Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van het volgende experiment is om op niet-invasieve wijze real-time metabole veranderingen op het niveau van het gehele dier te monitoren binnen de glycolyse, het pyruvaatmetabolisme en de tricarboxylzuurcyclus, die worden veroorzaakt door individuele metabole routes, genetische alteraties en/of farmacologische behandelingen. Dit wordt bereikt door levende nematoden stabiele isotopen toe te dienen om een voldoende isotopische verrijking in meer metabolieten te verkrijgen, zodat kwantificering van genetische en/of farmacologische veranderingen in intermediaire metabole routes mogelijk is. Als tweede stap wordt de isotopische incorporatie in atmosferisch en opgelost koolstofdioxide gemeten via gasratio-massaspectrometrie, wat een directere beoordeling geeft van de intermediaire metabole flux over korte tijdsperioden.

Vervolgens worden de monsters verwerkt voor de analyse van vrije aminozuren in de gehele worm met behulp van HPLC, alsofijnaar voor isotoopverrijking in aminozuren en organische zuren via GCMS, om veranderingen in de metabole flux bij nematoden te kwantificeren. Na blootstelling aan stabiele isotopen worden resultaten verkregen die de effecten laten zien van variërende blootstellingsduuren aan isotopen, bacteriële reiniging en alternatieve disruptie van de worm bij wild-type wormen om de isotoopovervloed in intermediaire metabolieten te onderzoeken. Deze methode kan inzicht bieden in het intermediaire metabolisme.

Het kan ook worden toegepast op onze systemen, zoals zoogdiercellijnen en weefsels. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we consistente abnormaliteiten waarnamen in de analyse van vrije aminozuren in wormen via HPLC, die wezen op een verminderde intermediaire metabole flux bij primaire respiratoire functieveranderingen. Om deze procedure te starten.

Wormen die tijdens de ontwikkeling of in volwassen leeftijd zijn blootgesteld aan een met een stabiel isotoop gemarkeerde metabolische precursor, worden verzameld in een centrifugebuisje van 1,5 milliliter van kunststof. Gewoonlijk verdunnen we de wormen tot een concentratie van 1000 wormen per één milliliter. Voeg perchloorzuur van 60% met epsilon-aminocapronzuur als interne standaard toe aan de wormen tot een eindconcentratie van 4% perchloorzuur en 20 nanomolar interne standaard.

Laat de worm vijf minuten lang door zwaartekracht bezinken, verwijder vervolgens het supernatant en bewaar dit in een andere buis. De volgende stap is een van de meest kritische aspecten van deze procedure. De wormen moeten volledig worden gedisrumpeerd door screening voorafgaand aan de analyse van vrije metabolieten. Maal de wormmonsters 15 seconden lang met een plastic homogenisator en een gemotoriseerde boor.

Bevestig visueel de disruptie van de wormen via lichtmicroscopie en herhaal het malen indien nodig. In deze afbeelding tonen panelen A en B wormen vóór het malen. In tegenstelling tot panelen C en D, die wormen na het malen tonen, wordt het eerder bewaarde supernatant overgebracht naar de 1,5 milliliter plastic centrifugebuisjes met het wormhomogenaatcentrifuge.

Centrifugeer de monsters bij 2.250 RPM en 1300 G gedurende vijf minuten. Breng na centrifugatie het supernatant over naar een schone glazen buis van zeven milliliter. Bewaar het pellet voor later gebruik in een proteïneconcentratie-assay.

Voeg nu vier normale kaliumhydroxide toe aan het SUPERNAT tot de pH-waarde van de monsters tussen zeven en acht ligt. Centrifugeer de geneutraliseerde monsters in de glazen buisjes van zeven milliliter bij 2.250 RPM (1300 G) gedurende vijf minuten. Om zouten te verwijderen, wordt het supernatant van elk monster overgebracht naar een nieuw glazen buisje van zeven milliliter. De geneutraliseerde monsters kunnen nu worden voorbereid voor metabolietkwantificering via hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GCMS). Voor HPLC.

Scheid 50 µL van elk geneutraliseerd monster af voor directe injectie in de HPLC. De kwantificering van vrije aminozuren wordt uitgevoerd met behulp van precal-derivatisering met een aldehyde en fluorescentiedetectie. Zoals eerder beschreven, zullen de resterende geneutraliseerde monsters worden geëxtraheerd met een ionenwisselingshars voor GCMS om de isotopische verrijking in aminozuren en organische zuren te bepalen, zoals weergegeven in de volgende sectie.

Om de kralen voor te bereiden, voegt u normaal zoutzuur afzonderlijk toe aan G1- en G50-kralen. Roer elk bekerglas van één liter gedurende 30 minuten met een magnetische roerder. Was de kralen daarna 10 keer met gedeïoniseerd water, totdat de pH van het waswater gelijk is aan de pH van het water.

Vervolgens tonen we onze methode voor het bereiden van op maat gemaakte, goedkope kolommen met behulp van glazen pipetten. Kant-en-klare kolommen zijn ook commercieel verkrijgbaar. Om een kolom voor te bereiden, gebruikt u een pincet om een wattenprop net boven het nauwste deel van een Pasteur-pipetpunt te plaatsen; gebruik G 1 beads voor extractie van organische zuren en G 50 beads.

Vul voor de extractie van aminozuren elke kolom tot ongeveer een derde van de kolomhoogte. Als een monster al een neutrale pH heeft, wordt er niets aan het monster toegevoegd voordat het op de AG one-kolom wordt aangebracht. Voeg voor de extractie van organische zuren om aminozuren te extraheren één milliliter 0,1 normaal zoutzuur toe aan het monster voordat het op de AG 50-kolom wordt aangebracht.

Breng nu de eerder voorbereide geneutraliseerde monsters aan op elke kolom. Was elke kolom 10 keer met water totdat de wassingen neutraal zijn. Nadat het wassen is voltooid, elueer elke kolom in verse, gelabelde glazen monsterbuisjes van vier milliliter. Voeg voor de extractie van organische zuren drie milliliter drie normale zoutzuur toe aan de AG one kolom.

Dit maakt analyse mogelijk van de isotopenverrijking in het totaal aantal gelabelde koolstofatomen tussen drie koolstofspecies, vier koolstofspecies, vijf koolstofspecies en zes koolstofspecies. Voeg voor de extractie van aminozuren drie milliliter vier normaal ammoniumhydroxide toe aan een G 50-kolom. Dit maakt analyse mogelijk van de isotopenverrijking in het totaal aantal gelabelde koolstofatomen tussen drie koolstofspecies en vijf koolstofspecies.

Nadat zowel de extracties van organische zuren als van aminozuren zijn voltooid, plaatst u de monsterbuisjes gedurende de nacht in een reactieve app drie verdamper totdat ze droog zijn. De monsters worden vervolgens gedervatiseerd en geanalyseerd via GCMS, zoals gedetailleerd in de tekst van het protocol. Begin deze procedure door duizend jonge volwassen wormen over te brengen naar een experimentele NGM-agarplaat van 35 millimeter die universeel gelabelde koolstof 13 glucose en e coli bevat.

Plaats vervolgens de experimentele NGM-plaat zonder deksel. Gebruik hiervoor een op maat gemaakte glazen kamer, voorzien van een goed afgedichte driewegkraan om nauwkeurige atmosferische bemonstering en vervanging mogelijk te maken. Smeer de afdichting waar de optisch transparante glazen schijf op de plaat rust in met hoogvacuümvet.

Sluit de kamer af met de glazen schijf. Noteer het tijdstip. Gebruik 30 minuten na tijd nul een spuit van 20 milliliter om 10 milliliter van de atmosfeer uit de glazen kamer te bemonsteren via de driewegkraan.

Sluit de stopkraan naar de kamer. Breng na het bemonsteren het monster over in een vacuüm glazen buis met rode dop die één milliliter natriumbicarbonaat in 0,1 molaire natriumhydroxide bevat. Injecteer vervolgens 10 milliliters lucht in de glazen kamer via de driewegstopkraan. Sluit met een spuit van 20 milliliter de stopkraan naar de kamer. Herhaal na het opnieuw injecteren van de atmosfeer en vóór het hervatten van de incubatie het bemonsteren van de atmosfeer uit de glazen kamer na 60, 90 en 120 minuten.

Analyseer deze atmosferische koolstofdioxide-monsters op verrijking met gemarkeerde koolstof met behulp van een gasratio-massaspectrometer, zoals beschreven in de Protocoltekst. Stabiele isotopen zijn na twee uur goed ingebouwd in jonge volwassen wormen, zoals hier aangetoond door de gemeten gemarkeerde koolstof in atmosferische koolstofdioxide en opgeloste koolstofdioxide in wormen die gevoed zijn met levende of UV-bestraalde gedode OP 50 e coli. De ratio van koolstof-13 koolstofdioxide ten opzichte van koolstof-12 koolstofdioxide was groter in de fractie van de opgeloste koolstofdioxide van de wormen in vergelijking met de vrijgekomen atmosferische koolstofdioxide. Er werd waargenomen dat langdurige blootstelling aan een stabiel isotoop vanaf het larvale stadium en het vervolgens uitspoelen van de wormen op NGM-agar zonder bacteriën leidde tot een verhoogde isotopische verrijking van vrij glutamaat in jonge volwassen wormen.

In deze grafiek stelt L1 de wormen voor die zijn gevoed met universeel gelabelde koolstof 13 glucose en OP 50-bacteriën vanaf het L1-larvale stadium tot het 959-cel jongvolwassen stadium; YA stelt de wormen voor die 48 uur lang zijn gevoed met koolstof 13 glucose en OP 50-bacteriën, beginnend vanaf de eerste dag van de eiafzetting in het jongvolwassen stadium. De x-as geeft het totaal aantal gelabelde koolstofatomen in elke glutamaatsoort aan, en de y-as geeft het percentage verrijking aan. Alle dieren zijn gereinigd van overtollig isotopisch label voorafgaand aan de verdere monsterpreparatie.

Voor GCMS-analyses geven de groene balken wormen aan die zijn schoongemaakt na isotopische blootstelling door twee uur lang OP 50 E. coli op NGM-platen te voeden voorafgaand aan de PCA-extractie. De blauwe en grijze balken geven wormen aan die zijn schoongemaakt na isotopische blootstelling op NGM-platen zonder bacteriën gedurende respectievelijk twee of zes uur voorafgaand aan de PCA-extractie, ongeacht het tijdverloop van de isotopische blootstelling. Er werd geen significant verschil in isotopische verrijking van intermediaire metabolieten waargenomen wanneer de dieren gedurende twee of zes uur op platen werden schoongemaakt.

In beide cursussen van isotopische blootstelling werd minder isotopische verrijking waargenomen in intermediaire metabolieten wanneer de dieren werden gereinigd door gedurende twee uur niet-gelabelde bacteriën te voeren. Daarom werd het optimale reinigingsprotocol voor wormen die op NGM-platen met uitgestreken bacteriën en isotoop waren gekweekt, vastgesteld op reiniging gedurende twee uur op niet-uitgestreken NGM-platen om het verrijkingspercentage in intermediaire metabolieten te optimaliseren. Dit volgde op een behandeling van 24 uur in vloeibare kweek met één koolstof-13 glucose met zes koolstofatomen zonder bacteriën.

In deze figuur wordt een vergelijking weergegeven van wormmonsters die zijn gelyseerd door middel van sonisatie alleen of sonisatie in combinatie met malen. Wormen die waren gelyseerd via sonisatie plus malen vertoonden een hogere isotopische verrijking dan monsters die enkel door sonisatie waren gelyseerd. Uiteindelijk werden levende wormen gevoed met een stabiele isotopische precursor, ofwel tijdens de ontwikkeling vanaf het L1-stadium op platen, of beginnend op de eerste dag van de eiafscheiding als jonge volwassenen gedurende 24 uur in vloeibare cultuur. Dit maakt gevoelige analyse mogelijk van de isotopische verrijking tussen metabolieten die indicatief zijn voor de flux via glycolyse, pyruvaatmetabolisme en de tricarboxylzuurcyclus na de ontwikkeling.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoek naar mitochondriële ziekten om de intermediaire metabole flux in C. elegans te verkennen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u stabiele isotopische profilering van het intermediaire metabolisme en de metabole flux in de nematoden C. elegans kunt uitvoeren.