Een allel-specifieke genexpressie Assay aan de functionele basis van genetische associaties Test

Het algemene doel van het volgende experiment is om te testen of een specifieke DNA-variant, zoals een variant die geassocieerd wordt met een ziekte, effect heeft op de expressie van een specifiek gen. Dit wordt bereikt door cellijnen te selecteren die heterozygoot zijn voor zowel deze variant als een coderende snip in het gen van belang. Als tweede stap worden DNA en RNA uit de cellen geëxtraheerd en vervolgens gebruikt als template voor een allelspecifieke primary extension-reactie.

Vervolgens worden de primaire extensieproducten geanalyseerd via massaspectrometrie om de relatieve abundantie van de twee allelen te kwantificeren. De resultaten laten zien of de oorspronkelijke DNA-variant die geassocieerd is met een ziekte ook geassocieerd is met een verschil in genexpressie, op basis van kwantitatieve allelspecifieke metingen via massaspectrometrie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze, in tegenstelling tot een luciferase-reportergen-assay, geen moleculaire manipulatie vereist en endogene niveaus van genexpressie meet.

Bovendien zijn we in staat om de expressieniveaus tussen de twee allelen op een intern gecontroleerde manier te vergelijken, waardoor een deel van de experimentele variabiliteit wordt geëlimineerd. Deze methode helpt ons bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de menselijke genetica, zoals de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan genetische associaties. We hebben het concept voor deze methode oorspronkelijk ontwikkeld toen we een genetische associatie identificeerden die over drie genen liep en we een signaal niet konden beperken tot één enkel gen.

Door middel van verdere genetische mapping. De cellen die voor deze assay worden gebruikt, moeten het gen van belang tot expressie brengen en moeten voldoen aan twee fundamentele genotypische vereisten. Ze moeten heterozygoot zijn voor zowel de met de ziekte geassocieerde DNA-sequenties als voor DNA-markers, die transcripten kunnen onderscheiden op basis van hun chromosomale oorsprong. In de hier getoonde strategie voor de selectie van cellijnen is cellijn A en B, waarbij A heterozygoot is voor een getranscribeerde coderende marker, weergegeven door driehoeken.

Omnicell-lijn A is echter heterozygoot voor de DNA-sequentie die geassocieerd is met de ziekte, genaamd de risico-DNA-variant, die wordt weergegeven door cirkels. Het blauwe allel van de risicovariant is geassocieerd met een lager transcriptieniveau. Na het selecteren van de cellijncultuur, de cellen in een kolf volgens de specificaties van de leverancier — in deze demonstratie gebruiken we fibroblasten. Hoewel deze assay evenzeer toepasbaar is op andere celtypen, inclusief primaire cellen, bereid dan twee petrischalen van 10 centimeter voor, respectievelijk voor DNA- en RNA-extracties.

Wanneer de cellen 80% confluentie bereiken, kunnen ze worden geoogst voor DNA- en RNA-extracties met behulp van standaardmethoden, waaronder commercieel verkrijgbare kits die geschikt zijn voor het geselecteerde celtype. Ontwerp voorafgaand aan het uitvoeren van deze assay twee paren PCR-primers voor elke DNA-marker: één paar voor genomische DNA-amplificatie en het andere voor cDNA-amplificatie. Plaats de forward- en reverse-primers voor cDNA-amplificatie in verschillende exonen om genomische contaminatie te voorkomen. Ontwerp primers om voor elke cellijn een PCR-product te verkrijgen met een lengte tussen 100 en 500 baseparen. Bereid telkens acht PCR-reacties van 80 µL voor: vier onafhankelijke reacties voor genomische DNA-amplificatie en vier onafhankelijke reacties voor cDNA-amplificatie.

De mix voor de PCR-reactie bevat MLA's tack dn, NTP's, primers, magnesiumchloride en ofwel genomisch DNA of cDNA. Voer de PCR-reacties uit onder de geoptimaliseerde condities voor elk primerpaar, waarbij het aantal cycli in de lineaire fase van amplificatie wordt gehouden. Zodra de PCR-reacties zijn voltooid, worden de PCR-primers en overtollige dNTP's verwijderd door exonucleasé één en shrimp alkaline phosphatase (SAP) aan elk PCR-product toe te voegen en dit 20 minuten te incuberen bij 37 °C, gevolgd door 15 minuten bij 85 °C.

Spot elk PCR-product twee keer op een 384-wells plaat, zodat er acht metingen beschikbaar zijn voor elk monster. In totaal 16 spots voor de primaire extensie-assay. Ontwerp de extensieprimer met de assay-ontwerpsoftware, zodat dezelfde primer kan worden gebruikt voor zowel genomische als cDNA-PCR-producten.

Specificeer de primerlengte in het bereik van 14 tot 18 basenparen. Voer de primaire extensiereactie uit met de juiste mengeling van drie deodorinucleotide-terminatoren en één deodorinucleotide. Een typische primaire extensiereactie omvat een beginstap bij 94 °C gedurende twee minuten, gevolgd door 40 cycli van 94 °C gedurende vijf seconden, 52 °C gedurende vijf seconden en 72 °C gedurende vijf seconden.

Ten slotte worden de verlengde oligonucleotiden gekwantificeerd via matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massaspectrometrie met behulp van een spectro reader massaspectrometer. Een cruciaal punt van dit protocol is het toepassen van verschillende strategieën om experimentele ruis te beheersen en artefacten uit te sluiten. Het is van groot belang om het experiment ten minste drie keer te herhalen.

De beste controle voor het experiment is het gebruik van een cellijn die heterozygoot is voor de coating snip assay voor primaire extensie, maar die het met de ziekte geassocieerde allel niet draagt. Ontwerp daarnaast assays voor alternatieve DNA-getranscribeerde coderende markers. Indien deze niet beschikbaar zijn, kan een aanvullende controle worden geboden door alternatieve PCR-primerparen die gericht zijn op verschillende exonen voor de primaire extensie-assay.

Een interne controle kan worden gerealiseerd door het ontwerp van extensieprimers die binden aan zowel de forward- als de reverse-streng. Een voorbeeld van alleelspecifieke expressieanalyse wordt hier getoond met voorbeelden van massaspectrometrie-sporen. Deze figuur toont de resultaten van de analyse van vier alleelspecifieke primaire extensieproducten die zijn uitgevoerd op vier verschillende templates.

De bovenste twee grafieken representeren de resultaten verkregen uit de analyse van genomisch DNA van twee verschillende cellijnen, die beide heterozygoot zijn voor een getranscribeerd coderend polymorfisme. Echter is alleen cellijn A heterozygoot voor de risico-DNA-variant. Deze onderste twee grafieken representeren de resultaten verkregen uit de analyse van het cDNA dat is gegenereerd uit dezelfde cellijnen als gevolg van een experimenteel artefact.

De eerste piek is altijd hoger dan de tweede piek, zelfs bij de genomische analyse. Daarom worden de resultaten van de genomische analyse gebruikt om de cDNA-gegevens te normaliseren. De statistische analyse wordt uitgevoerd door het volledige ELO-typeringsrapport te extraheren binnen de mass array-type software.

Dit rapport verschaft gegevens over de piekareaal, en we tonen hier een voorbeeld met betrekking tot twee cellijnen, cel A en cel B, die heterozygoot zijn voor een coderende snip, maar waarbij alleen cel A heterozygoot is voor een marker die geassocieerd is met een ziekte. De grijs gearceerde kolommen worden direct gegenereerd door de software, terwijl de groen gearceerde kolommen handmatig zijn afgeleid voor elke cel. Er zijn acht metingen voor zowel het cDNA als het genomische DNA.

De software berekent het oppervlak onder elke spectrumpiek, wat de abundantie van elk van de twee allelen vertegenwoordigt. De allelverhouding wordt berekend door het oppervlak van allel één te delen door het oppervlak van allel twee voor elk cDNA- en genomisch monster. Over de acht metingen worden een gemiddelde en een standaardfout berekend.

Een hoge standaardfout groter dan 0,1 geeft aan dat de metingen niet consistent zijn en genegeerd moeten worden. Ten slotte wordt de gemiddelde ratio van het cDNA genormaliseerd met behulp van de gemiddelde ratio van het genomische DNA om de afwijking van een ratio van één te schatten, wat wordt verwacht wanneer er geen verschil is in allelspecifieke expressie. De genormaliseerde ratio wijkt af van één in cel A, maar ligt dicht bij één in cel B; de gegevens suggereren dat cellijn A een DNA-variant draagt die in fase is met het allel dat door de tweede piek wordt gemeten, wat de expressie van het geanalyseerde gen vermindert.

Cellijn B biedt een zeer handige negatieve controle. Hoewel het uitvoeren van deze procedure essentieel is om informatieve genetische varianten en passende experimentele controles te definiëren, kunnen ook andere methoden worden gebruikt, zoals haplotype-specifieke chromatinimmunoprecipitatie. Dit helpt bij het beantwoorden van vragen over genetische varianten waarvoor geen getranscribeerde markers beschikbaar zijn om allelspecifieke genexpressie te analyseren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe RNA op allelspecifieke wijze kan worden geanalyseerd en hoe dit kan worden gebruikt om genetisch belangrijke functionele varianten te begrijpen.