Name: Een muis model van de In Utero Transplantatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer in utero transplantatie in muizen voor stamcelonderzoek en gentherapie. Deze methode maakt celtransplantatie en tolerantie-inductie mogelijk in een prenataal model.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen onze financiering bronvermelding: Het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde Klinische Fellow Training Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Perstein Award (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Chirurgische Association ( TCM), en de March of Dimes (TCM).

1. Voorbereiding van de injectie Pipettes <ol><li> Kalibreer de pipet trekker zodanig dat een scheiding van de glazen pipet gebeurt binnen de 15 seconden (zie instructies van de fabrikant met betrekking tot kalibratie). De pipet zal een taper waar het scheidt. </li><li> Snijd het uiteinde van de pipet zodanig dat de afstand vanaf het begin van de conus aan het einde van de pipet is 1.04cm naar 1.05cm. De lengte van de pipet is omgekeerd evenredig met het kaliber van de pipet opening. Wees u ervan bewust dat het maken van een langere pipet resulteert ook in een zwakkere tip dat is meer gevoelig voor breuk tijdens de injectie. </li><li> De volgende stap in het maken van de pipet is om een ​​vlotte bevel te creëren door het aanscherpen van de tip over een diamant slijpen wiel. Op het moment van het snijden van de pipet om de juiste grootte, de pipet breekt vaak met een natuurlijke vellingkant op de punt die moet worden gebruikt bij het plaatsen van de pipet op het wiel. Tijdens dit proces, is het belangrijk om voorzichtig rest van de pipet op de verscherping wiel en op gezette tijden opnieuw te evalueren om te controleren of de pipet is nog steeds het wiel te raken (zoals het bevel wordt gladder, zal het contact verliezen met de verscherping wiel). </li><li> Zodra de schuine kant is glad, moet de pipetpunt worden aangescherpt (figuur 1). Verhoog de pipet zodanig dat het niet langer de verscherping wheel aanraakt, draai de klok met de 10-50 graden, en plaats de pipet terug op het draaiende wiel slijpen voor ~ 10 seconden. Zuig de pipet uit de verscherping wiel en nu onderzoekt de rand. Deze stap moet meestal worden herhaald met een aantal kleine aanpassingen te maken een scherpe rand. Als de pipet wordt geplaatst op zijn kant te lang, is het meer kans op een oneffen ondergrond (figuur 1) te ontwikkelen. Na het voltooien van de ene kant, dan kunt u verder naar de tegenoverliggende rand aanscherpen door het herhalen van de bovenstaande stappen. </li><li> Gebruik een permanent marker op een omtrek lijn waarvan elk 4mm te beginnen waar de conus van de pipet begint te tekenen. Deze afbakening komen overeen met 5uL van het volume. </li></ol> 2. Utero in Transplantation <ol><li> Na bereiding van de injecteerbare materiaal (bijv. cellen, virussen, etc.) kunt u ingesteld voor de injectie. We maken gebruik van een microinjector aangesloten op perslucht met de volgende instellingen: (Pressure instellingen: ingang 60-80 psi, vul 40 psi, injecteren 8-12 psi, balans 0 psi, houdt u 0 psi; Injection tijd 100 milliseconden). </li><li> Voor het steriliseren van de injectie pipet, twee keer schoon met 70% EtOH, gevolgd door tweemaal met steriele 1X PBS. Als de punt van de pipet is zeer fragiel, raden we autoclaaf de injectie pipetten. </li><li> Injecties kan worden gedaan met behulp van 2,5 maal 3,5 maal vergroting-loepen of een dissectie microscoop. Bereid uw procedure gebied met een warming-deken, verlichting, en de noodzakelijke chirurgische instrumenten. </li><li> Verdoven de zwangere muis (we maken gebruik van isofluraan en zuurstof geleverd via een continue stroom anesthesie-eenheid). Plaats de muis op een verwarmingselement in de rugligging en bevestig elke ledemaat met tape om de muis vast te zetten. </li><li> Clip de vacht. Dan, het dragen van steriele chirurgische handschoenen, de buik prep met 10% povidonjood, gevolgd door alcohol, en injecteer een pijnstiller, zoals buprenorfine. </li><li> Maak een incisie van 1 cm in de onderbuik (de meest inferieure aspect van de incisie moet ongeveer 1 cm hoger dan de introïtus). Incise de huid en de fascia. Wees voorzichtig dat u de buikorganen (darmen en blaas) die onmiddellijk onder de dunne laag van de fascia verwonden. </li><li> Met behulp van wattenstaafjes, voorzichtig rekken van de fascia en leveren de zwangere baarmoeder via de incisie. Tel het totaal aantal foetussen door eerst het identificeren van de rechts en links eierstokken te zorgen dat u visualiseren van de gehele baarmoeder. Plaats de baarmoeder in de buikholte voordat u verder gaat, zodat de foetussen warm blijft terwijl je voor te bereiden op de injecties. </li><li> Trek de juiste hoeveelheid van het materiaal voor het aantal foetussen u van plan bent om te injecteren. Tijdens het vullen van de naald in uw steekproef, is het belangrijk om de pipetpunt ondergedompeld om te voorkomen dat opzuigen uw monster in de microinjector slang. Aangezien de cellen zijn over het algemeen in een klein volume, we meestal plaats ze in een kleine microcentrifuge (ex: 0,5 ml) buis of direct op een stuk van Parafilm te kunnen om de naald te vullen zonder de pipetpunt. </li><li> Voorzichtig vasthouden elke foetus en identificeren van het deel van de foetus u van plan bent om te injecteren (bijvoorbeeld lever, peritoneale holte, been, etc). Met je duim en wijsvinger, moet u het stabiliseren van de foetus in het vruchtwater holte, zodat het niet draait terwijl u het uitvoeren van de injectie. Het is belangrijk om te houden van de foetus stevig genoeg om nog te stabiliseren voorzichtig genoeg om te voorkomen dat het te beschadigen. </li><li> Steek de pipet door de baarmoeder, amnion, en foetale huid en in het doelorgaan. Als de pipet is scherp, moet het gemakkelijk door deze weefsels. Als de pipet tip is saai, je wi zult merken tenten van de baarmoeder en vruchtwater membranen. Injecteer het gewenste volume in elke foetus. Het is noodzakelijk dat uw bewegingen stabiel zijn tijdens de tijd van de insertie, injectie, en intrekking van de pipet. </li><li> Zodra het gewenste volume wordt geïnjecteerd, zorgvuldig te trekken van de pipet. Als dit goed wordt gedaan, wanneer het materiaal niet uit lekken uit de amnionholte of baarmoeder. Als er een groot gat gemaakt in het amnion, die men kan herkennen door verlies van vruchtwater, dan overleven in gevaar wordt gebracht. Tot slot, voor studies die postnatale oogst te betrekken, moeten alle foetussen ontvangen technisch perfecte injecties, omdat er geen manier is om ingespoten en uninjected foetussen te onderscheiden na de geboorte. </li><li> Als u het uitvoeren van injecties in de foetale lever, kan deze soms bloed in de pipetpunt nadat het is ingetrokken, dit bevestigt dat je in de juiste positie en mag geen invloed op de overleving. Als het uitvoeren van intraperitoneale injecties, richt iets onder de foetale lever. Voor intramusculaire injecties, kan u de positie van de foetus aan de heup en dijbeen te identificeren en de gluteus spieren injecteren. Tot slot, voor intraventriculaire injecties, is het gemakkelijk om de coronale hechtingen zien de pipet rechtstreeks naar de juiste doelgroep. Voor deze injecties, zijn iets groter kaliber pipetten nodig zijn om de schedel dringen zonder de pipet. </li><li> Vervolgens voorzichtig terug te plaatsen de baarmoeder in de buikholte. Zorg ervoor dat het niet gedraaid op zichzelf of rond de vasculaire leveren. Lever 1 ml van de steriele 1X PBS in peritoneale holte van de moeder aan een vloeistof die verloren is gegaan tijdens de procedure te vervangen. Sluit de incisie in 2 lagen met een 5-0 gevlochten resorbeerbaar garen (ex: Vicryl). Sluit eerst de fascia, zonder dat de onderliggende darm of blaas, en sluit de huid. </li><li> Op dit moment, kan na de procedure medicijnen worden toegediend voor analgesie. Return elke ingespoten vrouwelijk naar een eigen kooi en plaats de kooi op een warming deken. Monitor de muis tot hij rechtop staat. Zet beddengoed in de kooi en plaats de muis in een rustig gedeelte van de muis faciliteit waar het niet mag (dus geen kooi reiniging) gestoord worden pas enkele dagen na de bevalling. Het minimaliseren van eventuele extra belasting voor het dier vermindert de kans op premature arbeid. </li><li> Zodra u klaar bent met de injecties, twee maal reinigen van uw pipet met steriele 1X PBS en een keer met 70% EtOH. </li><li> Geïnjecteerd vrouwen moeten dagelijks worden geobserveerd om ze herstellen van de procedure te verzekeren zonder problemen. De incisie moet worden gecontroleerd op zwelling, ontsteking, wond scheiding, en andere tekenen van infectie. Post-operatieve pijnstillers kan worden toegediend als dat nodig is. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Overleving van de geïnjecteerde foetussen te verkrijgbaar is de belangrijkste beperkende factor voor het bereiken van succes met deze techniek. Afhankelijk van het materiaal geïnjecteerd en de stam van de muis wordt gebruikt, kan de overlevingskansen variëren. In het algemeen dienen de injecties van hematopoietische cellen in wild-type muizen op E14 resulteren in ten minste 50% levend geboren pups. Hogere overlevingskansen zijn mogelijk afhankelijk van zowel de technische aspecten van de injectie en de kenmerken van de muizen wordt geïnjecteerd. Het minimaliseren trauma aan de baarmoeder en vruchtwater membranen is het belangrijkste technische aspect van dit protocol. Sharp zal klein kaliber pipetten resulteren in een minimale baarmoeder trauma tijdens de injectie. Wij raden het gebruik van standaard injectie naalden als het kaliber van geprefabriceerde naalden is te groot en zou resulteren in een groot gat in de baarmoeder. Handgemaakte glazen injectie pipetten zijn de enige klein kaliber naalden die gebruikt kunnen worden voor in utero injecties. Een zorgvuldige en nauwgezette chirurgische techniek, waaronder voorzichtige behandeling van de baarmoeder en een korte verdoving is ook van cruciaal belang voor een optimaal resultaat. Specifieke kenmerken van de ontvanger muizen, zoals de genetische achtergrond, zwangerschapsduur, en de worpgrootte kunnen ook invloed op de overleving. Bepaalde stammen van muizen zijn meer vatbaar voor vroegtijdige arbeid en verlies van zwangerschap, afhankelijk van hun genetische achtergrond. 15 Transgene dieren met gespierde of neurodegeneratieve defecten kunnen een verminderd vermogen om foetussen te leveren vaginaal na het ondergaan van een middellijn laparotomie hebben. 8 Deze zwangere vrouwen kunnen de levering te verlangen keizersnede. We hebben ook vastgesteld dat de zwangerschapsduur op het moment van injectie kan levensvatbaarheid impact. Foetussen die jonger zijn dan embryonale dag 12 hebben lagere tarieven te overleven dan oudere foetussen. Tot slot hebben we vastgesteld dat grote nest maten (&gt; 10 foetussen) hebben de neiging om hogere tarieven van foetaal overlijden na de injectie hebben. Aandacht voor zowel de technische aspecten van deze techniek en de specifieke kenmerken van de muizen wordt geïnjecteerd kan de overleving van de geïnjecteerde foetussen te maximaliseren. ve_content "&gt; Wanneer deze methodes correct worden uitgevoerd, kan men verwachten dat alle foetussen worden blootgesteld aan het geïnjecteerde materiaal. Net als bij de postnatale setting, echter de succesvolle oplevering van cellen of virussen in utero niet altijd tot donorcel aanslaan of gen uitdrukking, respectievelijk. De innesteling van stamcellen, bijvoorbeeld, is afhankelijk van verschillende factoren zoals de dosering en de bron van de getransplanteerde cellen. Ook het succes van de virale transductie is, voor een deel bepaald door de aard van de virale vector gebruikt. Men moet begrijpen de vele factoren die van invloed zijn overleving van de jongen, cellulaire implantatie, en virale transductie naar succes met dit protocol te bereiken. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Diagram beeltenis van de juiste verscherping van de injectie pipetten (Stap 1.4)

<ol><li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li>
<li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28SCIDXI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li>
<li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li>
<li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li>
<li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li>
<li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li>
<li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li>
<li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li>
<li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li>
<li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li>
<li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li>
<li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li>
<li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+at+the+maternal-fetal+interface%3A+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li>
<li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li>
<li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li>
</ol>

Meer dan 50 jaar geleden, Billingham, Brent, en Medawar worden gebruikt in de baarmoeder transplantatie in muizen om immuun tolerantie voor vreemde eiwitten te induceren. 16 Sinds die tijd zijn er verschillende varianten van deze techniek is gebruikt om de vragen in de immunologie en stamcelbiologie adres. Het protocol hier beschreven is een van de meest toegankelijke methoden voor het IUT. De foetale lever biedt een gemakkelijk doelwit gevisualiseerd en biedt toegang tot...

<table><tbody><tr><td>Pipetten</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetttrekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Narishige International</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Pipetslijper</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model BV-10</td><td></td></tr></tbody></table>

een muis model van de in utero transplantatie

A Mouse Model of in Utero Transplantation

De transplantatie van stamcellen en virussen in de baarmoeder heeft een enorm potentieel voor de behandeling van aangeboren stoornissen in de menselijke foetus. Bijvoorbeeld, in utero transplantatie (IUT) van hematopoietische stamcellen is gebruikt om succesvol te behandelen patiënten met een ernstige gecombineerde immunodeficiëntie. 1,2 In een aantal andere voorwaarden is echter IUT is geprobeerd, zonder succes. 3 Gezien deze gemengde resultaten, de beschikbaarheid van een efficiënte niet-menselijke model om de biologische gevolgen van stamcel transplantatie en gentherapie studie is van cruciaal belang om dit gebied te bevorderen. Wij en anderen hebben gebruikt met de muis model van de IUT naar factoren die van invloed succesvolle innesteling in de baarmoeder van de getransplanteerde hematopoietische stamcellen in zowel wild-type muizen 4-7 en mensen met een genetische ziekten te bestuderen. 8,9 De foetale omgeving ook aanzienlijke voordelen voor de aanbiedingen het succes van in utero gentherapie. Zo heeft de levering van adenovirale 10, adeno-geassocieerde virale 10, retrovirale 11, en ​​lentivirale vectoren 12,13 in de foetus resulteerde in de transductie van meerdere organen ver van de plaats van injectie met een lange-termijn genexpressie. In utero gentherapie kan daarom worden beschouwd als een mogelijke behandeling strategie voor enkel gen aandoeningen, zoals spierdystrofie of taaislijmziekte. Een ander potentieel voordeel van IUT is de mogelijkheid om immuun tolerantie te induceren van een specifiek antigeen. Zoals te zien in muizen met hemofilie, de invoering van factor IX vroeg in de ontwikkeling resulteert in een tolerantie voor dit eiwit. 14 In aanvulling op het gebruik ervan bij het onderzoek naar mogelijke menselijke therapieën, kan de muis-model van de IUT zijn een krachtige tool om fundamentele vragen in de ontwikkelings-en stamcel biologie te bestuderen. Bijvoorbeeld, kan men leveren verschillende kleine moleculen voor het induceren of specifieke gen expressie te remmen bij bepaalde stadia zwangerschapsdiabetes en ontwikkelingstrajecten te manipuleren. De impact van deze wijzigingen aangebracht kunnen worden beoordeeld op verschillende tijdstippen na de eerste transplantatie. Bovendien kan een transplantatie pluripotent of lineage specifieke progenitor cellen in de foetale omgeving om stamcellen differentiatie in een niet-bestraalde en onverstoord hostomgeving bestuderen. De muis model van de IUT heeft reeds tal van inzichten binnen het gebied van immunologie, en de ontwikkelings-en stamcel biologie. In deze video-gebaseerd protocol, beschrijven we een stap-voor-stap benadering tot het uitvoeren van IUT in muis foetussen en een overzicht van de kritische stappen en mogelijke valkuilen van deze techniek.

De muis model van<em&gt; In utero</em&gt; Transplantatie is een veelzijdig instrument dat kan worden gebruikt om de potentiële klinische toepassingen van stamcel transplantatie en gentherapie in de foetus te bestuderen. In dit protocol, presenteren we een algemene aanpak voor het uitvoeren van deze techniek

Een muis model van de In Utero Transplantatie

De transplantatie van stamcellen en virussen in utero heeft een enorm potentieel voor de behandeling van aangeborene afwijkingen bij de menselijke foetus. Bijvoorbeeld, in ...

Het algemene doel van deze procedure is het transplanteren van cellen of virussen in muisfoetussen. Maak eerst een incisie aan de ventrale zijde van de muis. Exterioriseer vervolgens de uterus en de foetussen, en voer daarna de in utero injecties uit.Plaats tenslotte de uterus voorzichtig terug in de peritoneale holte en sluit de abdominale fascia en de huid. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die cellulaire transplantatie of genexpressie aantonen via PCR, flowcytometrie of immunohistochemie bij uterusstamceltransplantatie en gentherapie. Met onze innovatieve strategieën om aangeborene afwijkingen vóór de geboorte te behandelen, kunnen we profiteren van het onrijpe foetale immuunsysteem om tolerantie voor allogene cellen of eiwitvorming te induceren.Het muismodel voor in utero transplantatie stelt ons in staat om de biologische factoren te bestuderen die uniek zijn voor de foetus en die leiden tot een succesvolle inductie van engraftment-tolerantie. Deze techniek zal nu worden gedemonstreerd door Amer Nial, een chirurg en postdoctoral fellow in mijn laboratorium. De voorbereiding van de injectiepipetten begint met het trekken van glazen pipetten met behulp van een pipettentrekker die is gekalibreerd om de scheiding van de pipet te bewerkstelligen.Plaats de pipet binnen 15 seconden in de pipettrekker en zet deze vast met de boven- en onderklemmen. Druk vervolgens op de trekknop. Het filament zal verhitten en de pipet zal splitsen.De pipet zal een taps toelopend gedeelte hebben waar deze zich splitst; snijd het uiteinde van de pipet zodanig af dat de afstand van het begin van de taps toelopende sectie tot het uiteinde van de pipet 1,04 tot 1,05 centimeter bedraagt. Aangezien de lengte van de pipet omgekeerd proportioneel is aan de diameter van de pipetopening, zal een langere pipet resulteren in een zwakkere punt die gevoeliger is voor breuk tijdens de injectie, wat de overleving van de geïnjecteerde muisfoetus kan beïnvloeden.Om een gladde schuine zijde te creëren, moet de pipetpunt worden geslepen op een diamantslijpwiel. Zet het wiel aan en laat de pipet vervolgens voorzichtig zakken op het roterende slijpwiel. Wanneer de pipet in eerste instantie wordt gesneden, breekt deze vaak met een natuurlijke schuine zijde.Controleer periodiek via de gekoppelde microscoop of de pipettepunt nog steeds het slijpwiel raakt. Naarmate de schuine zijde gladder wordt, zal het contact met het slijpwiel namelijk verloren gaan. Zodra de schuine zijde glad is, moet de pipettepunt worden geslepen.Til de pipet op zodat deze het slijpwiel niet meer raakt. Draai de pipet 10 tot 50 graden met de klok mee en plaats de pipet ongeveer 10 seconden terug op het roterende slijpwiel. Let erop dat u de pipet niet te lang op de rand plaatst, anders kan er een ongelijkmatig oppervlak ontstaan.Verwijder de pipet uit het slijpwiel en inspecteer de rand. Deze stap moet gewoonlijk herhaald worden met enkele kleine aanpassingen om een scherpe rand te creëren. Slijp na het voltooien van één zijde de tegenovergestelde rand op dezelfde manier als zojuist gedemonstreerd.Dit diagram toont het correct slijpen van de injectiepipetten, een bovenaanzicht van een correct geslepen naaldschuinte en een zijaanzicht van een pipet met een ongelijkmatige rand, zoals hier weergegeven. Gebruik tot slot een permanente marker om een omtreklijn te trekken. Elke vier millimeter, beginnend vanaf het punt waar de taps toelopende vorm van de pipet begint, komen deze markeringen overeen met een volume van vijf microliters.Nadat de injectie, de pipetten en het injectiemateriaal zijn voorbereid, kunt u de injecties klaarmaken. Reinig eerst uw injectiepipet twee keer met XPBS, dompel de pipet onder in PBS en druk op de vulknop totdat er voldoende vloeistof is opgezogen om de pipet te vullen. Controleer vervolgens de PBS.Bereid vervolgens uw proceduregebied voor met een warmtedeken, verlichting en de benodigde chirurgische instrumenten. Injecties worden uitgevoerd met 2,5 x chirurgische vergrotingsbrillen. In deze demonstratie, hoewel er ook een dissectiemicroscoop kan worden gebruikt, plaatst u de geanestheseerde muis in rugligging op een warmtemat en bevestigt u elke ledemaat met tape om het dier op zijn plaats te fixeren.Nadat de vacht is weggeknipt, wordt de buik voorbereid met 10% povidonjodium, gevolgd door alcohol, waarbij via een teenknijptest wordt bevestigd dat het dier volledig is geanestheseerd. Maak vervolgens een incisie van één centimeter in de onderbuik. Het meest inferieure aspect van de incisie moet ongeveer één centimeter superieur aan de huid en de fascia liggen.Zorg ervoor dat de darmen en de blaas, die zich direct onder de dunne laag fascia bevinden, niet worden beschadigd. Rek de fascia voorzichtig op met wattenstaafjes en haal de drachtige uterus door de incisie naar buiten. Identificeer de rechter- en linkerovaria om er zeker van te zijn dat u de gehele uterus in beeld heeft, en tel vervolgens het totaal aantal foetussen.Plaats de baarmoeder terug in de buikholte voordat u verdergaat, zodat de foetussen warm blijven terwijl u zich voorbereidt op de injecties. Aangezien de injecteerbare materialen over het algemeen in een klein volume aanwezig zijn, plaatsen we deze meestal in een kleine microcentrifugebuis om de naald te kunnen vullen zonder de pipetpunt te breken. Omdat de injecties het moeilijkste aspect van deze procedure vormen, is een goede techniek die resulteert in minimaal trauma aan de baarmoeder cruciaal voor het succes van deze methode.De foetussen moeten stevig worden vastgehouden, maar voorzichtig genoeg om beschadiging te voorkomen. Het is daarnaast essentieel dat uw bewegingen stabiel zijn tijdens het inbrengen en terugtrekken van de pipet bij de injectie. Zuig het juiste volume materiaal op voor het aantal foetussen dat u van plan bent te injecteren.Het is belangrijk om de pipetpunten op afstand te houden om te voorkomen dat uw monster in de slang van de micro-injector wordt opgezogen. Houd een foetus voorzichtig vast en identificeer het deel van de foetus dat u wilt injecteren. In deze demonstratie zullen we elke foetus in een ander lichaamsdeel injecteren, waarbij we beginnen met de foetale lever.Stabiliseer het foetus met uw duim en wijsvinger in de vruchtzak, zodat het niet draait tijdens het uitvoeren van de injectie. Om de lever te injecteren, steekt u de pipet voorzichtig door de baarmoeder, het amnion en de foetale huid, en vervolgens in de foetale lever. Een scherpe pipet zou gemakkelijk door deze weefsels moeten dringen.Injecteer het gewenste volume in de foetus en trek de pipet voorzichtig terug. Het is essentieel dat de bewegingen constant zijn tijdens het inbrengen van de pipet, de injectie en het terugtrekken bij intraperitoneale injecties. De pipet wordt ook door de uterus, het amnion en de foetale huid ingebracht, maar is gericht op een plek net onder de foetale lever.Injecteer het gewenste volume voor intramusculaire injecties. Positioneer het foetus om de heup en het dijbeen te identificeren en injecteer de musculus gluteus. Voor intraventriculaire injecties zijn de coronale suturen goed zichtbaar om de pipet naar het juiste doel voor deze injecties te richten.Pipetten met een iets groter kaliber zijn vereist om de schedel te penetreren zonder de pipet te breken. Voor studies waarbij postnatale oogst plaatsvindt, moeten alle foetussen technisch perfecte injecties ontvangen, aangezien er na de geboorte geen manier is om onderscheid te maken tussen geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde foetussen. Indien de injecties correct worden uitgevoerd, mag er geen materiaal lekken uit de vruchtzak of de uterus.Nadat de foetussen zijn geïnjecteerd, plaatst u de uterus voorzichtig terug in de buikholte, waarbij u erop let dat deze niet is gedraaid of om zijn eigen vaatvoorziening is gewikkeld. Dien één milliliter 1x PBS toe in de peritoneale holte van de moeder om eventueel vloeistofverlies tijdens de procedure te compenseren. Sluit de incisie in twee lagen met een 5-0 gevlochten absorbeerbare hechtnaald.Sluit eerst de fascia zonder de onderliggende darmen of blaas te beschadigen, en sluit daarna de huid. Plaats het geïnjecteerde vrouwtje tot slot terug in haar eigen individuele kooi. Zet de kooi op een warmtepleid en voeg bedding toe aan de kooi.Plaats de muis in een rustig gedeelte van de muizenfaciliteit waar ze tot enkele dagen na de levering niet gestoord zal worden. Het minimaliseren van extra stress voor het dier zal de kans op vroeggeboorte verkleinen; hier worden representatieve resultaten van donor-engraftment na in utero cellulaire transplantatie getoond. Foetussen op embryonale dag 14 werden getransplanteerd met GFP-positieve hematopoëtische stamcellen.Vervolgens werd er perifeer bloed afgenomen bij een chimerische pup om de GFP-expressie van donorcellen aan te tonen via flowcytometrie, wat de aanwezigheid van donorcellen bevestigde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het maken van injectiepipetten en het uitvoeren van in utero injecties. Zodra deze fundamentele technieken beheerst zijn.Deze methode kan worden aangepast om foetussen in verschillende gestationele stadia te injecteren om de basisbiologie van ontwikkeling en stamcellen te bestuderen.

a-mouse-model-of-in-utero-transplantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Een beschrijving van de chirurgische inductie van endometriose bij muizen en ratten door auto-transplantatie van baarmoeder weefsel om de arteriële cascade van de intestinale mesenterium.

Muismodel van chirurgisch geïnduceerde Endometriose door Auto-transplantatie van baarmoeder weefsel

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Utero-eileiders embryo transfer maakt gebruik van de utero-eileiders splitsing als een belemmering voor het embryo uitstroom die zich kunnen voordoen bij het uitvoeren van de baarmoeder overdracht te voorkomen. Vasectomized mannetjes zijn verplicht om pseudozwanger ontvangers krijgen voor embryotransplantatie. Beide technieken worden besproken.

Utero-eileiders Embryo Transfer en vasectomie in het muismodel

Beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een transplantatie in utero (IUT) via intraveneuze en intra-vruchtwater routes van injectie in het lymfkliertest model. Dit protocol kan worden gebruikt om cellen, virale vectoren en andere stoffen in het unieke immuun-tolerante foetale milieu.

Intraveneuze en Intra-vruchtwater In Utero transplantatie in het lymfkliertest Model

We ontwikkelden een model van chorioamnionitis om foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI) te simuleren zonder complicaties van levende organismen om de effecten van FEMI op de ontwikkeling van het darmkanaal van het nageslacht te onderzoeken. Dit maakt het mogelijk om mechanistische oorzaken voor de ontwikkeling van darmletsel na chorioamnionitis te bestuderen.

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

Hier introduceren we een methode voor het uitvoeren van ronde spermatide-injectie (ROSI) bij muizen, een techniek met veelbelovende klinische toepassingen en bruikbaarheid voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de embryonale ontwikkeling.

Muis Ronde Spermatide Injectie

Deze studie introduceert een nieuw muismodel dat speciaal is ontworpen om endometrioom te simuleren, een klinisch significant subtype van endometriose. Door gebruik te maken van C57BL/6J-muizen wil het model de pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan endometrioomgerelateerde onvruchtbaarheid ophelderen en een verfijnd hulpmiddel bieden om de huidige kenniskloof in de reproductieve geneeskunde te overbruggen.

Oprichting van een experimenteel muismodel van endometrioom om de gerelateerde onvruchtbaarheid te bestuderen

Leer in utero transplantatie in muizen voor stamcelonderzoek en gentherapie. Deze methode maakt celtransplantatie en tolerantie-inductie mogelijk in een prenataal model.

Een muis model van de In Utero Transplantatie

Meer video's verkennen