Name: Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Leer stabiele isotopenprofilering van metabole flux in Caenorhabditis elegans voor niet-invasieve analyse van metabole veranderingen. Deze methode helpt onderzoekers genetische en farmacologische effecten te kwantificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd deels gefinancierd door de National Institutes of Health (K08-DK073545 en NICHD gesponsorde verstandelijke beperking Research Center New Investigator Award), The Philadelphia Foundation, en de Universiteit van Pennsylvania McCabe award (MJF), evenals de Tristan Mullen Fonds (MJF en MY). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
<li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li>
</ol>

Toepassing van massaspectrometrie voor abundantie te meten in intermediaire metabolieten biedt een prachtig gedetailleerd beeld van de kritische biochemische veranderingen 5. Hier hebben we gedetailleerde protocollen voor de exploitatie van deze zeer gevoelige en specifieke methode voor de tussenpersoon metabole flux beoordelen in het genetisch veelzijdige model van, C. elegans. Sterker nog, voeding levende dieren met een stabiele isotoop gemerkte metabole precursors (zoals 13 C-glucose) maakt nieuwe inzicht in de intermediair metabole route flux bij het ​​meten van isotopische verrijking in downstream metabolieten. We hebben betrouwbare methode om robuuste analyse van de flux te verkrijgen door middel van glycolyse, pyruvaat metabolisme en de citroenzuur-cyclus. Dit kan worden bereikt, zowel in dieren gevoed met stabiele isotopen vanaf de vroege larvale ontwikkelingsstadia of aan het begin in de post-mitotische volwassen periode. Isotopische verrijking in verschillende metaboliet soorten kunnen bestudeerd worden in combinatie met hele worm vrije aminozuren profilering van high performance liquid chromatografie, zoals eerder beschreven vier, de absolute isotopische verrijking te bepalen in verschillende soorten van vrije worm alanine, aspartaat, glutamaat en glutamine. Inderdaad, zijn consistent patroon van isotopische verrijking verkregen bij het meten van aminozuren en organische zuren analyten in hoeveelheden van 1.000 tot 2.000 jong volwassene synchroon wormen. Een dergelijke methode kan abnormale intermediair flux gevoelig discrimineren in de nucleaire gen-gebaseerde mitochondriale mutante stammen in vergelijking met wild-type wormen. Deze techniek houdt waarde flux veranderingen te onderzoeken in specifieke biochemische pathways van belang om gemeenschappelijke aangeboren stofwisselingsziekten. In het bijzonder het gebruik van glucose gelabeld met een stabiele isotoop koolstof informeert flux door de centrale metabolische wegen die van belang zijn mitochondriale ziekte. Inderdaad, onze gegevens suggereren toepassing van deze methode kan gevoelig abnormale intermediair flux discrimineren op een nucleair gen-gebaseerde mitochondriale complex III subeenheid mutante stam (isp-1 (qm150)) ten opzichte van wild-type wormen. Het is belangrijk te erkennen dat, omdat blootstelling aan isotopen is voltooid over een periode van een tot enkele dagen, gekwantificeerd isotopische verrijking is een &quot;steady state&quot; verrijking waarde in plaats van meetbare flux gedurende een bepaalde periode als zou kunnen worden bepaald in cel-gebaseerde modellen blootgesteld aan isotoop voor een periode van minuten tot uren. Een andere mogelijke beperking van ondervragen pad flux in de loop van de nematode ontwikkeling heeft betrekking op verschillende lengtes van larvale ontwikkeling die zich voordoen in het bijzonder mutante stammen. Bijvoorbeeld, zijn vele ernstige mitochondriale mutaties bekend te arresteren veroorzaken op de derde (L3) larvale stadium 6. Zo kan de analyse van isotopen incorporatie alleen bij dieren die overleven tot volwassen leeftijd niet representatief voor de gehele bevolking mutant. Zou echter kunnen deze methodiek worden aangepast aan isotoop opname te beoordelen in intermediaire metabolieten op een bepaalde larvale stadium (zoals L2) in plaats van te wachten voor de dieren om het volwassen stadium te bereiken. Zo hebben dieren die het alternatieve larvale stadium bekend als Dauer waarschijnlijk gaan significant veranderd (waarschijnlijk lager) metabole flux ten opzichte van dieren die direct doorgaan door de vier larvale stadia. Toekomstig onderzoek kan ook worden uitgevoerd om isotoop opname rechtstreeks te beoordelen in Dauer stadium dieren van verschillende genetische achtergronden. Blootstellen van dieren stabiele isotoop voor een vaste periode (hier 24 tot 48 uur) begint zodra dieren bereikte de jonge volwassen stadium (zoals beschreven in Protocol B) wordt het effect van de variabele ontwikkeling periodes. Terwijl de 13 C-glucose alleen ondervraagt ​​glycolyse, pyruvaat metabolisme en tricarbonzuur cyclus flux, kunnen andere isotopen tracers mogelijk worden beoordeeld om biochemische route flux ondervragen via andere routes van interesse in nematoden. Bijvoorbeeld, 15 N-glycine worden gebruikt om aminozuur omzet in nematoden te beoordelen. Een andere mogelijke beperking van deze aanpak is het niveau van de gevoeligheid van de metaboliet detectie. Onze ervaring suggereert een minimum van 500 jonge volwassen aaltjes nodig zijn om isotopen integratie succesvol te kwantificeren door de HPLC en GC / MS-methoden hier werkzaam. Gebruik van instrumenten met een grotere gevoeligheid, zoals de ultra performance vloeistofchromatografie (UPLC), toestaan ​​dat verdere verlaging van de onderzochte dier-nummer, ook al verwachten we dit waarschijnlijk om een ​​betrouwbare kwantificering van metabolieten en isotopische integratie mogelijk te maken in de metaboliet soorten uit enkele wormen. We bestudeerden worm populaties van 1.000 dieren per experiment, dat vonden we om een ​​betrouwbare lage abundantie metabolieten te detecteren in elke stam. Echter, sommige metabolieten, zoals GABA, alleen betrouwbaar worden gekwantificeerd in veel grotere populaties van nematoden, in de orde van1x10 6 dieren 4. Samengevat, stabiele isotoop profilering zorgt voor een niet-invasieve en veilige (niet-radioactief) benadering die al lang gebruikt om aangeboren stofwisselingsziekten te bestuderen. De toepassing van deze methodologie op C. elegans biedt de nieuwe capaciteit te onderzoeken in vivo, real-time, metabole veranderingen die zich voordoen op het gehele dier niveau, dat kan het gevolg zijn van individuele genetische aandoeningen en / of farmacologisch middel blootstelling.

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - pagina 59</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protocol B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protocollen A en C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protocol B</td></tr><tr><td>NGM-agar</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>Protocollen A, B en C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glucose (universeel gelabeld)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protocollen A en C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glucose (1,6 gelabeld)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protocol B</td></tr><tr><td>60% Perchloorzuur (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-aminocaproïnezuur (interne standaard)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protocol E</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protocol E</td></tr><tr><td>AG 1-X8, 100-200, hars in chloridevorm</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protocollen A en B (extractie van organische zuren)</td></tr><tr><td>AG 50W-X8, 100-200, hars in waterstofvorm</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protocollen A en B (extractie van aminozuren)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protocol C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protocol C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocol A</td></tr><tr><td>0,1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>Gedeïoniseerd water</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>Helium</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protocol C2</td></tr><tr><td>SMZ-800 Zoom stereo-microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protocollen A, B en C</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>Tafelcentrifuge - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>Geïncubeerde platformschudder</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protocol B</td></tr><tr><td>Mini LabRoller rotator</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>Stampertjes</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>Boor</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>1 L glazen bekerglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>1 L Erlenmeyerkolven</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Erlenmeyerkolven</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protocol B</td></tr><tr><td>7 ml glazen buisjes met ronde bodem + rubberen stop</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protocollen A, B en C1,C2</td></tr><tr><td>10 ml glazen buisjes met ronde bodem + rubberen stop</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protocol C2</td></tr><tr><td>Buisjes met blauwe dop</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische plastic buisjes</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Alle protocollen</td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protocollen A en B</td></tr><tr><td>Spuiten (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protocollen C1 en C2</td></tr><tr><td>25 gauge naalden</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protocollen C1 en C2</td></tr><tr><td>Poly-Prep chromatografiekolommen</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>60 mm petrischalen</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protocol C</td></tr><tr><td>Glazen kamer (onderkant van 1 L kolf afgesneden) voorzien van vet-afgedichte 3-weg stopkraan</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Protocol C</td></tr><tr><td>Optisch transparante glasplaat</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Protocol C</td></tr><tr><td>Reacti-Vap III evaporator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>Katoen</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>Hoogvacuümvet</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protocol C1</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protocol B</td></tr><tr><td>Timer</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protocol C</td></tr><tr><td>Gas-ratio massaspectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protocol D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protocol D</td></tr></tbody></table>

stabiele isotopen profilering van intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium caenorhabditis elegans</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabiele isotopen profilering is al lang toegestaan ​​gevoelige onderzoeken van de metabole gevolgen van genetische mutaties en / of farmacologische behandelingen in cellulaire en zoogdieren modellen. We beschrijven hier gedetailleerde methoden om stabiele isotopen profilering van intermediaire metabolisme en metabole flux uit te voeren in de nematode, Caenorhabditis elegans. Methoden beschreven voor het profileren van hele worm vrije aminozuren, gelabeld koolstofdioxide, gemerkt organische zuren, en gelabeld aminozuren in de dieren blootgesteld aan stabiele isotopen, hetzij vanaf de vroege ontwikkeling op nematode groeimedia agar platen of begin als jonge volwassenen maar blootgesteld aan diverse farmacologische behandelingen in vloeibare cultuur. Vrije aminozuren worden gekwantificeerd door de hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) geheel worm porties gewonnen in 4% perchloorzuur. Universeel label 13 C-glucose of 1,6 - 13 C 2-glucose wordt gebruikt als de stabiele isotopen voorloper van wie het label koolstof wordt opgespoord door middel van massaspectrometrie in koolstofdioxide (zowel atmosferische en opgelost), alsmede in metabolieten indicatie van de flux door de glycolyse , pyruvaat metabolisme, en de citroenzuur-cyclus. Representatieve resultaten zijn opgenomen om effecten van de isotoop belichtingstijd, verschillende bacteriële clearing protocollen, en alternatieve worm verstoring methoden aan te tonen in wild-type nematoden, evenals de relatieve omvang van isotopische incorporatie in het mitochondriale complex III mutant wormen (isp-1 (qm150) ) ten opzichte van wild-type wormen. Toepassing van stabiele isotopen profilering in het leven nematoden biedt een nieuwe mogelijkheid om te onderzoeken op het hele dier niveau real-time metabole veranderingen die veroorzaakt worden door individuele genetische stoornissen en / of farmacologische therapieën.

Stabiel isotopische profilering door middel van gaschromatografie massaspectrometrische analyse van intermediaire metabole flux wordt beschreven in de nematode,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Methoden worden voor het beoordelen van isotopen verrijking in kooldioxide, organische zuren en aminozuren na isotoop blootstelling zowel tijdens de ontwikkeling op agar platen of tijdens de volwassenheid in vloeibare cultuur.

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans</em

Stabiele isotopenprofilering maakt al lange tijd gevoelige onderzoeken mogelijk naar de metabole gevolgen van genetische mutaties en/of farmacologische therapieën in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om op niet-invasieve wijze in real-time metabole veranderingen op het niveau van het hele dier te monitoren binnen de glycolyse, het pyruvaatmetabolisme en de tricarboxylzuurcyclus, die worden veroorzaakt door individuele metabole routes, genetische veranderingen en/of farmacologische behandelingen. Dit wordt bereikt door levende nematoden stabiele isotopen te voeren om voldoende isotopische verrijking in meerdere metabolieten te verkrijgen, waardoor kwantificering van genetische en/of farmacologische veranderingen in intermediaire metabole routes mogelijk wordt. Als tweede stap wordt de isotopische incorporatie in atmosferische en opgeloste koolstofdioxide gemeten via gas ratio massaspectrometrie, wat een directere beoordeling geeft van de intermediaire metabole flux over korte tijdsperioden.Vervolgens worden monsters verwerkt voor de analyse van vrije aminozuren in de gehele worm met behulp van HPLC, alsofwel voor isotopische verrijking van aminozuren en organische zuren via GCMS, om veranderingen in de metabole flux in nematoden te kwantificeren. Na blootstelling aan stabiele isotopen worden resultaten verkregen die de effecten tonen van variabele blootstellingsduren van isotopen, bacteriële reiniging en alternatieve wormdisruptie in wildtype wormen om de isotopische abundantie in intermediaire metabolieten te onderzoeken. Deze methode kan inzicht bieden in het intermediaire metabolisme.Het kan ook worden toegepast op onze systemen, zoals zoogdiercellijnen en weefsels. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we consistente afwijkingen zagen in de analyse van vrije aminozuren in wormen via HPLC, die wezen op een verminderde intermediaire metabole flux in primaire respiratoire functiewijzigingen. Om deze procedure te starten.Wormen die tijdens de ontwikkeling of in volwassen staat zijn blootgesteld aan een met een stabiele isotoop gelabelde metabolische precursor, worden verzameld in een centrifugebuis van 1,5 milliliter van kunststof. Normaal gesproken verdunnen we de wormen tot een concentratie van 1000 wormen per één milliliter. Voeg 60% perchloorzuur met epsilon-aminocaproïnerzuur als interne standaard toe aan de wormen tot een eindconcentratie van 4% perchloorzuur en 20 nanomolar interne standaard.Laat de worm vijf minuten bezinken door zwaartekracht, verwijder vervolgens het supernatant en bewaar dit in een andere buis. De volgende stap is een van de meest kritische aspecten van deze procedure. De wormen moeten volledig worden gedisrumpeerd door zeizing voor de analyse van vrije metabolieten. Maal de wormmonsters 15 seconden lang met een plastic homogenisator en een gemotoriseerde boor.Bevestig de disruptie van de wormen visueel via lichtmicroscopie en herhaal het malen indien nodig. Op deze afbeelding tonen panelen A en B de wormen vóór het malen. In tegenstelling tot panelen C en D, die de wormen na het malen tonen, wordt het eerder bewaarde supernatant overgebracht naar de 1,5 milliliter plastic centrifugebuizen met het wormhomogenaat centrifuge.Centrifugeer de monsters bij 2.250 RPM (1300 Gs) gedurende vijf minuten. Breng na centrifugatie het supernatant over naar een schone glazen buis van zeven milliliter. Bewaar het pellet voor later gebruik in een proteïneconcentratie-assay.Voeg nu vier normale kaliumhydroxide toe aan de SUPERNAT tot de pH-waarde van de monsters tussen zeven en acht ligt. Centrifugeer de geneutraliseerde monsters in de glazen buisjes van zeven milliliter bij 2.250 RPM (1300 Gs) gedurende vijf minuten. Om zouten te verwijderen, wordt het supernatant van elk monster overgebracht naar een nieuw glazen buisje van zeven milliliter. De geneutraliseerde monsters kunnen nu worden voorbereid voor metabolietkwantificering via high performance liquid chromatography (HPLC) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GCMS).Scheid 50 µL van elk geneutraliseerd monster af voor directe injectie in de HPLC. De kwantificering van vrije aminozuren wordt uitgevoerd met precal-derivatisering met een aldehyde en fluorescentiedetectie. Zoals eerder beschreven, zullen de resterende geneutraliseerde monsters worden geëxtraheerd met een ionenuitwisselingshars voor GCMS om de isotopische verrijking in aminozuren en organische zuren te bepalen, zoals weergegeven in de volgende sectie.Om de kralen voor te bereiden, voegt u een normale zoutzuuroplossing afzonderlijk toe aan G1- en G50-kralen. Roer elke kolf gedurende 30 minuten in bekerglazen van één liter met een magnetische roerder. Was de kralen daarna 10 keer met gedeïoniseerd water totdat de pH van het waswater gelijk is aan de pH van het water.Vervolgens tonen we onze methode voor het bereiden van op maat gemaakte, goedkope kolommen met glazen pipetten. Kant-en-klare kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar. Om een kolom voor te bereiden, gebruikt u een pincet om een wattenprop net boven het smalste deel van een Pasteur-pipettespits te plaatsen; gebruik G-1 beads voor extractie van organische zuren en G-50 beads.Vul voor de extractie van aminozuren elke kolom tot ongeveer een derde van de kolomhoogte. Als een monster al een neutrale pH heeft, wordt er niets aan het monster toegevoegd voordat het op de AG 1-kolom wordt aangebracht. Om organische zuren te extraheren ter extractie van aminozuren, voegt u één milliliter 0,1 normaal zoutzuur toe aan het monster voordat het op de AG 50-kolom wordt aangebracht.Breng nu de eerder voorbereide geneutraliseerde monsters aan op elke kolom. Was elke kolom 10 keer met water tot de wasvloeistoffen neutraal zijn. Elueer na voltooiing van het wassen elke kolom in schone, gelabelde glazen monsterbuisjes van vier milliliter. Voeg voor de extractie van organische zuren drie milliliter drie normaal zoutzuur toe aan de AG 1-kolom.Dit maakt analyse van isotopenverrijking in het totale aantal gelabelde koolstoffen mogelijk tussen drie koolstofsoorten, vier koolstofsoorten, vijf koolstofsoorten en zes koolstofsoorten. Voeg voor de extractie van aminozuren drie milliliters vier normaal ammoniumhydroxide toe aan een G 50-kolom. Dit maakt analyse van isotopenverrijking in het totale aantal gelabelde koolstoffen mogelijk tussen drie koolstofsoorten en vijf koolstofsoorten.Nadat zowel de extracties van organische zuren als van aminozuren zijn voltooid, worden de monsterbuisjes gedurende de nacht in een reactive app three verdamper geplaatst totdat ze droog zijn. De monsters worden vervolgens gedereiveerd en geanalyseerd via GCMS, zoals gedetailleerd in de tekst van het protocol. Begin deze procedure door duizend jonge volwassen wormen over te brengen naar een experimentele 35 millimeter NGM-agarplaat die universeel gelabelde koolstof 13 glucose en e coli bevat.Plaats vervolgens de experimentele NGM-plaat zonder deksel in een op maat gemaakte glazen kamer, voorzien van een goed afgesloten driewegkraan om nauwkeurige bemonstering en vervanging van de atmosfeer mogelijk te maken. Smeer de afdichting waar de optisch transparante glazen schijf op de plaat rust in met hoogvacuümvet.Sluit de kamer af met de glazen schijf. Noteer de tijd. Beschouw dit als tijd nul; gebruik vervolgens 30 minuten later een spuit van 20 milliliter om 10 milliliter van de atmosfeer uit de glazen kamer af te nemen via de driewegkraan.Sluit de stopkraan naar de kamer. Breng na het bemonsteren de monstername over naar een vacuümglasbuis met rode dop die één milliliter natriumbicarbonaat in 0,1 molair natriumhydroxide bevat. Spuit vervolgens 10 milliliters lucht via de driewegstopkraan in de glazen kamer. Gebruik een spuit van 20 milliliters en sluit de stopkraan naar de kamer. Herhaal na het opnieuw injecteren van de atmosfeer en vóór het hervatten van de incubatie de bemonstering van de atmosfeer uit de glazen kamer na 60, 90 en 120 minuten.Analyseer deze atmosferische kooldioxide-monsters op verrijking met gelabelde koolstof met behulp van een gasratio-massaspectrometer zoals beschreven in de tekst van het protocol; stabiele isotopen zijn na twee uur goed opgenomen in jonge volwassen wormen, zoals hier aangetoond door de gemeten gelabelde koolstof in atmosferische kooldioxide en opgeloste worm-kooldioxide in wormen die gevoed zijn met levende of UV-bestraalde gedode OP 50 e coli. De ratio van koolstof-13 kooldioxide ten opzichte van koolstof-12 kooldioxide was groter in de fractie van de opgeloste worm-kooldioxide vergeleken met de vrijgegeven atmosferische kooldioxide. Er werd waargenomen dat langdurige blootstelling aan een stabiel isotoop vanaf het larvale stadium, gevolgd door het schoonmaken van de wormen op NGM-agar zonder bacteriën, leidde tot een verhoogde isotopische verrijking van vrij glutamaat in jonge volwassen wormen.In deze grafiek stelt L1 de wormen voor die vanaf het L1-larvale stadium tot het 959-cel jongvolwassen stadium zijn gevoed met universeel gelabelde koolstof 13-glucose en OP50-bacteriën; YA stelt de wormen voor die gedurende 48 uur zijn gevoed met koolstof 13-glucose en OP50-bacteriën, beginnend vanaf de eerste dag van de eiafzetting in het jongvolwassen stadium. De x-as geeft het totale aantal gelabelde koolstofatomen in elke glutamaatsoort aan, en de y-as geeft het percentage verrijking aan. Alle dieren werden vrijgemaakt van overtollig isotopisch label voorafgaand aan de verdere monsterbereiding.Voor GCMS-analyses geven de groene balken wormen aan die zijn schoongemaakt na isotopische blootstelling door twee uur lang voeding met OP 50 E. coli op NGM-platen voorafgaand aan PCA-extractie. De blauwe en grijze balken geven wormen aan die zijn schoongemaakt na isotopische blootstelling op NGM-platen zonder bacteriën gedurende respectievelijk twee of zes uur voorafgaand aan PCA-extractie, ongeacht het tijdsverloop van de isotopische blootstelling. Er werd geen significant verschil in isotopische verrijking in intermediaire metabolieten waargenomen wanneer dieren gedurende twee of zes uur op platen werden schoongemaakt.In beide isotopische blootstellingsreeksen werd een lagere isotopische verrijking waargenomen in intermediaire metabolieten wanneer de dieren gedurende twee uur werden gereinigd door het voeren van niet-gelabelde bacteriën. Daarom is het optimale reinigingsprotocol voor wormen die zijn gekweekt op NGM-platen met bacteriële uitstrijk en isotoop vastgesteld als reiniging gedurende twee uur op niet-uitgestreken NGM-platen, om het verrijkingspercentage in intermediaire metabolieten te optimaliseren. Na een behandeling van 24 uur in vloeibare cultuur met één zes koolstof 13 glucose zonder bacteriën.Een vergelijking werd gemaakt van wormmonsters die uitsluitend door sonicatie of door sonicatie in combinatie met malen waren gedisrumpteerd, zoals weergegeven in deze figuur. Wormen die door sonicatie en malen waren gedisrumpteerd, vertoonden een grotere isotopische verrijking dan monsters die alleen door sonicatie waren gedisrumpteerd; uiteindelijk werden levende wormen gevoed met een stabiele isotopische precursor, ofwel tijdens de ontwikkeling vanaf het L1-stadium op platen, of beginnend op de eerste dag van de eiafscheiding als jonge volwassenen gedurende 24 uur in vloeibare cultuur. Dit maakt gevoelige analyse mogelijk van de isotopische verrijking onder metabolieten die indicatief zijn voor de flux via glycolyse en pyruvaatmetabolisme in de tricarboxyliczuurcyclus na de ontwikkeling.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoek naar mitochondriale ziekten om de intermediaire metabole flux in Caenorhabditis elegans te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van stabiele isotopenprofilering van het intermediaire metabolisme en de metabole flux in de nematode C. elegans.

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Het vetzuur trofische marker aanpak, dat wil zeggen, de assimilatie van vetzuren als hele molecuul en transfer in consument weefsel met geen of een kleine wijziging, wordt gehinderd door lacunes in de kennis in de vetzuurstofwisseling van kleine bodem-ongewervelde dieren. Isotopologue profilering wordt geleverd als een waardevol instrument te ontwarren trofische interacties.

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Leer stabiele isotopenprofilering van metabole flux in Caenorhabditis elegans voor niet-invasieve analyse van metabole veranderingen. Deze methode helpt onderzoekers genetische en farmacologische effecten te kwantificeren.

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen