Name: Een allel-specifieke genexpressie Assay aan de functionele basis van genetische associaties Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Leer een allel-specifieke genexpressie-assay om de functionele basis van genetische associaties te testen met MALDI-TOF massaspectrometrie. Deze methode kwantificeert endogene genexpressieniveaus zonder moleculaire manipulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust door middel van subsidies aan APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] en een kern te gunnen aan de Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].

1) Cel Cultuur <ol><li> Selecteer cel types het gen van belang. </li><li> Selecteer cellijnen heterozygoot zowel voor DNA-risico varianten en getranscribeerd codering polymorfisme in het gen van belang (Figuur 1). </li><li> Cultuur van de geselecteerde cellijnen volgens de leverancier de specificaties en 2 x 10 cm Petrischalen voor DNA-en RNA-extractie respectievelijk voor te bereiden. </li><li> Wanneer de cellen bereiken 80% confluentie de procedure te starten om te oogsten cellen en isoleren van DNA en RNA ofwel volgens de hieronder beschreven procedure of het gebruik van commercieel verkrijgbare kits. </li></ol> 2) DNA-extractie <ol><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de schotel, wassen met PBS en voeg aan het gerecht 500 pi van een lysis-oplossing (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA en 50 ug / ml RNase A). </li><li> Schud de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Schraap de cel lysaat in een microcentrifugebuis en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. </li><li> Voeg proteinase K tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht. </li><li> Extract van het DNA met een gelijk volume fenol-chloroform pH 8, herhalen, dan extract met een gelijk volume van chloroform / isoamylalcohol. </li><li> Neerslag het DNA met 1 / 10 e deel 3 M NaCl en 2,5 volumes 100% ethanol. </li><li> Laat op ijs gedurende 5 minuten en dan draaien op 13.000 rpm gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Was de DNA met 70% ethanol, laat aan de lucht drogen en resuspendeer in 200 pi van TE. </li><li> Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten en laat gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur. </li><li> Bewaren bij 4 ° C of lange termijn bij -20 ° C. </li></ol> 3) RNA-extractie <ol><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de schotel, wassen met PBS, voeg 1 ml TRIzol en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Schraap cellen en pipetteer een paar keer, transfer in een microcentrifugebuis en incubeer gedurende 5 minuten. </li><li> Spin gedurende 10 minuten bij 10.000 rpm bij 4 ° C. </li><li> Breng het supernatans in een nieuwe buis en voeg 200 pi chloroform. </li><li> Schudden en draaien gedurende 10 minuten bij 10.000 rpm bij 4 ° C. </li><li> Breng de waterige fase in een nieuwe buis en voeg een gelijk volume van 70% ethanol. </li><li> Laad de oplossing om 1 of 2 (afhankelijk van het volume) RNeasy kolom en spin voor 30 sec op maximale snelheid. </li><li> Vanaf hier volgt u de instructies van RNeasy kit (Qiagen). </li></ol> 4) Nucleic Acid Monstervoorbereiding <ol><li> Kwantificeren DNA en RNA-concentratie met behulp van een NanoDrop Spectrofotometer (Thermo Scientific). </li><li> Bereid cDNA van 500-1000 ng van het RNA met behulp van willekeurige decamers en SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 5) PCR en Primer Extension Assay <ol><li> Ontwerp twee paar PCR-primers voor elke DNA merker, een paar voor genomische DNA-amplificatie en het andere paar voor cDNA amplificatie (afb. 2). Plaats vooruit en reverse primer voor cDNA versterking in verschillende exonen aan genomische besmetting te voorkomen. Ontwerp primer om een ​​PCR-product te verkrijgen in de range van 100-500 bp lengte. </li><li> Bereid een 10 pi PCR-reactie met 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M elke primer en 20 ng van een van beide cDNA of DNA. Versterken elk monster in vier onafhankelijke reacties. </li><li> Lopen de PCR-reactie onder de voorwaarden geoptimaliseerd voor elke primerpaar houden cyclus nummer in de lineaire fase van de versterking. </li><li> Verwijder de PCR-primer en dNTPs teveel door het incuberen van het PCR-product met exonuclease I en Garnalen alkalische fosfatase (SAP) bij 37 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Twee keer Spot elk PCR-product op een 384-wells plaat, zodat de acht metingen beschikbaar zal zijn voor elk monster. </li><li> Het ontwerp van de uitbreiding primer met de Assay Design (Sequenom) software zodat dezelfde primer gebruikt kan worden voor zowel genomische en cDNA PCR-producten. Geef primer lengte in de range van 14-18 bp en uitbreiding mix inclusief combinaties van 3ddNTPs (figuur 2). </li><li> Het uitvoeren van de primer extensie reactie en MALDI-TOF/MS analyse met behulp van de MassARRAY systeem (Sequenom) volgens de aanwijzingen van de fabrikant. </li><li> Een typische primer extensie reactie onder een beginnend stap bij 94 ° C gedurende 2 min, gevolgd door 40 cycli van 94 ° C gedurende 5 s, 52 ° C gedurende 5 s en 72 ° C gedurende 5 s. </li><li> De primer extensie producten worden gereinigd met SpectroCLEAN hars en overgebracht naar microarray (chip) door SpectroPOINT nanoliter dispenser. </li><li> De uitgebreide oligonucleotiden worden gekwantificeerd door middel van MALDI-TOF met behulp van een SpectroREADER massaspectrometer. </li></ol> 6) Statistische analyse <ol><li> Controleer MALDI-TOF/MS resultaten met de MassARRAY Typer software voor algemene kwaliteit van het experiment. </li><li> Pak de Allelotyping verslag dat de piekoppervlakken gegevens bevat. </li><li> Voor elke individuele spectrum het berekenen van deverhouding tussen het piekoppervlak van allel 1 en 2 allel (piekoppervlakte ratio). </li><li> Voor elke cDNA monster ontlenen een piekoppervlak verhouding gemiddelde en de standaardafwijking, met behulp van de overeenkomstige functie in Excel, over de acht metingen. </li><li> Leid hetzelfde betekenen piekoppervlak verhouding tussen de 8 maatvoeringen voor genomisch DNA. </li><li> Verdeel de cDNA gemiddelde verhouding door de genomische betekenen verhouding tot de afwijking van de verwachte verhouding van 1:1 te beoordelen. </li></ol> 7) Experimentele Controls <ol><li> Uit te sluiten experimentele artefacten, herhaalt het experiment ten minste drie keer. </li><li> Waar mogelijk, design assays voor extra DNA-merkers. </li><li> Ontwerp meerdere PCR primer paren en uitbreiding primers gloeien om zowel vooruit als achteruit strengen. </li><li> Waar mogelijk test als negatieve controles cellijnen die heterozygoot zijn voor DNA-merkers, maar dragen niet het risico DNA-varianten worden geassocieerd met het fenotype (figuur 1 en figuur 3.) </li></ol> 8) representatieve resultaten Een voorbeeld van allel-specifieke expressie analyse is weergegeven in figuur 3 met voorbeelden van massaspectrometrie sporen. De figuur toont de resultaten van de analyse van 4 allel-specifieke primer extension producten op vier verschillende sjablonen uitgevoerd. De bovenste grafieken geven de resultaten van de analyse van genomisch DNA van twee verschillende cellijnen, die beide heterozygoot voor een getranscribeerd codering polymorfisme. Echter, alleen cellijn A is heterozygoot voor het risico op DNA variant (figuur 1). De onderste grafieken geven de resultaten van de analyse van het cDNA gegenereerd uit dezelfde cel lijnen. Als gevolg van experimenteel artefact de eerste piek is altijd hoger dan de tweede piek zelfs in de genomische analyse. Daarom worden de resultaten van de genomische analyse wordt gebruikt om de cDNA gegevens normaliseren. Na normalisatie, het allel-ratio sterk afwijkt van een in cellijn A (waar de tweede piek lijkt lager in vergelijking met de andere spectra), terwijl het erg om een ​​dicht in cel lijn B. De gegevens suggereren dat cellijn A draagt ​​een DNA-variant, in fase met de allel gemeten door de tweede piek, die de expressie van het gen onder analyse vermindert. Cellijn B biedt een zeer gunstige negatieve controle. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Cellijn selectie-strategie. Cell lijnen A en B zijn heterozygoot voor een getranscribeerd codering marker (driehoek), maar slechts cellijn A is heterozygoot voor de risico-DNA variant (cirkel). De blauwe allel van de risico-variant wordt geassocieerd (al dan niet met een direct effect of omdat in nauwe samenhang met de feitelijke functionele variant) met een lager niveau van transcriptie. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Allel-specifieke primer extensie test. Deze figuur tonen het werk-flow van de experimentele procedure uitgevoerd voor zowel de cDNA (links) en genomische DNA (rechts) templates. PCR-primers (grijze rechthoeken) zijn ontworpen om een ​​heterozygote codering polymorfisme (driehoek) te versterken. Om te voorkomen dat verontreiniging genomische PCR-primers gloeien sequenties geplaatst in verschillende exonen (licht blauwe balken) als versterking wordt uitgevoerd op cDNA sjabloon. Het PCR-product wordt vervolgens gebruikt als template voor een primer uitbreiding reactie uitgevoerd met een uitbreiding primer, gloeien een voet naast de polymorfisme, en de juiste mix van drie dideoxynucleotide (ddNTPs) terminators (vierkantjes) en een deoxynucleotide (cirkel) uit te breiden de primer van een of twee basis respectievelijk. De resulterende primer extensie producten hebben verschillende massa's, die scheiding en kwantificering van MALDI-TOF massaspectrometrie mogelijk te maken. De hoeveelheid van het product overeenkomt met de blauwe allel van het DNA-merker relatief lager is naar de rode allel. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Resultaten van een allel-specifieke expressie assay. De figuur tonen de massaspectrometrie resultaten van de analyse op het genomische DNA uitgevoerd en het cDNA van cellijn A-en B-cellijn (figuur 1).

<ol><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li>
<li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li>
<li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li>
<li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet+Chapter%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li>
<li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li>
<li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li>
<li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li>
<li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li>
<li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319%2C+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li>
</ol>

Deze methode maakt de evaluatie van het effect van de ziekte-geassocieerde DNA-varianten op genexpressie door het beoordelen van in vivo allel-specifieke verschillen in transcript niveau. In dit protocol relatieve overvloed transcript wordt gemeten door middel van MALDI-TOF, maar andere technologieën waardoor allel-specifieke kwantificering, zoals de TaqMan 6,7, kunnen worden gebruikt. De belangrijkste beperking van deze aanpak is de beschikbaarheid van getranscribeerd codering markers. Methoden op basis van het principe hier beschreven, maar gebruik te maken van verschillende klassen van polymorfismen, zijn beschreven. De haploChip test meet allel-specifieke expressie met behulp van markers zich binnen een kb van de transcriptie begin of het einde plaats van een gen dat aanwezig zou zijn in chromatine immunogeprecipiteerd materiaal geïsoleerd met antilichamen die specifiek RNA polymerase II 8. Als alternatief kan intronische SNPs worden gebruikt wanneer de sjabloon wordt heteronucleair RNA 9. De specifieke protocol hier beschreven, in combinatie met de haploChip assay, is met succes gebruikt om een ​​kandidaat-gen voor dyslexie (of lezen handicap) te identificeren. In eerste instantie een genetische associatie studie is een DNA-sequentie in verband met dyslexie en die is verspreid over drie genen 10. Het allel-specifieke genexpressie test toonde aan dat in de aanwezigheid van de dyslexie-geassocieerde DNA-varianten uitdrukking variatie werd waargenomen bij slechts een van de drie genen, maar niet de andere twee 11.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Immolase Taq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCLEAN hars</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td><td>Sequenom</td><td></td><td>Varieert afhankelijk van het assay-ontwerp</td></tr><tr><td>MassEXTEND thermosequenase </td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Apparatuur&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroPOINT nanoliter-dispenser</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroREADER massaspectrometer</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een allel-specifieke genexpressie assay aan de functionele basis van genetische associaties test

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Het aantal significante genetische associaties met gemeenschappelijke complexe eigenschappen wordt steeds groter. Toch hebben de meeste van deze verenigingen niet begrepen op moleculair niveau. Een van de mechanismen bemiddelende het effect van de DNA-varianten op de fenotypes is genexpressie, die is aangetoond dat het bijzonder relevant voor complexe eigenschappen 1. Deze methode tests in een cellulaire context het effect van specifieke DNA-sequenties op gen expressie. Het principe is het meten van de relatieve overvloed van transcripten die voortvloeien uit de twee allelen van een gen, het analyseren van cellen die een kopie van de DNA-sequenties geassocieerd met de ziekte (het risico varianten) 2,3 dragen. Daarom moet de cellen die voor deze methode voldoet aan twee fundamentele genotypische eisen: ze moeten heterozygoot zijn voor zowel DNA-varianten het risico en voor het DNA-merkers, meestal codering polymorfismen, die kan onderscheiden transcripties op basis van hun chromosomale herkomst (figuur 1). DNA-risico varianten en DNA-merkers hoeven niet hetzelfde allel frequentie hebben, maar de fase (haplotypic) relatie van de genetische markers moet worden begrepen. Het is ook belangrijk om te kiezen celtypen die het gen van belang uit te drukken. Dit protocol verwijst specifiek naar de procedure goedgekeurd om nucleïnezuren uittreksel uit fibroblasten, maar de methode is ook toepasbaar op andere cellen te types inclusief primaire cellen. DNA en RNA worden geëxtraheerd uit de geselecteerde cellijnen en cDNA wordt gegenereerd. DNA en cDNA worden geanalyseerd met een primer extensie test, ontworpen om de coderende DNA-merkers 4 target. De primer extensie test is uitgevoerd met behulp van MassARRAY (Sequenom) 5-platform volgens de specificaties van de fabrikant. Primer extensie producten worden vervolgens geanalyseerd door matrix-assisted laser desorptie / ionisatie tijd of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS). Omdat de geselecteerde markers heterozygoot zijn ze genereren twee pieken op de MS profielen. De oppervlakte van elke piek is evenredig met de transcript overvloed en kan gemeten worden met een functie van de MassARRAY Typer software om een ​​allele-ratio (een allel: allel 2) het genereren van berekening. De allelische verhouding verkregen cDNA is genormaliseerd met behulp van dat gemeten vanaf genomisch DNA, waar de allel-ratio naar verwachting 1:01 om te corrigeren voor technische artefacten. Markers met een genormaliseerde allelische verhouding aanzienlijk anders dan een aan te geven dat de hoeveelheid transcript gegenereerd uit de twee chromosomen in dezelfde cel verschillend is, wat suggereert dat het DNA-varianten worden geassocieerd met het fenotype een effect op genexpressie hebben. Experimentele controles moeten worden gebruikt om de resultaten te bevestigen.

Genetische associaties blijven vaak onverklaarbare op een functioneel niveau. Deze methode heeft tot doel het effect van de fenotype-geassocieerde genetische markers te beoordelen op gen-expressie door het analyseren van cellen heterozygoot voor getranscribeerd SNPs. De technologie maakt het mogelijk nauwkeurig te meten door middel van MALDI-TOF massaspectrometrie om allel-specifieke primer extension producten te kwantificeren.

Een allel-specifieke genexpressie Assay aan de functionele basis van genetische associaties Test

Het aantal significante genetische associaties met veelvoorkomende complexe kenmerken neemt voortdurend toe. De meeste van deze associaties zijn echter nog niet ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om te testen of een specifieke DNA-variant, zoals een variant die geassocieerd wordt met een ziekte, effect heeft op de expressie van een specifiek gen. Dit wordt bereikt door cellijnen te selecteren die heterozygoot zijn voor zowel deze variant als een coderende snip in het gen van belang. Als tweede stap worden DNA en RNA uit de cellen geëxtraheerd en vervolgens gebruikt als template voor een allelspecifieke primary extension-reactie.Vervolgens worden de primaire extensieproducten geanalyseerd via massaspectrometrie om de relatieve abundantie van de twee allelen te kwantificeren. De resultaten laten zien of de oorspronkelijke DNA-variant die geassocieerd is met een ziekte ook geassocieerd is met een verschil in genexpressie, op basis van kwantitatieve allelspecifieke metingen via massaspectrometrie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze, in tegenstelling tot een luciferase-reportergen-assay, geen moleculaire manipulatie vereist en endogene niveaus van genexpressie meet.Bovendien zijn we in staat om de expressieniveaus tussen de twee allelen op een intern gecontroleerde manier te vergelijken, waardoor een deel van de experimentele variabiliteit wordt geëlimineerd. Deze methode helpt ons bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de menselijke genetica, zoals de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan genetische associaties. We hebben het concept voor deze methode oorspronkelijk ontwikkeld toen we een genetische associatie identificeerden die over drie genen liep en we een signaal niet konden beperken tot één enkel gen.Door middel van verdere genetische mapping. De cellen die voor deze assay worden gebruikt, moeten het gen van belang tot expressie brengen en moeten voldoen aan twee fundamentele genotypische vereisten. Ze moeten heterozygoot zijn voor zowel de met de ziekte geassocieerde DNA-sequenties als voor DNA-markers, die transcripten kunnen onderscheiden op basis van hun chromosomale oorsprong. In de hier getoonde strategie voor de selectie van cellijnen is cellijn A en B, waarbij A heterozygoot is voor een getranscribeerde coderende marker, weergegeven door driehoeken.Omnicell-lijn A is echter heterozygoot voor de DNA-sequentie die geassocieerd is met de ziekte, genaamd de risico-DNA-variant, die wordt weergegeven door cirkels. Het blauwe allel van de risicovariant is geassocieerd met een lager transcriptieniveau. Na het selecteren van de cellijncultuur, de cellen in een kolf volgens de specificaties van de leverancier — in deze demonstratie gebruiken we fibroblasten. Hoewel deze assay evenzeer toepasbaar is op andere celtypen, inclusief primaire cellen, bereid dan twee petrischalen van 10 centimeter voor, respectievelijk voor DNA- en RNA-extracties.Wanneer de cellen 80% confluentie bereiken, kunnen ze worden geoogst voor DNA- en RNA-extracties met behulp van standaardmethoden, waaronder commercieel verkrijgbare kits die geschikt zijn voor het geselecteerde celtype. Ontwerp voorafgaand aan het uitvoeren van deze assay twee paren PCR-primers voor elke DNA-marker: één paar voor genomische DNA-amplificatie en het andere voor cDNA-amplificatie. Plaats de forward- en reverse-primers voor cDNA-amplificatie in verschillende exonen om genomische contaminatie te voorkomen. Ontwerp primers om voor elke cellijn een PCR-product te verkrijgen met een lengte tussen 100 en 500 baseparen. Bereid telkens acht PCR-reacties van 80 µL voor: vier onafhankelijke reacties voor genomische DNA-amplificatie en vier onafhankelijke reacties voor cDNA-amplificatie.De mix voor de PCR-reactie bevat MLA's tack dn, NTP's, primers, magnesiumchloride en ofwel genomisch DNA of cDNA. Voer de PCR-reacties uit onder de geoptimaliseerde condities voor elk primerpaar, waarbij het aantal cycli in de lineaire fase van amplificatie wordt gehouden. Zodra de PCR-reacties zijn voltooid, worden de PCR-primers en overtollige dNTP's verwijderd door exonucleasé één en shrimp alkaline phosphatase (SAP) aan elk PCR-product toe te voegen en dit 20 minuten te incuberen bij 37 °C, gevolgd door 15 minuten bij 85 °C.Spot elk PCR-product twee keer op een 384-wells plaat, zodat er acht metingen beschikbaar zijn voor elk monster. In totaal 16 spots voor de primaire extensie-assay. Ontwerp de extensieprimer met de assay-ontwerpsoftware, zodat dezelfde primer kan worden gebruikt voor zowel genomische als cDNA-PCR-producten.Specificeer de primerlengte in het bereik van 14 tot 18 basenparen. Voer de primaire extensiereactie uit met de juiste mengeling van drie deodorinucleotide-terminatoren en één deodorinucleotide. Een typische primaire extensiereactie omvat een beginstap bij 94 °C gedurende twee minuten, gevolgd door 40 cycli van 94 °C gedurende vijf seconden, 52 °C gedurende vijf seconden en 72 °C gedurende vijf seconden.Ten slotte worden de verlengde oligonucleotiden gekwantificeerd via matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massaspectrometrie met behulp van een spectro reader massaspectrometer. Een cruciaal punt van dit protocol is het toepassen van verschillende strategieën om experimentele ruis te beheersen en artefacten uit te sluiten. Het is van groot belang om het experiment ten minste drie keer te herhalen.De beste controle voor het experiment is het gebruik van een cellijn die heterozygoot is voor de coating snip assay voor primaire extensie, maar die het met de ziekte geassocieerde allel niet draagt. Ontwerp daarnaast assays voor alternatieve DNA-getranscribeerde coderende markers. Indien deze niet beschikbaar zijn, kan een aanvullende controle worden geboden door alternatieve PCR-primerparen die gericht zijn op verschillende exonen voor de primaire extensie-assay.Een interne controle kan worden gerealiseerd door het ontwerp van extensieprimers die binden aan zowel de forward- als de reverse-streng. Een voorbeeld van alleelspecifieke expressieanalyse wordt hier getoond met voorbeelden van massaspectrometrie-sporen. Deze figuur toont de resultaten van de analyse van vier alleelspecifieke primaire extensieproducten die zijn uitgevoerd op vier verschillende templates.De bovenste twee grafieken representeren de resultaten verkregen uit de analyse van genomisch DNA van twee verschillende cellijnen, die beide heterozygoot zijn voor een getranscribeerd coderend polymorfisme. Echter is alleen cellijn A heterozygoot voor de risico-DNA-variant. Deze onderste twee grafieken representeren de resultaten verkregen uit de analyse van het cDNA dat is gegenereerd uit dezelfde cellijnen als gevolg van een experimenteel artefact.De eerste piek is altijd hoger dan de tweede piek, zelfs bij de genomische analyse. Daarom worden de resultaten van de genomische analyse gebruikt om de cDNA-gegevens te normaliseren. De statistische analyse wordt uitgevoerd door het volledige ELO-typeringsrapport te extraheren binnen de mass array-type software.Dit rapport verschaft gegevens over de piekareaal, en we tonen hier een voorbeeld met betrekking tot twee cellijnen, cel A en cel B, die heterozygoot zijn voor een coderende snip, maar waarbij alleen cel A heterozygoot is voor een marker die geassocieerd is met een ziekte. De grijs gearceerde kolommen worden direct gegenereerd door de software, terwijl de groen gearceerde kolommen handmatig zijn afgeleid voor elke cel. Er zijn acht metingen voor zowel het cDNA als het genomische DNA.De software berekent het oppervlak onder elke spectrumpiek, wat de abundantie van elk van de twee allelen vertegenwoordigt. De allelverhouding wordt berekend door het oppervlak van allel één te delen door het oppervlak van allel twee voor elk cDNA- en genomisch monster. Over de acht metingen worden een gemiddelde en een standaardfout berekend.Een hoge standaardfout groter dan 0,1 geeft aan dat de metingen niet consistent zijn en genegeerd moeten worden. Ten slotte wordt de gemiddelde ratio van het cDNA genormaliseerd met behulp van de gemiddelde ratio van het genomische DNA om de afwijking van een ratio van één te schatten, wat wordt verwacht wanneer er geen verschil is in allelspecifieke expressie. De genormaliseerde ratio wijkt af van één in cel A, maar ligt dicht bij één in cel B; de gegevens suggereren dat cellijn A een DNA-variant draagt die in fase is met het allel dat door de tweede piek wordt gemeten, wat de expressie van het geanalyseerde gen vermindert.Cellijn B biedt een zeer handige negatieve controle. Hoewel het uitvoeren van deze procedure essentieel is om informatieve genetische varianten en passende experimentele controles te definiëren, kunnen ook andere methoden worden gebruikt, zoals haplotype-specifieke chromatinimmunoprecipitatie. Dit helpt bij het beantwoorden van vragen over genetische varianten waarvoor geen getranscribeerde markers beschikbaar zijn om allelspecifieke genexpressie te analyseren.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe RNA op allelspecifieke wijze kan worden geanalyseerd en hoe dit kan worden gebruikt om genetisch belangrijke functionele varianten te begrijpen.

an-allele-specific-gene-expression-assay-to-test-functional-basis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We ontwikkelden een kwantitatieve DNA-bindende ELISA gebaseerde bepaling om transcriptiefactor interactie met DNA te meten. Hoge specificiteit voor de RUNX2 eiwit werd bereikt met een consensus DNA-herkenning oligonucleotide en specifieke monoklonale antilichaam. Colorimetrische detectie met een enzym-gekoppelde antilichaam substraat reactie werd gevolgd in real time.

Een Kwantitatieve Analyse naar Protein Studie: DNA interacties, Discover transcriptieregulatoren van genexpressie, en het identificeren van nieuwe anti-tumor Agents

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Wij bieden een gestandaardiseerd protocol voor het gebruik van gene instellen verrijking analyse van transcriptomic gegevens aan het identificeren van een ideale muismodel voor translationeel onderzoek.Dit protocol kan worden gebruikt met microarray DNA en RNA sequencing gegevens en kan worden uitgebreid tot andere omics-gegevens indien gegevens beschikbaar zijn.

Een Protocol voor het gebruik van Gene ingesteld verrijking analyse om te identificeren van de juiste diermodel voor translationeel onderzoek

Identificatie van genetische varianten bij te dragen tot complexe ziekten bij de mens laat ons toe om nieuwe mechanismen te identificeren. Hier, aantonen wij een multiplex genotypering aanpak aan kandidaat-genen of gene traject analyse die maximaliseert de dekking tegen lage kosten en is vatbaar voor cohort gebaseerde studies.

Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen

Aminozuur-niveau signal-to-noise analyse bepaalt de prevalentie van genetische variatie op de positie van een bepaald aminozuur genormaliseerd naar de genetische variatie van de achtergrond van een bepaalde populatie. Dit zorgt voor de identificatie van de variant "hotspots" binnen een eiwit-reeks (signaal) die stijgt tot boven de frequentie van de zeldzame varianten gevonden in een populatie (lawaai).

Bepaling van de waarschijnlijkheid van Variant pathogeniteit met behulp van aminozuur-niveau Signal-to-Noise analyse van genetische variatie

Dit protocol beschrijft een nieuwe rAAV-gebaseerde transient enhancer-reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om enhancer-gedreven expressie in vivo in het muizenbrein te induceren.

AAV-implementatie van enhancer-gebaseerde expressieconstructies in vivo in muizenhersenen

Het licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen. Hier presenteren we een film die gedetailleerde procedures over hoe we het gedrag van de test toont.

Licht / donker Overgang test voor Muizen

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Een demonstratie van de isolatie van neonatale muis ruggenmerg voor elektrofysiologische studies.

Spinal Cord Elektrofysiologie

Deze procedure laat zien hoe de Gene Puiser MXcell elektroporatie systeem te gebruiken om snel en gemakkelijk identificeren van de beste elektroporatie voorwaarden voor muis embryonale fibroblasten (MEF) of andere primaire cellen. Overwegingen voor het oplossen van problemen worden ook besproken in de bijbehorende video.

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Leer een allel-specifieke genexpressie-assay om de functionele basis van genetische associaties te testen met MALDI-TOF massaspectrometrie. Deze methode kwantificeert endogene genexpressieniveaus zonder moleculaire manipulatie.

Een allel-specifieke genexpressie Assay aan de functionele basis van genetische associaties Test

Meer video's verkennen