Behavioural Farmacologie in klassieke conditionering van de Proboscis Extension Response in Honingbijen ( Apis mellifera)

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan leren en geheugenvorming. Bij honingbijen is de eerste stap het verzamelen van vrij vliegende bijen uit hun kast. Vervolgens worden de bijen bevestigd aan plastic buisjes.

De derde stap van de procedure is het uitvoeren van klassieke conditionering. Geneesmiddelen kunnen op bepaalde tijdstippen rondom de conditionering worden geïnjecteerd om hun effect op het leren en de vorming van het geheugen te bestuderen. De laatste stap van de procedure is het testen van de geheugenretentie.

Uiteindelijk kunnen veranderingen in het gedrag na een drugbehandeling de moleculaire mechanismen onthullen die ten grondslag liggen aan het leren en de vorming van het geheugen bij honingbijen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van leren en geheugen door de moleculaire mechanismen van geheugenvorming bloot te leggen.

Over het algemeen zullen onderzoekers die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat de timing van de stimuluspresentatie tijdens de conditionering en het ophalen van herinneringen exact moet zijn. Ook het voedingsregime is kritisch. De procedure zal worden gedemonstreerd door cutting gearing en Johannes faberg aan promovendi uit mijn laboratorium. Verzamel de dag voor het experiment tussen 14:00 en 16:00 uur bijen met behulp van een UV-lichtdoorlatende plexiglaspiramide.

Zodra u terug bent in het laboratorium, plaatst u de piramide op zijn basis en bedekt u de wanden met een handdoek, waarbij de apex onbedekt blijft. Open de apex en houd een glazen vial boven de opening, zodat een enkele bij in de vial kan kruipen voordat u deze weer sluit. Herhaal deze procedure totdat alle bijen in de herfst en winter in een glazen vial zijn overgebracht.

Wanneer bijen niet buiten vliegen, wordt een bijenkorf in een net in een kas bewaard; individuele bijen worden rechtstreeks uit het net gevangen. Immobiliseer een bij in één glazen vial door de vial gedurende tweeënhalve tot drieenhalve minuut op ijs te koelen. Houd de bij nauwlettend in de gaten en haal deze van het ijs zodra deze stopt met bewegen.

Zet de geïmmobiliseerde bij vast in een klein plastic buisje met plakband. Zorg ervoor dat de bij zijn abdomen vrij kan bewegen, maar niet zijn kop, thorax of poten. Het is daarnaast belangrijk om de nek niet in te drukken.

Zodra een bij is geprepareerd, plaatst u de buis in een genummerd boorgat op een rek voor een betere hantering en identificatie.

De buisjes worden altijd in hetzelfde boorgat teruggeplaatst. Voed de bijen na het hanteren tussen 16:00 en 18:00 uur op een locatie die gescheiden is van de conditioneringsplaats. Lok de proboscis-extensierespons of PER uit door de bijen en antennes aan te raken.

Laat de bij met een sucrose-oplossing één druppel van ongeveer 4 µL SRA-oplossing consumeren. Zorg ervoor dat de antennes, de proboscis of de plastic buis van de bij niet worden besmeurd. Voed elke bij totdat ze niet langer eten.

Toon een snelle en betrouwbare PER wanneer hun antennes in contact komen met de oplossing. Voed elke bij op de daaropvolgende avonden van het experiment vier keer met één druppel sucrose-oplossing. Vul een plastic schaal van ongeveer 0,5 tot één centimeter hoog met kraanwater.

Plaats het rek met de vastgezette bijen in de schaal, waarbij lysa-platen als platform dienen. Dek de schaal af met karton en bewaar deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur. De bijen ondergaan de olfactorische conditionering rond 10:00 uur op de ochtend na de verzameling.

30 minuten voor de start van het experiment. Plaats het rek met getemde bijen vlakbij de conditioneringsplaats, maar uit de buurt van de opening van de uitlaatpijp waar de bijen getraind zullen worden. Bereid vervolgens de conditioneringsstimulus voor in een zuurkast.

Gebruik een filtertip om vier µL kruidnagelolie op een rond filterpapier te pipetteren. Plaats het geparfumeerde filterpapier in een spuit van 20 mL en voeg de zuiger in. Stel de audiospeler in die een akoestisch signaal aan de experimentator zal geven.

Dit garandeert de nauwkeurige timing van de stimulus, de start van de stimulus, het beëindigen van de stimulus, de duur en de plaatsing. Maak u klaar om het gedrag van de bij gedurende de conditionering vast te leggen. Er wordt een positieve score toegekend als de bij zijn SSIS uitstrekt tussen het begin van de conditioneringsstimulus en de presentatie van de ongeconditioneerde stimulus.

Het passeren van een virtuele lijn tussen de open mandibels. Om een acquisitieproef te starten, selecteert u de bij die getraind moet worden en plaatst u deze gedurende 10 seconden voor de uitlaat. Kort voor het einde van dit interval van tien seconden plaatst u de spuit met de geur op drie centimeter van de antennes van de bij. Presenteer de geur gedurende vijf seconden door 20 milliliters lucht door de spuit te duwen.

Na drie seconden wordt de ongeconditioneerde stimulus geïntroduceerd door met een vochtig tandenstoker met suikeroplossing de ventrale zijde van de distale flagellen van beide antennes aan te raken. Terwijl men er zorg voor draagt dat er geen oplossing op de bijen en antennes terechtkomt, krijgt de bij vervolgens de gelegenheid om aan de tandenstoker te likken. Deze samengestelde stimulus duurt vier seconden, waarna de bijen uit de trainingscontext worden verwijderd en terug in het rek worden geplaatst.

Eén trainingspoging duurt 28 seconden, waarbij de geconditioneerde stimulus 13 seconden na aanvang wordt gepresenteerd. Keer na een inter-trial interval van 10 minuten terug naar de trainingslocatie met de bij. Voer de tweede van de drie pogingen uit zoals eerder beschreven, en wacht nogmaals 10 minuten voordat de laatste koppeling wordt uitgevoerd.

Nadat de training voor die dag is voltooid, plaatst u de rekken terug in de schaal. Vergeet niet elke bij vier keer te voeden met één druppel sucrose-oplossing van 4 µL tussen 16:00 en 18:00 uur. Zoals eerder gedemonstreerd, kunnen retentietests op elk gewenst interval worden uitgevoerd, van minuten tot dagen na de training. Bereid de geheugentest voor door het rek met bijen gedurende 30 minuten nabij de conditioneerplaats te plaatsen.

Start de testen door een bij gedurende 10 seconden voor de uitlaat te plaatsen. Presenteer de conditioneringsstimulus gedurende vijf seconden en noteer het voorkomen van een PER. Plaats de rekken na voltooiing van de testen voor die dag terug in de schaal.

Vergeet niet om elke bij vier keer te voeren met één druppel van 4 µL sucroseoplossing tussen 16:00 en 18:00 uur, zoals eerder gedemonstreerd aan het einde van het volledige experiment; verifieer of de bij nog steeds in staat is om zijn proboscis uit te strekken door een antenne aan te raken met SRA-oplossing om te worden opgenomen in de analyse. Bijen moeten het volledige experiment overleven en een intact PER hebben. In sommige studies worden systemische injecties gebruikt om het effect van farmacologische interventies op het olfactorische geheugen te bestuderen. Deze injecties kunnen op verschillende tijdstippen worden toegediend, afhankelijk van het ontwerp van het experiment.

Begin met het maken van een klein gaatje in de cuticula van het achterste gedeelte van de S scootin nabij de S scootle-spleet boven de vliegspier, met behulp van een wegwerpHypodermische naald. Vul vervolgens een glazen capillaire buis met 1 µL van de te testen oplossing. Voeg de capillair in het gaatje in de cuticula in en injecteer de oplossing in de vliegspier.

Getrainde experimentatoren zijn in staat om elke 30 seconden één B te injecteren, waardoor een nauwkeurige timing van injectie en conditionering mogelijk is. Er worden hier twee experimenten gepresenteerd. Het eerste experiment onderzoekt de impact van een systemische injectie van zoutoplossing, toegediend vóór de training, op het aanleren van een geheugen.

Er zijn drie groepen in deze studie: een groep die geen behandeling ontvangt, een groep die een systemische injectie van 1 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing krijgt, of een sham-groep. Deze behandelingen werden 30 minuten vóór de training toegediend, hier links weergegeven. Het percentage dieren dat de geconditioneerde respons tijdens de acquisitie vertoonde, nam toe over de drie trainingssessies, waarbij geen verschillen tussen de groepen bestonden.

De staafdiagrammen rechts tonen aan dat noch de PBS-injectie, noch de sham-laesie invloed hadden op de geheugenretentie. 24 uur na de training in het tweede experiment werden injecties toegediend 40 minuten na de training; de bijen werden verdeeld in één groep die zoutoplossing ontving en een andere groep die één microliter van de eiwitsynthese-remmer anisomycine ontving. De staafdiagrammen rechts tonen een duidelijke afname in de geheugenretentie bij bijen die anisomycine ontvingen. Deze resultaten benadrukken het belang van eiwitsynthese bij de vorming van olfactorisch geheugen.

Na deze procedure kunnen elektrofysiologische opnamen worden gemaakt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de neurofysiologische basis is van het leren en de geheugenvorming na de ontwikkeling ervan? Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van leer- en geheugenonderzoek om de moleculaire en neurofysiologische mechanismen bij de geheugenvorming bij de honingbij te verkennen.