quot;on-bead&quot; configuratie (Figuur 1B) beter presteert. In het algemeen moet de methode ook compatibel met alle state-of-the-art stabiele isotoop eiwit of peptide labeling technologie, of de beoordeling van de capture monster door 2D-gelelektroforese. In de &quot;off-bead&quot; configuratie, is het ook mogelijk om eiwitten te vangen binnen het gehele cellen (niet-gepubliceerde resultaten). Bovendien kan het geneesmiddel of cofactor bindingsplaats van een eiwit worden geschetst door het bepalen van de close-door verknoping positie van de CC in de eiwitsequentie door MS peptide sequencing. De binding modus van een klein molecuul aan een eiwit kan worden onderzocht door het gebruik van verschillende cCHEMISCHE bevestiging functies bij de selectiviteit functie en verschillende linker lengtes. Zoals te zien is in de huidige studie, ook eiwitbinding partners van de eiwitten aangepakt door de selectiviteit functie (RplK als substraat van PrmA) of onbekende klein molecuul eiwit interacties (SAH naar GlnA) kunnen worden geïdentificeerd. Samengevat, de extra functie van de CCS, de foto-crosslinking reactiviteit, zorgt voor de isolatie en identificatie van laag overvloedige eiwitten of functionele eiwit families van complexe eiwitmengsels met een hoge gevoeligheid en biedt wetenschappers met een extra instrument voor het bestuderen van kleine molecule - eiwit interacties .

<table><tbody><tr><td>SAH caproKit&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-1010-050 (50 reacties) 1-1010-010 (10 reacties)</td><td>Bevat de SAH-CC, SAH-competitor, streptavidine-gecoate magnetische beads, opvangbuffer en wasbuffer</td></tr><tr><td>caproBox&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td><td>Voor reproduceerbare foto-activatie tijdens het koelen van de monsters</td></tr><tr><td>caproMag&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5100-001</td><td>Voor eenvoudig beheer van magnetische deeltjes zonder pipetteren</td></tr></tbody></table>

profilering van methyl-en andere s-adenosyl- l-homocysteine-bindende eiwitten door capture compound-massaspectrometrie (ccms)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Er is een verscheidenheid van benaderingen om de complexiteit van het proteoom te verminderen op basis van functionele kleine moleculen-eiwit interacties, zoals affiniteitschromatografie een of Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctionele Capture Compounds (CCS, figuur 1A) drie vormen de basis voor een generieke aanpak, waarbij de initiële evenwicht gedreven interactie tussen een klein molecuul sonde (de selectiviteit functie, hier S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, figuur 1A) en doeleiwitten is onomkeerbaar vast op foto-crosslinking tussen een onafhankelijke foto-activable reactiviteit functie (hier een phenylazide) van de CC en het oppervlak van het doel eiwitten. De sorteerfunctie (hier biotine) dient om de CC te isoleren - eiwit conjugaten van complexe biologische mengsels met behulp van een vaste fase (hier streptavidine magnetische korrels). Twee configuraties van de experimenten zijn mogelijk: &quot;off-bead&quot; 4 of de thans wordt beschreven &quot;on-bead&quot; configuratie (Figuur 1B). De selectiviteit functie kan vrijwel elke kleine molecule van belang (substraten, remmers, medicijn-moleculen) zijn. S-adenosyl-L-methionine (SAM, Figuur 1A) is waarschijnlijk, tweede tot en ATP, het meest gebruikte cofactor in de natuur 5, 6. Het wordt gebruikt als de voornaamste methylgroep donor in alle levende organismen met de chemische reactie wordt gekatalyseerd door SAM-afhankelijke-methyl (MTases), die DNA 7, 8 RNA, eiwitten 9, of kleine moleculen 10 methylaat. Gezien de cruciale rol van de methylatie reacties in diverse fysiologische scenario&#39;s (genregulatie, epigenetica, metabolisme), kan de profilering van MTases worden naar verwachting van even groot belang in functionele proteomics als de profilering van kinases. Analytische hulpmiddelen voor hun profilering, echter, zijn niet beschikbaar. We hebben onlangs een CC met SAH als selectiviteit groep deze technologische kloof (Figuur 1A) te vullen. SAH, het product van SAM na methyl overdracht, is een bekend algemeen MTase product inhibitor 11. Om deze reden en omdat de natuurlijke cofactor SAM wordt gebruikt door meer enzymen overdracht van andere delen van de cofactor of het initiëren van radicale reacties als gevolg van de chemische instabiliteit 12, SAH is een ideale functie voor selectiviteit een CC naar MTases doel. Hier melden wij het ​​nut van de SAH-CC en CCMS door profilering MTases en andere SAH-bindende eiwitten uit de stam DH5a van Escherichia coli (E. coli), een van de best gekarakteriseerd prokaryoten, die gediend heeft als de gewenste model organisme in talloze biochemische, biologische en biotechnologische studies. Foto-geactiveerde verknoping verbetert de opbrengst en de gevoeligheid van het experiment, en de specificiteit kan gemakkelijk worden getest in competitie experimenten met een overmaat aan vrije SAH.

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound met<em&gt; S</em&gt;-Adenosyl-<sub&gt; L</sub&gt;-Homocysteine-bindende als selectiviteit functie om methyl-isoleren van een<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hele cellysaat en identificeren hen door MS.

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Er bestaat een verscheidenheid aan benaderingen om de complexiteit van het proteoom te verminderen op basis van functionele interacties tussen kleine moleculen en eiwitten, zoals affiniteit ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het profileren van methyltransferases uit complexe eiwitmengsels middels capture compound massaspectrometrie of CCMS. De methyltransferases worden functioneel geïsoleerd door trifunctionele capture compounds die de algemene methyltransferase-productremmer, S-adenosyl-L-homocysteïne, SAH, dragen als selectiefunctie in de workflow; in de hier getoonde methode wordt de functionele isolatie bereikt door een cellysaat te incuberen met de capture compound om een reversibel bindingsevenwicht tot stand te brengen tussen de selectiefunctie van de capture compound en de doeleiwitten. Als tweede stap wordt het mengsel in de capra box bestraald met UV-licht.De bestralingsfoto activeert de reactiviteitsfunctie van de capture-verbinding. Dit induceert de vorming van een irreversibele covalente crosslink tussen de capture-verbinding en de doelwitproteïnen. Vervolgens worden de proteïneconjugaten van de capture-verbinding gescheiden van het lysaat, grondig gewassen, vrijgemaakt van de vaste drager en getrypticiseerd om de gevangen proteïnen te identificeren via massaspectrometrische analyse van de tryptische peptiden. De resultaten tonen de eenvoudige isolatie en identificatie van methyltransferases uit een cellysaat van Escherichia coli aan op basis van capture-verbinding massaspectrometrie.Hallo, ik ben Thomas Lentz van het CaTECH-laboratorium van de afdeling Biochemie. Ik ben Mathias Rega, ebenfalls van het CapTech-laboratorium voor Biochemie. Ik ben Mer Linsky van de afdeling analytica.Vandaag laten we u de procedure zien voor het on-bead vangen van methyltransferases uit een geëgaliseerd cellysaat. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om interacties tussen kleine moleculen en eiwitten te bestuderen. De procedure maakt de isolatie en identificatie van functionele subproteomen mogelijk, zoals kinasen, metalloproteïnasen en GTPasen, om slechts enkele te noemen.We gebruiken deze aanpak ook voor het ontdekken van drugtargets. Laten we beginnen. Voor de capture-experimenten wordt de snail L homocystine caper kit short SAH caper kit gebruikt.Deze kit bevat de SAH-vangstverbinding en vrij SAH als competitor. Daarnaast zijn er streptavidine-gecoate magnetische kralen met een diameter van één micron, een vijf keer geconcentreerde vangstbuffer en een vijf keer geconcentreerde wasbuffer inbegrepen. Gebruik verschillende buisjes van een PCR-buisjesstrip van 200 microliter om streptavidine-gecoate magnetische kralen te laden met de SAH-vangstverbinding door 50 microliters van 10 milligram per milliliter streptavidine-gecoate magnetische kralen te mengen met 25 microliters van 100 micromolaire SAH-vangstverbinding per eluaat en krachtig te mengen.Schud de resulterende suspensies twee minuten bij kamertemperatuur om de binding van het biotinemotief van de vangverbinding aan het streptavidine op het oppervlak van de magnetische kraal mogelijk te maken. Verzamel vervolgens de capra-kralen magnetisch in de doppen van de PCR-buisjes met behulp van de capra mag, verwijder het supernatant en resuspendeer de resulterende capra-kralen in 200 µL van één keer wasbuffer. Verzamel de capra-kralen opnieuw magnetisch in de doppen van de PCR-buisjesstrips en verwijder het supernatant.Sluit daarna de buisjes om uitdroging van de beads te voorkomen. Label vervolgens nieuwe buisjes voor de capture-assay en de benodigde controles, inclusief de competitiecontrole. Label buisjes voor de pull-down competitiecontrole en voor de gecombineerde capture-assay plus pull-down, en plaats de gelabelde buisjes in de koelbox om de temperatuur op 0 tot 4 °C te houden.Pipetteer vervolgens het volume milli Q water dat is berekend voor een eindreactievolume van 100 µL en 20 µL van een vijf keer geconcentreerde capture-buffer. Voeg voor elke reactie 0,26 mg E. coli DH5α whole cell lysate toe aan elke buis en meng dit voorzichtig door omkering. Voeg voor de competitiecontrole en de competitiecontrole van de pull-down 20 µL van een 10 mM SAH-competitoroplossing toe.Voeg voor de capture-assay, de pull-down en de gecombineerde capture-assay plus pull-down 20 µL milli-Q water toe in plaats van de SAH-oplossing, meng alle buisjes voorzichtig door inversie en centrifugeer kort. Suspendeer vervolgens de capra-beads in het betreffende lysaat en incubeer gedurende drie uur bij 4 °C. Houd de beads in suspensie door rotatie om de reversibele binding van SAH-bindende eiwitten aan de SAH-selectiviteitsfunctie van de SAH-capture-compound mogelijk te maken.Centrifugeer na incubatie kort en plaats de suspensies in de capra-box. Scheid de buisjes en haal de suspensies voor de pull-down en de competitiecontrole van de pull-down uit de box en plaats deze op ijs. Laat de overige suspensies staan voor de competitiecontrole van de capture-assay en de gecombineerde capture-assay.Trek bovendien het handvat van de Capra-box naar beneden om de monsters met UV-licht te bestralen terwijl ze gelijktijdig worden gekoeld. Bestraal de monsters gedurende een totale tijd van 30 minuten met bestralingsintervallen van 2,5 minuut in gesloten buisjes tussen 0 en 4 °C. Dit proces vormt een covalente cross-link tussen de reactieve functie van de SAH-captureverbinding en de SAH-bindende eiwitten.Verwijder de suspensies na een bestralingsinterval van 2,5 minuten uit de Capra-box. Koel deze ongeveer 15 seconden in ijswater en meng meerdere malen door omkering. Centrifugeer de monsters vervolgens kort om eventuele suspensie in de doppen te verwijderen en plaats ze terug in de Capra-box voor het volgende bestralingsinterval.Voeg vervolgens de suspensies voor de pull-down en de competitiecontrole van de pull-down toe; voeg 20 µL van een 10 mM SAH-oplossing toe aan de capture-assay voor de competitiecontrole, de pull-down-competitiecontrole van de pull-down en de gecombineerde capture-assay plus pull-down, en voeg 20 µL milli Q-water toe. Incubeer de suspensies 10 minuten bij 4 °C, waarbij de beads in de capture-assay in suspensie worden gehouden door rotatie. De SAH-bindende eiwitten die niet crosslinked zijn aan de SAH-capture-verbinding zullen worden verplaatst.Verzamel na incubatie de capra beads uit de suspensies met behulp van de capra mag en gooi het supernatant weg. Was de beads vervolgens door ze te resuspenderen in 200 µL van één keer wasbuffer en de beads te verzamelen via magnetische scheiding. Herhaal deze wasstap vijf keer, resuspendeer ze vervolgens in 200 µL milli Q water en verzamel de beads via magnetische scheiding.Resuspendeer de beads in 200 µL 60% acetonitril en verzamel de beads met de capri mag. Herhaal deze wasstap met acetonitril tweemaal. Pas ultrasone behandeling toe als de beads niet gemakkelijk kunnen worden geresuspendeerd.Zet vervolgens de gevangen eiwitten vrij van de beads door 200 µL vers bereid 60% acetonitril en 0,2% trifluorazijnzuur toe te voegen, gevolgd door een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur onder krachtig schudden. Pas opnieuw ultrasone trillingen toe als de beads niet gemakkelijk geresuspendeerd kunnen worden.Verzamel ten slotte de beads magnetisch en gooi deze weg. Snijd de tube-strip in losse tubes, perforeer de doppen en laat het supernatant verdampen tot het droog is. Met behulp van een centrifuge-evaporator kunnen de in dit stadium gevangen eiwitten vervolgens worden onderworpen aan SDS-PAGE of worden verwerkt voor massaspectrometrie zoals beschreven in de volgende sectie; los de van de magnetische beads vrijgekomen gevangen eiwitten op in 10 µL 50 mM ammoniumbicarbonaat.Plaats de monsters in een ultrasoonbad en vortex deze vervolgens. Voeg daarna één µL trypsin (0,5 µg/µL in 1 mM HCl) toe, centrifugeer kort en incubeer de oplossing een nacht bij 37 °C. Ontzout na de incubatie van een nacht de oplossing met de tryptische peptiden van de gevangen eiwitten met behulp van C18-materiaal, zoals 20 µL stagetips van ProxiOn Biosystems volgens de instructies van de fabrikant, en elueer de peptiden tweemaal met 10 µL van 50% methanol en 5% mierenzuur.Verdampt vervolgens het oplosmiddel met een centrifugale evaporator, zodat de gedesalteerde peptiden droog achterblijven. Los de peptiden op in 5,5 µL 0,1% mierenzuur door middel van ultrasone behandeling in een ultrasoonbad en vortexen. Analyseer ten slotte het monster via nano flow vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem-massaspectrometrie, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Gebruik voor de analyse van de MS/MS-data een algoritme voor proteïne-identificatie, zoals SEQUEST geïmplementeerd in BioWorks browser versie 3.3 0.1, SPone en X!Tandem geïmplementeerd in de Scaffold 3-software.Geautomatiseerde databasezoekopdrachten worden uitgevoerd tegen de meest recente universele kennisbank van eiwitbronnen. Swiss Pro-database gepubliceerd op www x pai. org van het onderzochte organisme.De database die voor de huidige studie is gebruikt, is een coli-stam. K12 release 57 dash 11 binnen Seaquest, waarbij geautomatiseerd database-onderzoek is ingesteld met een precursor-tolerantie van 5 ppm. Eén atomaire massaeenheid fragmention-tolerantie en volledige trypsin-specificiteit, waarbij maximaal twee gemiste splitsingen zijn toegestaan.Stel de variabele modificaties in om fosforylering op serine, threonine en tyrosine, oxidatie van methionine, deamidatie op asparagine en glutamine, acetylering op lysine en serine, formylering op lysine en methylering op arginine, lysine, serine, threonine en asparagine toe te staan. Gebruik geen vaste modificaties bij het databaseonderzoek. Laad de door Sequest gegenereerde DTA- of SRF-bestanden in de Scaffold-software (versie 3), die een waarschijnlijkheidsbeoordeling uitvoert van peptide-toewijzingen en eiwitidentificaties door Sequest- en X!Tandem-databasezoekopdrachten te combineren. Scaffold is nuttig voor het eenvoudig vergelijken, valideren en visualiseren van eiwitlijsten van meerdere monsters.Stel de parameters in de Scaffold Three-software zo in dat alleen eiwitidentificatie wordt geaccepteerd en dat resultaten als afzonderlijke hits worden gerapporteerd. Stel in dat de hits ten minste één discriminant peptide bevatten dat de waarschijnlijkheidsvalidatie heeft doorstaan. Overweeg bij de Scaffold Three-analyse alleen peptiden met een waarschijnlijkheid van 95% of meer, zoals gespecificeerd door het Peptide Prophet-algoritme binnen de software.Drie softwarepakketten stelden de eiwitidentificatiekansen voor meerdere peptide-toewijzingen in op groter dan of gelijk aan 95% volgens het protein profit-algoritme. Voor eiwitidentificaties op basis van een enkel peptide werd de eiwitkans willekeurig ingesteld op groter dan of gelijk aan 50%, waarna het overeenkomstige peptide handmatig werd geïnspecteerd. Ms ms-spectra van eiwitten die vergelijkbare peptiden bevatten en op basis van alleen Ms MS-analyse niet van elkaar kunnen worden onderscheiden, worden door de software gegroepeerd om te voldoen aan de principes van parsimonie.De geschatte false discovery rate van peptide-identificaties kan worden bepaald met de methode van de reversed protein database en moet minder dan 1% bedragen. In de capture-assay wordt een SDS-PAGE met zilverkleuring van de gevangen intacte eiwitten getoond. Na de UV-bestralingsstap werd een overmaat aan vrij SAH toegevoegd om te garanderen dat alleen eiwitten worden geïsoleerd waaraan de capture-verbinding covalent is gebonden via de fotoreactiviteitfunctie.Eiwitten werden geïdentificeerd via MS uit uitgesneden eiwitgelbanden na de Ingel Triptych Digest. Ter vergelijking toont de meest linkse baan 0,25% van het e coli DH five alpha whole cell lysaat waaruit de eiwitten in de capture assay werden geïsoleerd. Deze vergelijking benadrukt de drastische vermindering van de monstercomplexiteit die is bereikt door de capture compound technologie.De controles werden in het midden van de gel uitgevoerd en omvatten de competitiecontrole van de assay. Deze controle bevat een overmaat aan vrij SAH als competitor vóór de UVI-bestralingsstap om te voorkomen dat eiwitten binden aan de SAH-vangverbinding via de SAH-selectiviteitsfunctie. De competitiecontrole is essentieel om aspecifiek gevangen eiwitten die niet binden aan SAH te bepalen.Proteïnen die zijn geïdentificeerd in de capture-assay, maar niet in de competitiecontrole, zijn dus specifieke SAH-bindende proteïnen. Tevens is een pull-down experiment opgenomen zonder UV-bestraling en zonder toevoeging van vrij SAH.De competitiecontrole van de pull-down wordt eveneens niet bestraald, maar bevat SAH als competitor. Ten slotte wordt de gecombineerde capture assay plus pull-down UV-bestraald en is er tijdens de workflow geen vrij SAH toegevoegd. Het is duidelijk dat fotocrosslinking de opbrengst en gevoeligheid van het experiment verbetert en dat de specificiteit gemakkelijk kan worden getest in competitie-experimenten met een overmaat aan vrij SAH, in plaats van de gevangen intacte eiwitten te analyseren via SDS-page.Het volledige mengsel van gevangen eiwitten kan in één keer worden geanalyseerd middels nano-flow vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem-massaspectrometrie na een Triptych Digest. Dit is de feitelijke CCMS-benadering en is veel gevoeliger dan analyse via SDS-PAGE. METHYLTRANSFERASES en andere geselecteerde eiwitten die zijn geïdentificeerd door CCMS-experimenten worden in deze tabel weergegeven.De opgegeven getallen duiden de ongewogen peptide-spectrale telling per eiwit aan; er zijn aanzienlijk meer methyltransferasen en andere SAH-bindende eiwitten geïdentificeerd in de capture-assay vergeleken met de pull-down. De SAH-specificiteit wordt aangetoond door de vrijwel volledige afwezigheid van deze eiwitten in de competitiecontrole. Het totale aantal geïdentificeerde eiwitten in de CCMS-runs en de eiwitoverlap tussen de runs zijn getabelleerd.Het aantal eiwitten dat is geïdentificeerd met ten minste twee peptiden wordt tussen haakjes vermeld. De hoge reproduceerbaarheid van de methode kan worden afgeleid uit de aanzienlijke overlap van voornamelijk aspecifieke eiwitten tussen vergelijkbare experimenten, in het bijzonder bij de eiwitten die hier robuust zijn geïdentificeerd met ten minste twee peptiden. Venn-diagrammen beschrijven de overlap van geïdentificeerde eiwitten in de capture assay, de competitiecontrole en de pull-down, terwijl de aantallen van alle geïdentificeerde eiwitten rechts worden weergegeven met de aantallen eiwitten die met ten minste twee peptiden zijn geïdentificeerd tussen haakjes; de aantallen methyltransferases en SAH-nuclease worden links getoond.We hebben zojuist aangetoond hoe methyltransferases of andere functionele subproteomen uit E. coli-cellysaat of uit andere weefsel- of cellysaten kunnen worden geïsoleerd en geïdentificeerd middels capture compound massaspectrometrie of CCMS. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat langdurige blootstelling van de capture compound aan zichtbaar licht moet worden vermeden en dat monsters koel moeten worden gehouden. Bereid de TFA-acetonitriloplossing die wordt gebruikt om de gevangen eiwitten van de magnetische kralen te laten loskomen vers, en voorkom contaminatie van de experimenten door externe eiwitbronnen, zoals keratine afkomstig van stof of de experimentator.Daarnaast hebben we vastgesteld dat het afhangt van de specifieke opzet of de off-beat configuratie, waarbij de fotocrosslinking plaatsvindt tussen het pre-recapture compound en de eiwitten in oplossing, of de hier beschreven on-beat configuratie beter presteert. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

profiling-methyltransferases-other-s-adenosyl-l-homocysteine-binding

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

De alomtegenwoordige tweede boodschapper c-di-GMP controleert de groei en het gedrag van veel bacteriën. We hebben een nieuwe Capture Compound Mass Spectrometry-gebaseerde technologie ontwikkeld om c-di-GMP-bindende eiwitten biochemisch te identificeren en te karakteriseren in vrijwel elke bacteriesoort.

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.

Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Leer methyltransferases profileren uit complexe eiwitmengsels met behulp van Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS). Deze methode maakt isolatie en identificatie van doeleiwitten uit Escherichia coli-cellysaten mogelijk.

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl-_L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Meer video's verkennen