Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce
18 oktober 2010
Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie van Salmonella Met behulp van fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH).
Het algemene doel van deze procedure is om het op tape gebaseerde monsteren van vers product te koppelen met moleculaire detectie van salmonella-soorten op basis van hele cellen, met behulp van snelle fluorescentie in C twee hybridisatie, ook wel bekend als vis. Dit wordt bereikt door eerst plakband op het gewenste materiaal aan te brengen en oppervlaktegebonden cellen te extraheren. Cell charge tapes kunnen direct worden geanalyseerd of worden onderworpen aan verdikkingen in vaste of vloeibare fase.
De tweede stap van de procedure is op tape, zelffixatie en dehydratatie in een ethanolreeks voor cellen die zijn verwezen naar of verrijkt in bouillon. De tweede stap omvat celfixatie in suspensie, gevolgd door Resus-suspensie van cellen in opslagoplossing. De derde stap van de procedure is om een snelle hybridisatie op tape uit te voeren met behulp van een salmonella-specifiek oligonucleotida cocktail, gevolgd door verwijdering van overtollig sonde met een spoelbuffer voor monsters die via fax worden geanalyseerd, de visstap wordt uitgevoerd in suspensie, en overtollig sonde kan worden verwijderd met behulp van een eenvoudige verdunningsstap voorafgaand aan analyse.
De laatste stap van de procedure is om de gehybridiseerde op tape gebonden cellen tegenkleuren met DPI en ze te onderzoeken met behulp van fluorescentiemicroscopie. Voor feiten-gebaseerde analyses is een tegenkleuring niet nodig. Uiteindelijk biedt deze methode een middel voor visuele of cytometrische detectie van salmonella-soorten die mogelijk aanwezig zijn op bemonsterd vers product.
Ik had het idee voor deze methode voor het eerst toen ik las over een Italiaanse groep die een soortgelijke aanpak gebruikte om bacteriegemeenschappen op Romeinse aero-steenrelicten te onderzoeken. Maar r en ik leidden een discussie over dit werk in een klas die ik gaf over snelle methoden in de voedselmicrobiologie. Een paar weken later begon een salmonella-uitbraak die terug te voeren was op vers product uiteindelijk bij bijna 1500 mensen in 43 verschillende staten ziekte te veroorzaken.
Terwijl onze experimentele aanpak een tijdige en praktische weg biedt voor de detectie van specifieke bacterietypen op vers product, is deze ook draagbaar genoeg om testen in het veld of in een voedselproductieomgeving mogelijk te maken. Begin met het selecteren van een tape om te gebruiken voor bemonstering. Enkele opties zijn de commercieel verkrijgbare fungitape of contacted die steriel zijn en ook verpakt voor gemakkelijk gebruik.
Teken met een permanente markering centimeterkwadraten op de niet-zieke kant van een 10 centimeter stuk plakband met behulp van een steriele aluminium sjabloon. Dit zal dienen als visuele gids om op te merken welk deel van het plakband is gebruikt om het voedsel of omgevingsoppervlak te bemonsteren. Vorm een CS-vormige lus van plakband met de plakkerige kant naar het te bemonsteren oppervlak. Om dit te doen, houd de plakkerige uiteinden met de duim en middelvinger en plaats de wijsvinger tegen het getekende vierkant aan de achterkant van het plakband.
Plaats het plakband op het te bemonsteren oppervlak en druk voorzichtig het gemarkeerde gebied tegen het oppervlak zonder de randen van het plakband los te laten. Gebruik de wijsvinger om ervoor te zorgen dat de plakkerige kant van het plakband volledig in contact komt met het monsteroppervlak. Vermijd bellen door een gelijkmatige beweging te gebruiken.
Trek langzaam het plakband van het monster weg. Fysiek extractie van oppervlaktegebonden microben bevestig de celcharge. Plak het plakband met de plakkerige kant omhoog op een glazen microscoopglas. Gebruik generiek transparant kantoorplakband om de juiste spanning en rek van het plakband te garanderen, zodat een vlakke, niet-kreukelige oppervlakte wordt gecreëerd.
Dit zal helpen problemen met vervorming of opkrullen van het plakband te minimaliseren. Tijdens daaropvolgende verwarming. Tijdens hybridisatie wordt het plakband met de plakkerige kant naar beneden op xylose-snijder tertile vier of XLT vier agri platen geplaatst, zodat de bemonsterde cellen in direct contact zijn met het agri-oppervlak om eenvoudige verwijdering van het plakband van het agri-oppervlak mogelijk te maken.
Na verrijking wordt de template-contactgedeelte van het plakband vlak geplaatst met het agri-oppervlak, en één uiteinde van het plakband wordt losjes vastgehecht. De zijwand van de petrischaalplaten worden omgekeerd om condensatie te voorkomen en geïncubeerd bij 35 graden Celsius. Om voldoende groei van salmonella-soorten mogelijk te maken, zal de lengte van de incubatieperiode die nodig is om de cellen tot een detecteerbaar niveau te verrijken, afhangen van de initiële salmonella-besmettingsniveaus.
Na de gewenste verrijkingsperiode, open de agarplaat, het plakband zal zijn plakkerigheid behouden tijdens de incubatie. Druk voorzichtig het plakband tegen de agar met de wijsvinger om maximale herstel van microkolonies gevormd bij het plakband-agar-interface te garanderen, pak de tape vanaf de rand die aan de wand van de petrischaal is bevestigd en verwijder deze met een langzame gelijkmatige beweging. Gebruik generiek transparant kantoorplakband om de celcharge tape met de plakkerige kant omhoog op een microscoopglas te monteren, zodat een vlakke, niet-kreukelige oppervlakte wordt gecreëerd.
Voer celfixatie op tape uit gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius door het contactgebied van het monster te bedekken met 500 microliter 10% neutraal gebufferde formine. Gooi het fixeermiddel in een verzegelbare container onder een chemische kap om blootstelling aan irriterende of giftige damp te minimaliseren, spoel de tape eenmaal in een x fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS door de tapeoppervlakte voorzichtig met PBS te overspoelen, dehydrateer het monster. Gebruik een progressieve ethanolreeks, bereid prehybridisatie hybridisatie en wasbuffers met behulp van commerciële moleculaire biologie graad oplossingen, filter met behulp van een punt 22 micrometer spuit en verwarm hybridisatie en wasbuffers voor op 55 graden Celsius.
Voeg fluorescerend gelabelde oligonucleotida sondes toe aan voorverwarmde hybridisatiebuffer voor een uiteindelijke sondeconcentratie van vijf nanogram per microliter. Bedek het template-contactgebied van het plakband met 30
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het bemonsteren van de oppervlakken van vers fruit en groenten, zoals tomaten, met behulp van plakband. Het maakt snelle detectie van Salmonella mogelijk door middel van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Voedselveiligheid
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Salmonella is een belangrijk voedselgebonden pathogeen.
- Traditionele methoden voor het detecteren van Salmonella kunnen tijdrovend zijn.
- Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) maakt snelle detectie mogelijk.
- Plakband bemonstering is een nieuwe aanpak voor het bemonsteren van oppervlakken.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het bemonsteren van oppervlakken van vers fruit en groenten.
- Om snelle moleculaire detectie van Salmonella mogelijk te maken.
- Om voedselveiligheidsprotocollen bij het hanteren van producten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Toepassing van plakband om oppervlaktegebonden cellen te verzamelen.
- Celfixatie en dehydratie in een ethanolreeks.
- Hybridisatie met behulp van een Salmonella-specifiek oligonucleotide probe cocktail.
- Wassen en analyse van monsters via fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van Salmonella van oppervlakken van vers fruit en groenten.
- Snelle detectie bereikt door middel van FISH-methodologie.
- Aangetoonde effectiviteit van plakband bemonstering.
- Mogelijkheid voor het verbeteren van voedselveiligheidsmaatregelen.
Conclusies
- De plakbandmethode is een haalbare optie voor bemonstering.
- FISH biedt een snelle detectietechniek voor pathogenen.
- Deze aanpak kan worden geïntegreerd in voedselveiligheidspraktijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid, culture-independent detection of foodborne pathogens like Salmonella on fresh produce surfaces supports early risk assessment in the food safety testing workflow. The adhesive tape-FISH method enables direct sampling and molecular identification without enrichment delays, providing timely data for go/no-go decisions in produce supply chains. This approach enhances predictive confidence in contamination screening and reduces reliance on slower culture-based methods.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of surface-associated microbial presence for hypothesis testing in food safety models.
- Operational Value: Provides a simple, portable sampling technique compatible with field and production environment use.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts via microscopy or flow cytometry for Salmonella detection.
- Operational Value: Supports assay standardization through fixed tape mounting, probe hybridization, and washing steps.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of multiple produce types using the same tape-FISH workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by detecting Salmonella on fresh produce surfaces under controlled conditions.
- Operational Value: Allows seamless transition from sampling to enrichment (solid or liquid phase) and downstream analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, actionable contamination data.
Pipeline & Workflow Integration
The tape-FISH method fits within the early discovery continuum, supporting initial hazard detection before proceeding to more detailed characterization or enrichment-based workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding surface microbial load and distribution on fresh produce matrices.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs via FISH signal detection, enabling comparison across sampling conditions.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts compatible with microscopy and flow cytometry for single-cell analysis.
- Translational Research: Connects surface sampling to enrichment strategies that model pathogen growth in food-relevant environments.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable sampling module applicable across multiple produce types and testing sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathogen detection through direct, culture-independent molecular identification.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fixed sampling areas, controlled fixation, and standardized hybridization.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing time-to-result and enabling rapid screening of high-volume produce lots.
- Portfolio Impact: Informs risk-based prioritization of lots for further testing or release based on rapid Salmonella detection outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy or flow cytometry for signal detection and analysis.
- Needs access to hybridization incubators, wash stations, and reagent preparation for probe handling.
- Demands standardized tape application and fixation protocols to ensure consistent cell extraction and retention.
- Involves adaptation considerations for different produce surface textures and topographies.
- Includes practical limitations related to probe specificity and background fluorescence from complex food matrices.
