Toepassing van een NMDA-receptor Conductance in Rat middenhersenen dopaminerge neuronen Met behulp van de Dynamic clamp techniek

Neurowetenschappers bestuderen de functie van de hersenen door te onderzoeken hoe neuronen in de hersenen communiceren. Hier worden veranderingen in de elektrische activiteit van een enkel neuron opgewekt door het toepassen van een experimenteel gecontroleerde conductantie met behulp van de dynamische clamp-techniek. Eerst worden dunne brain slices gesneden en bewaard in een incubatiekamer gevuld met kunstmatig cerebrospinaal vocht.

Een plakje wordt vervolgens overgebracht naar een patchclamp-registratie-opstelling. Een neuron wordt geselecteerd en vervolgens gepatcht met een registratie-elektrode met behulp van een dynamische clamp-computer die is verbonden met de registratieversterker. Er wordt een NMDA-receptorconductantie in de cel aangebracht.

De resulterende opnamen tonen een burst van actiepotentialen, wat suggereert dat activatie van NMDA-receptoren één cellulair mechanisme is waardoor dopaminerge neuronen bursts kunnen genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van huidige methoden, zoals directe stroominjectie of farmacologische behandeling, is dat we in staat zijn om nauwkeurig de effecten van de activatie van een experimenteel gedefinieerde receptor op de elektrische activiteit van een levend neuron te bepalen. Na het snel extraheren van de hersenen uit een geanestheseerde Bragg dolly rat werden horizontale hersensecties van 240 micrometer gesneden met behulp van een vibratiotom.

Terwijl de coupes worden gesneden, gebruikt u een transferpipet om deze in een incubatiekamer van 32 °C te plaatsen, gevuld met kunstmatig cerebrospinaal vocht, totdat het tijd is om de registratie-experimenten uit te voeren. De opstelling voor intracellulaire registratie bestaat uit een microscoop met objectieven die zijn ingesteld voor gradiëntcontrastbeeldvorming, een monitor, een perfusiesysteem, een multi clamp 700 B-versterker, een analoog-digitaal-omzetter, een micromanipulator en een headstage. Een Mac Pro-computer draait de software voor gegevensacquisitie, Axo Graph X en multi clamp commander. Naast de opstelling voor intracellulaire registratie en de Mac Pro-computer bevindt zich een Sun Microsystems-computer die real-time Linux draait, samen met de bijbehorende analoog-digitaal-omzetter, die zal worden gebruikt voor de dynamische clamp-techniek.

De opstelling voor intracellulaire registratie moet kunstmatig cerebrospinaal vocht perfunderen bij ongeveer 35 °C. Indien het te registreren coupes horizontaal is geprepareerd, gebruik dan een transferpipet om deze in een petrischaal met kunstmatig cerebrospinaal vocht te plaatsen en halveer de coupe langs de middellijn met een snijinstrument. Gebruik vervolgens een pipet om de coupe naar de opstelling voor intracellulaire registratie over te brengen om elektrofysiologische registraties uit te voeren.

Visualiseer met het 40 x objectief het doelneuron; hier is een individueel dopaminerg neuron van de substantia nigra te zien. Let op het elliptisch gevormde soma met twee uitlopende dendrieten. Trek met een elektronische P 97 micropipet-puller elektroden met een tipweerstand van 4 tot 10 mega ohm.

Vul vervolgens een elektrode met interne oplossing met behulp van een naald van een microfill-spuit. Plaats de gevulde elektrode in de halfcel, die is verbonden met de headstage van de versterker, middels een spuit die via een kort stukje slang aan de halfcel is gekoppeld. Oefen een kleine hoeveelheid positieve druk uit op de registratie-elektrode.

Breng onder visuele begeleiding de elektrode naar het doelnervencel neer. Er zal een kuiltje zichtbaar worden op het oppervlak van de cel. Pas een kleine hoeveelheid negatieve druk toe om een giga-seal te creëren op de gewenste nervencel.

Pas mondzuiging toe om de zegeling te verbreken. Dit vormt een whole-cell registratie. Nadat de zegeling is verbroken, gebruikt u de software-interface van de multi clamp commander om de versterker in de current clamp-modus te plaatsen, waarin geen stroom kan worden geïnjecteerd.

Om een NMDA-conductantie in deze cel toe te passen, begint u met het opstarten van de RTXI-software op de dynamic clamp-computer. Laad vervolgens een op maat geschreven model met een NMDA-receptor in het geheugen. Zodra het model in het RTX-geheugen is geladen, bereken ik in realtime de stroom die in de cell moet worden geïnjecteerd met behulp van de hier getoonde vergelijking, waarbij G-N-M-D-A de gewenste conductantie is in nanosiemens, ingesteld op nul nanosiemens.

In Semens is MG standaard de magnesiumconcentratie. E-N-M-D-A is het rustpotentiaal voor de NMDA-receptor, ingesteld op nul millivolt, en VM is het membraanpotentiaal van de cel, gemeten door de versterker in millivolt. Verbind nu, met de standaard BNC-kabel, de uitgang van de dynamic clamp-computer via een analoog-digitaal converter met de command-ingang van de versterker.

Plaats de versterker in de standaard current clamp-modus ic met behulp van de Multi Clamp Commander-softwareinterface. De RTXI is zo ingesteld dat de gewenste conductantie GFT wordt ontvangen via een voltagesignaal van de Axo Graph X data-acquisitiesoftware. Hier voeren we een eenvoudig Axo Graph X-protocol uit waarbij een conductantiestap van 40 nano Siemens gedurende één seconde op de cel wordt toegepast.

Met gebruik van de in deze video beschreven opstelling wordt een burst van actiepotentialen opgewekt in reactie op de conductancestap; er werd een whole-cell somatische registratie uitgevoerd van een dopaminerg neuron in de substantia nigra pars compacta. Dopaminerge cellen vuren doorgaans spontaan met lage frequenties in een pacemaker-achtig patroon. Een burst van actiepotentialen kan worden opgewekt door fasische toepassing van een NMDA-receptorconductantie met dynamic clamp.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een NMDA-geleiding kunt toepassen op een levend dopaminerg neuron in een geïsoleerde hersenplak. Deze techniek kan echter worden gebruikt voor elk celtype dat kan worden geregistreerd met standaard elektrofysiologische technieken. Op dezelfde manier kan de dynamic clamp worden uitgebreid om de elektrische effecten van een breed scala aan receptortypen na te bootsen.

We hopen dat deze video nuttig is geweest om aan te tonen wat de dynamische clamp-techniek inhoudt en hoe wij deze in ons laboratorium gebruiken. Bedankt voor het kijken.