Name: Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer een RNAi-injectiemethode voor gen-silencing in Anopheles gambiae muggen. Dit protocol toont hoe dsRNA in de thorax wordt geïnjecteerd om genfuncties en resistentie tegen malaria te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RNAi-gemedieerde gen-silencing in muggen vereist de voorafgaande bereiding en zuivering van specifieke dsRNA&#39;s die het gen van belang doel. Voor dsRNA synthese, adviseren wij de Ambion Megascript kit die gebruik maakt van een T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcriptie reactie maakt. Voor dsRNA zuivering, adviseren wij de Qiagen RNeasy kit. Monsters van dsRNA moeten worden gekwantificeerd en aangepast aan de 3 ug / ul in het water. Andere materialen je nodig hebt onder andere: fijne punt pincet, glazen schuif, glas microcapillaire naalden, microinjector (we gebruiken Drummond&#39;s Nanoject II), een lichtmicroscoop gemonteerd boven een koud blok, een overdekte glazen petrischaal, papieren handdoeken en een emmer met ijs . U zult ook een manier nodig om muggen en geschikte container voor hen te verzamelen, samen met een bron van voedsel, zoals katoen bal gedrenkt in 10% sucrose. <ol><li> Verzamel je muggen. Met behulp van een batterij-aangedreven afzuiger, het verzamelen van de muggen die u wilt injecteren. Steek het mondstuk met een papieren handdoek of katoenen zodat er geen muggen kan ontsnappen en verwijder het reservoir. Omdat koude temperaturen verdoven muggen, begraaf het reservoir in een emmer met ijs en wacht 5-10 minuten voor de muggen om te stoppen met bewegen. Verdoving kan ook worden bereikt door het plaatsen van het reservoir in een koude kamer of koelkast of met behulp van CO 2. Tijdens deze 5-10 minuten, verder met de volgende stap. </li><li> Bereid uw werkplek. Stel een plat oppervlak koud blok tot 2 ° C en plaats een glasplaatje erop. Dit is waar de muggen rust als je ze injecteren. Bevestig een glazen naald op de microinjector en gebruik je een tang om de punt van de naald breken op de gewenste breedte. Het is belangrijk dat de breedte is groot genoeg om voldoende ruimte voor de vloeistof door middel van stromen tegen een redelijke snelheid, maar is smal genoeg om een ​​minimale wond tijdens de injectie toe te brengen. Een goede naald tip zal worden smal genoeg om een ​​beetje buigen maar niet breken. Stel uw injectie apparatuur om de gewenste output volume (voor RNAi, gebruiken we 69 nL). Dompel de punt van de naald in de steekproef en trek je vloeistof monster in de naald met behulp van de instructies van de fabrikant. De vloeistof monster kan een dsRNA oplossing, bacteriële suspensie, of andere worden, de injectie proces is hetzelfde voor iedereen. Voeg een glazen petrischaal in het ijs emmer, zodat de bodem van de schaal is volledig contact met het ijs. Dit is waar je zal muggen totdat u klaar bent om ze te injecteren. </li><li> Bereid je muggen. Transfer 50-100 muggen uit het reservoir op het glas petrischaal. Gebruik je een tang om ze dun met een enkele laag, zorg ervoor dat de meeste contact hebben met de koude bodem van de schaal om ze onder narcose. Dekking van deze muggen met de schotel te dekken wanneer niet in gebruik. Ga terug het reservoir aan het ijs emmer te houden de rest van de muggen verdoofd. </li><li> Mount muggen op koude blok. Gebruik uw fijne punt een tang om muggen een overschrijving op een tijd van het gerecht om het glas schuiven gemonteerd op de koude blok onder de lichtmicroscoop. Ga voorzichtig met de muggen, bij voorkeur door de benen. Line-up maar liefst 30 muggen side-by-side op de dia en zorg ervoor dat je kunt om ieder een te komen met de microinjector en ervoor te zorgen elk contact maakt met de koude glijbaan. Zorg ervoor dat uw muggen zijn opgesteld ordelijk, zodat als je verder gaat weet je die en die niet zijn geïnjecteerd. Laat andere muggen behandeld in de gekoelde petrischaal. </li><li> Injecteer de eerste groep van muggen. Houd uw fijne punt getipt tang in de ene hand en houd de microinjector in de andere hand als een potlood. Gebruik de tang om de mug te verplaatsen als u nodig hebt (mee om te gaan door de benen om letsel te voorkomen) en om de mug stabiel als je injecteren. Dit werkt het beste als u de tang aan een kant van de mug te ondersteunen als je injecteren van de andere kant. Steek gewoon de naald in de thorax muggen. Het beste is om te injecteren in een strak toch dun deel uit van de nagelriem om letsel te minimaliseren. Vermijd ook het injecteren van te diep, je wilt gewoon de tip om zich binnen de thorax; diepere injecties leiden tot een grotere wonden die compromissen te overleven. Zodra de top van de naald in positie, drukt u op en laat het voetpedaal van de microinjector apparaat dat je vooraf ingesteld volume van dsRNA zal leveren. Wacht een seconde of twee en verwijder de naald uit de mug. Als een druppel vloeistof verschijnt buiten de wond, wacht een paar seconden om te kunnen worden opgenomen in de wond. Als het niet opnemen binnen een paar seconden, gooi die mug en probeer het opnieuw. Ga door met de injectie proces voor alle muggen op uw glasplaatje. </li><li> Bewaar uw muggen. Wanneer u klaar bent, uw geïnjecteerd muggen plek in gelabelde containers (onze voorkeur een pint was omzoomde kartonnen bekers gedekt doormesh netting en vastgezet met elastiekjes en een kartonnen deksel). </li><li> Ga door injecties totdat u klaar bent. Blijf muggen op de dia, injecteren en om kopjes totdat u de steekproefomvang die u wenst te dragen. Goed voor ongeveer doden-beginners zullen veel muggen sterven door het trauma van de injectie. Dit zal verbeteren met de praktijk tot bijna 100% van uw muggen overleven injectie. </li><li> Wanneer u klaar bent, plaats een gevouwen natte papieren handdoek over de beker, samen met een bron van voedsel en dekking van de cups met iets aan vocht, zoals plastic folie of een plastic Petri deksel behouden. Geïnjecteerd muggen zijn gevoelig voor uitdrogen, zodat het vocht door de natte handdoek en bewaard door het plastic zal helpen dit te voorkomen. </li><li> Plaats uw muggen op een milieuvriendelijke gecontroleerde kamer voor incubatie. </li></ol> Let op: Efficiëntie van gene silencing is zeer variabel en afhankelijk van een aantal factoren, waaronder transcript en eiwit turn-over tarieven en dsRNA opname efficiency door cellen en organen. We hebben ontdekt dat zwijgen begint al een dag na de injectie, en kan duren tot 6 dagen na de injectie. Gebruik transcript en eiwit detectiemethoden zoals kwantitatieve PCR en Western blotting te zwijgen valideren. Let op: Er zijn verschillende variaties op enkele stappen van de mug injectie en RNAi-gemedieerde gen-silencing-techniek. Sommige variaties worden beschreven door: Boisson, et al. (2006) en Blandin, et al. (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

Efficiëntie van gene silencing is zeer variabel en afhankelijk van een aantal factoren, waaronder transcript en eiwit turn-over tarieven en dsRNA opname efficiency door cellen en organen. We hebben ontdekt dat zwijgen zo vroeg een dag na de injectie begint en kan duren tot 6 dagen na de injectie. Gebruik transcript en eiwit detectiemethoden zoals kwantitatieve PCR en Western blotting te zwijgen valideren.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td></td><td>voor dsRNA-synthese; T7 RNA-polymerase-gemedieerde in vitro transcriptiereactie</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>Voor dsRNA-purificatie</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>moet worden gekwantificeerd en aangepast naar 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L in water</td></tr><tr><td>fijne pincet</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glazen objectglas</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glazen microcapillaire naalden</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-injector</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>lichtmicroscoop</td><td></td><td></td><td></td><td>gemonteerd boven een koelblok</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td></td><td></td><td></td><td>afgedekt, glas</td></tr><tr><td>keukenpapier</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% sucrose</td><td>voeding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>Dier</td><td></td><td></td><td>muggen</td></tr></tbody></table>

protocol voor rnai testen in volwassen muggen (a. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de Dimopoulos lab dsRNA injecteren in Anopheles gambiae muggen die de malariaparasiet haven. De techniek het manipuleren van de injectie installatie en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

Reverse genetische benaderingen zijn uiterst nuttig gebleken voor het bepalen van welke genen ten grondslag liggen aan de resistentie tegen vectorpathogenen bij muggen. Deze video ...

Ik ben Lindsay Garver en ik ben promovendus in het laboratorium van Dr. George Dimopoulos aan de Johns Hopkins School of Public Health. Ik ga u laten zien hoe u RNAi-gemedieerde silencing van genen uitvoert met behulp van een injectietechniek. De eerste stap is het verzamelen van de muggen die we gaan injecteren.Dit zijn gewone Gabi-stokken. Het is een mengsel van mannetjes en vrouwtjes. En dit is onze batterijgevoede aspirator.Het bevat een interne ventilator die zuiging creëert, waardoor de muggen via deze spuitmond naar dit reservoir worden gezogen. We trekken de stekker uit het stopcontact. Er is een klein toegangsluik, dat gewoonlijk wordt afgeplakt om de muggen binnen te houden, maar we openen dit, plaatsen de spuitmond, schakelen het apparaat in en gebruiken het voor de collectie.Zodra de muggen binnen zijn, pluggen we de bovenkant van de tuit en zien we de muggen in het reservoir. Vervolgens willen we deze muggen anesthetiseren. Hiervoor plaatsen we dit reservoir in een ijsemmer, dekken het af met ijs en wachten tot de muggen in rusttoestand gaan.Oké, de volgende stap is het injecteren van de muggen; hiervoor gebruiken we dit apparaat, een NanoJet 2. Dit bestaat uit een han

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video illustreert de algemene technieken die worden gebruikt aan de achterzijde Anopheles gambiae in het laboratorium. De methoden voor het onderhoud van het laboratorium muggen worden gedemonstreerd in alle stadia van het leven van het organisme cyclus van larven tot poppen om bloed te geven volwassenen.

Protocol voor Mosquito Opfok (A. gambiae)

In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing...

RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em&gt; In Vivo</em&gt; Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Muggen

RNA-Seq-analyses worden steeds belangrijker voor het identificeren van de moleculaire grondslagen van adaptieve eigenschappen bij niet-modelorganismen. Hier wordt een protocol beschreven om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen diapauze en niet-diapauze Aedes albopictus muggen, van het kweken van muggen tot RNA-sequencing en bioinformatica-analyses van RNA-Seq-gegevens.

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus

Muggen die malaria overdragen, hebben een aantal epidemiologisch belangrijke kenmerken die alleen kunnen worden gedetecteerd met behulp van moleculaire technieken. Door gebruik te maken van een MALDI-TOF-gebaseerde SNP-genotyperingsplatform, hebben we een test ontwikkeld voor het gelijktijdig detecteren van meerdere belangrijke eigenschappen (soorten, insecticideresistentie, parasietinfectie en gastheukeuze) van malariavectoren.

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

Het bipartiete GAL4-UAS systeem is een veelzijdig instrument voor modificatie van genexpressie op een gecontroleerde spatiotemporale manier die functionele genetische analyse in Anopheles gambiae mogelijk maakt. De beschreven procedures voor het gebruik van dit systeem zijn een semi-gestandaardiseerde kloonstrategie, seksing en screening van poppen op fluorescerende eiwitmarkers en embryofixatie.

Gebruik van het GAL4-UAS-systeem voor functionele genetica in Anopheles gambiae

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

Leer een RNAi-injectiemethode voor gen-silencing in Anopheles gambiae muggen. Dit protocol toont hoe dsRNA in de thorax wordt geïnjecteerd om genfuncties en resistentie tegen malaria te bestuderen.

Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

Meer video's verkennen