Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitkristallen te produceren voor röntgendiffractie-experimenten. Drie verschillende technieken voor kristalscreening worden gedemonstreerd, inclusief methoden voor dampdiffusiekristallisatie, waaronder de hanging drop en sitting drop methode, evenals microbatchkristallisatiemethoden voor dampdiffusiekristallisatie. De putjes worden gevuld met precipitant.

Vervolgens wordt een hoge concentratie van gezuiverd eiwitmonster gemengd met het precipitatiemiddel. De gemengde druppel wordt vervolgens afgesloten in een putje dat de precipitant-oplossing bevat. Microbatchkristallisatie begint met het vullen van de put met paraffine-olie.

Het eiwit wordt vervolgens in de putjes geladen, gevolgd door de precipitant-oplossing. De laatste stap van alle methoden is om het systeem te laten gelijkmaken en het verschijnen en de groei van kristallen in de druppels te volgen. Uiteindelijk kunnen kristallen worden verkregen met deze techniek en kan het eiwitdiffractiepatroon worden bepaald met behulp van een röntgenbron met een geschikte detector.

Hallo, ik ben Sal van het laboratorium van Professor Yoga Motis in de afdeling Moleculaire Biofysica en Biochemie aan de Yale-universiteit. Vandaag laten we u een procedure zien voor het kristalliseren van een gezuiverd eiwit. We gebruiken deze procedure in ons lab om de structurele basis van virale infectie te bestuderen.

Dus laten we beginnen en wat kristallen laten groeien. Om een kristallisatiemethode voor een macromolecuul naar keuze te identificeren, kunnen initiële screenings worden uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare kristallisatieoplossingen die zijn gekozen om de sparse matrix incomplete factorial-methode van proefvoorwaarden te benutten. Deze voorwaarden worden geselecteerd op basis van bekende en vaak succesvolle kristallisatievoorwaarden voor macromoleculen.

Zodra de kristallisatievoorwaarde bekend is, kan een smalle screening worden samengesteld door de concentratie van het precipitant te variëren in pH rond de oorspronkelijke hit. Gewoonlijk bestaan de kristallisatievoorwaarden die voor deze screenings worden gebruikt uit een precipitatiemiddel en een buffer om de pH in te stellen, alle stockoplossingen moeten voor deze demonstratie worden gefilterd door een 0.22 micron-filter. De eerder geïdentificeerde kristallisatievoorwaarden voor kippeneiwitlysooom worden gebruikt met natriumchloride als precipitant. Begin de procedure door een milliliter oplossingen van verschillende concentraties natriumchloride te bereiden in 0.1 molair natriumacetaat van verschillende pH's.

Thaw het eiwitmonster dat op minus 80 graden Celsius is bewaard en houd het op ijs. Typische eiwitconcentraties liggen in het bereik van vijf tot 50 milligram per milliliter, waarbij hogere concentraties meestal betere resultaten opleveren. Hier wordt een oplossing van 50 milligram per milliliter kippenlysooom in 0.02 molair natriumacetaat pH 4.9 gebruikt.

Sneldraai het monster gedurende 15 minuten bij 18.000 G en vier graden Celsius om eventueel gedeeltelijk geaggregeerd eiwit of precipitaat uit de ontdoolstap te verwijderen. Deze aggregaten kunnen interfereren met kristalgroei en bevorderen verdere aggregatie. Na centrifugatie.

Bepaal de eiwitconcentratie aan de hand van de absorptie bij 280 nanometer met behulp van een UV-spectrumfotometer. De eiwitconcentratie kan worden berekend uit de absorptiewaarde en de extinctiecoëfficiënt van het eiwit. Zodra het eiwitmonster klaar is, vult u een 24-wells hanging sitting drop kristallisatiebak met 500 microliter precipitant-oplossing volgens de bakindeling.

Maak een ring van siliconenvet rond de rand van elke put zonder de ring perfect te sluiten, zodat lucht kan ontsnappen bij het plafond van de put. Reinig de dekplaat met een sproeier met gecondenseerde lucht of een professionele doek om stof te voorkomen, wat de interpretatie van de kristallisatie-druppels zal vergemakkelijken en besmetting zal elimineren. De volgende stap is om gelijke volumes van het eiwitmonster en reservoiroplossing op de dekplaat te pipetteren.

Echter, verschillende volumes eiwit en precipitant kunnen worden geprobeerd als onderdeel van het optimalisatieproces. Het gebruik van meer eiwit dan precipitant resulteert in een nettoconcentratie van het eiwit in de geëquilibreerde druppel, wat wenselijk kan zijn voor eiwitmonsters of om de kristalnucleatie of groei te vertragen. Voor deze demonstratie worden twee microliter 50 milligram per milliliter lysozym in 0.02 molair natriumacetaat pH 4 in het midden van de dekplaat geladen, gevolgd door twee microliter kristallisatieoplossing.

Wanneer u eiwit en reservoiroplossing op de dekplaat pipetteert, wees uiterst voorzichtig om bellenvorming te voorkomen, wat vaak voorkomt wanneer lucht uit de pipet wordt geblazen. Meng de druppel voorzichtig om voortijdige eiwitprecipitatie te voorkomen als gevolg van lokaal hoge concentraties precipitant in de druppel. Menging is vooral belangrijk voor viskeuze precipitanten zoals polyethyleenglycol met behulp van pincetten. Draai de dekplaat voorzichtig om en leg deze op de vette ring bovenop de put. Voer dit op een richtingsgebonden manier uit zodat lucht uit de put kan ontsnappen.

Anders kan de lucht de dekplaat verhogen en de putverbinding compromitteren. Ga verder naar de volgende put totdat de bak is voltooid. Zodra de bak is opgezet, inspecteert u deze visueel en elimineert u stofdeeltjes en andere verontreinigingen die de valse positieve identificatie van eiwitkristallen kunnen verminderen.

Gebruik een scorekaart om het experiment te documenteren. Plaats vervolgens de bak op de gewenste incubatietemperatuur, meestal tussen vier graden Celsius en kamertemperatuur. De meest succesvolle temperatuur is 20 graden Celsius.

Wees voorzichtig en behandel de bak voorzichtig en vermijd schud- of temperatuurveranderingen tijdens overdracht of incubatie, omdat dit de kristalgroei kan voorkomen of de kristalkwaliteit negatief kan beïnvloeden. Controleer de bak de volgende dag en vervolgens om de paar dagen op kristallen, en behandel de bakken altijd voorzichtig. Documenteer eventuele bevindingen en druppelmorfologieën in een bakspecifiek scoreblad.

Kristallen duurt doorgaans twee tot vijf dagen om te verschijnen, hoewel kristallen soms bijna onmiddellijk of tot enkele maanden later verschijnen. Zodra de kristallisatievoorwaarden zijn geïdentificeerd en de groeisnelheid van de kristallen bekend is, is het het beste om de bakken ongestoord te laten totdat kristallen zijn verschenen en