Name: Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer een snelle detectiemethode voor Salmonella op vers fruit met plakband-sampling en fluorescentie in situ hybridisatie. Deze techniek verbetert voedselveiligheid door snelle pathogeenidentificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering van dit werk werd geleverd door een Grow Iowa Values ​​Fund toe te kennen aan BFBS.

1. Oppervlakte-sampling met steriele Plakband <ol><li> Selecteer een band om te gebruiken voor de bemonstering. De commercieel verkrijgbare Schimmels-Tape of Con-Tact-It sampling tapes zijn steriel en speciaal verpakt voor gebruiksgemak. We hebben echter ontdekt dat transparant (optisch helder) generieke office tape ook kan worden gebruikt. </li><li> Gebruik een permanent marker op 1 cm 2 vierkanten te tekenen op de niet-klevende zijde van een 10 cm stukje plakband (een papieren sjabloon kan worden gebruikt). Dit zal dienen als een visuele leidraad voor het noteren van welk deel van de tape is gebruikt om de voedingsmiddelen-en milieu-oppervlak monster. </li><li> Vorm een ​​"C"-vormige lus van tape met de plakkerige zijde het oppervlak te bemonsteren. Om dit te doen, houdt u de sticky ends met de duim en middelvinger en de positie van de wijsvinger tegen de getekende vierkant op de rug (niet-klevende zijde) van de band (figuur 1). </li><li> Plaats de tape op het oppervlak te bemonsteren en druk voorzichtig op het aangegeven gebied tegen het oppervlak. Zonder dat het loslaten van de randen van de tape, gebruik dan de wijsvinger om ervoor te zorgen dat de kleverige zijde van de cassette komt volledig in contact met het monster oppervlak, het vermijden van bubbels. </li><li> Met behulp van een nog beweging, langzaam trek de tape uit de buurt van het monster, fysiek extraheren oppervlakte-gebonden microben. Bevestig de cel geladen tape, kleverige kant naar boven, op een glazen microscoopglaasje met behulp van generieke transparante kantoor tape. Zorg voor een goede spanning / uitrekken van de tape, zodat een vlakke, niet-rimpelige oppervlak is gecreëerd. Dit zal helpen minimaliseren problemen met vervorming / kromtrekken van de band tijdens de latere verhitting tijdens de hybridisatie. </li></ol> 2. Vaste fase Verrijking en vloeistofoppervlak Miniculture <ol><li> Vaste-fase-verrijking wordt uitgevoerd door het plaatsen van de tape zijde naar beneden op xylose-lysine-Tergitol 4 (XLT-4) agarplaten, zodat de in de steekproef cellen zijn geplaatst in direct contact met het agar oppervlak. De templated / monster contact deel van de tape is geplaatst gelijk met de agar oppervlak en een einde van de band is losjes gehandeld op grond van de zijwand van de petrischaal te gemakkelijke verwijdering van de tape van de agar-agar oppervlak te vergemakkelijken na verrijking. </li><li> Platen zijn omgekeerd (om condensatie te voorkomen) en geïncubeerd bij 35 - 37 ° C voldoende groei van Salmonella spp mogelijk te maken. De lengte van de incubatietijd die nodig is om de cellen te verrijken tot een detecteerbaar niveau zal afhangen van de eerste Salmonella besmetting niveaus. We hebben gezien uitstekend microcolony vorming van lage initiële inocula na 8 uur verrijking. </li><li> Na de gewenste verrijking periode, opent u de agarplaat. De band behoudt zijn kleverigheid tijdens de incubatie. Druk de tape tegen de agar met de wijsvinger tot maximale recuperatie van microkolonies gevormd op de tape-agar-interface te verzekeren. Pak de tape van de rand aan de muur van de petrischaal en verwijder het met een trage, zelfs beweging. Monteer de cel geladen tape, kleverige kant naar boven, op een microscoopglaasje zoals beschreven in paragraaf 1.5 hierboven. Ga verder met "Fixation en uitdroging" stap hieronder. </li><li> Voor vloeistofoppervlak miniculture, te beginnen door het vastmaken van de tape wordt gebruikt voor de bemonstering op een objectglaasje zoals beschreven in paragraaf 1.5 hierboven. Vervolgens dekking van de sjablonen / monster contact gedeelte van de tape met een niet-steriele siliconen perfusie kamer (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc), de vorming van een afgesloten ruimte waarvan de bodem bestaat uit de cel geladen tape, naar boven. Stevig, maar voorzichtig op de kamer op zijn plaats om een ​​waterdichte afdichting te garanderen. </li><li> Met behulp van een flexibele gel laden pipetpunt, transfer ≤ 500 pL trypticasesoja bouillon of ander geschikt medium via een verrijking van de kleine de kamer van de inlaatpoorten. Seal beide poorten met transparant kantoor tape om verdamping en incubeer dia's te voorkomen bij 35 -37 ° C als nodig is voor voldoende verrijking. Hoewel alle operaties moeten worden uitgevoerd volgens een goede bemonstering en van de uitvoeringspraktijken, is steriliteit van port-afdichtingsband of perfusie kamers niet nodig tijdens vloeistofoppervlak miniculture. De combinatie van vis en flowcytometrie in staat zal stellen duidelijke discriminatie van Salmonella spp. van non-target bacteriën die aanwezig kunnen zijn, met de grootste bijdrage van niet-doelsoorten flora verwacht van het monster zelf. Ga verder met "Fixation en uitdroging" stap hieronder. </li></ol> 3. Fixatie en Uitdroging <ol><li> Voor directe oppervlak bemonstering of voor vaste-fase verrijking van Salmonella spp. op de XLT-4 agar, on-tape cel fixatie te voeren gedurende 30 minuten bij 25 ° C door het bedekken van het monster contact gebied met 500 pi 10% neutraal gebufferde formaline. </li><li> Gooi fixatief in een afsluitbare container (onder een chemische motorkap om de blootstelling aan irriterende / giftige dampen een minimum te beperken). </li><li> Uitdrogen in een serie ethanol (50%, 80% en 95%, 300 pi / 3 min elke concentratie). Ga verder met "hybridisatie" stap hieronder. </li><li> Voor de fixatie van 500 pL vloeistofoppervlak miniculture monsters, zijn perfusie kamers ontsloten, en een flexibele gel laad-pipet tip wordt gebruikt om de enrichate halen. Snel op en neer pipetteren wordt gebruikt om effectieve verwijdering van de resterende tape-gebonden cellen te verzekeren. </li><li> Vervolgens wordt de gehele 500 pL miniculture volume overgebracht naar een microcentrifugebuis en gecentrifugeerd bij 2.000 xg (5 min). Het supernatant wordt verwijderd, de pellet wordt krachtig gevortexed gedurende 30-60 s, vervolgens opnieuw gesuspendeerd in een gelijk volume van 10% neutraal gebufferde formaline. Cellen gefixeerd gedurende 30 minuten bij 25 ° C. </li><li> Vervolgens fixatief is verwijderd en wordt het monster opnieuw gesuspendeerd in cel opslagbuffer, als volgt. Het monster wordt afgedraaid bij 2000 xg (5 min, 25 ° C) het supernatant wordt verwijderd, de pellet wordt krachtig gewerveld voor 30 - 60 s, het opnieuw gesuspendeerd in een gelijk volume van 50% niet-gedenatureerde ethanol-50% fosfaat- gebufferde zoutoplossing. Vaste cellen kunnen onbeperkt worden opgeslagen (jaar) bij -20 ° C. Let op: Wanneer vloeistoffen worden gewijzigd (bijvoorbeeld bij de introductie van een fixerende of andere buffer), is het belangrijk om grondig opnieuw in suspensie (met vortexen) de cel pellet in een minimale portie (~ 10 - 20 ui) van de "uitgaande" vloeibare-systeem . Dit zal helpen voorkomen klonteren en dat zelfs suspensies van de individuele cellen zijn verkregen te verzekeren. Ga verder met "hybridisatie" stap hieronder. </li></ol> 4. Hybridisatie <ol><li> Bereid hybridisatie / wasbuffer met behulp van de commerciële moleculaire biologie-grade oplossingen vermeld in tabel Materials. Laatste buffer component concentraties zijn 0,7 M NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,1% natriumdodecylsulfaat, tot aan het uiteindelijke gewenste volume met moleculair-grade water en gefilterd met behulp van een 0,22 urn spuit of kopje filter. Dezelfde buffer, zonder de toevoeging van sondes (zie hieronder) wordt gebruikt als een wassen buffer. Verwarm de hybridisatie en het wassen van buffers tot 55 ° C. </li><li> Voeg fluorescent-gelabeld Sal3 (Nordentoft et al., 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') en Salm-63 (Kutter et al., 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) oligonucleotideprobes (Materials tabel) om voorverwarmde hybridisatiebuffer. In totaal probe concentratie van 5 ng ui -1 is gebruikt (bv. 2,5 ng pi -1 elke probe, Bisha en Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Voor de direct-to-tape en de vaste fase verrijking monsters, overlay van de sjablonen monster contactoppervlak van de band met 300 pi van hybridisatie buffer met de probe cocktail en hybridiseren tape-gebonden cellen in een vochtige, afgesloten incubatiekamer ingesteld op 55 ° C. Als er een direct contact incubator, zoals de Slide Moat instrument (Materials tabel) wordt gebruikt, worden monsters gehybridiseerd voor 15 min en&gt; 20 dia's kunnen tegelijk worden verwerkt. Als een roterende-stijl hybridisatie oven, zoals de Bambino instrument (Materials tabel) wordt gebruikt, worden dia's geplaatst in 50 ml polypropyleen centrifugebuizen voor hybridisatie, een dia per buis. Omdat de warmte-overdracht is niet direct, zijn deze monsters gehybridiseerd voor een langere periode (tot 30 min). </li><li> Na hybridisatie, worden de dia's verwijderd en de probe-bevattende hybridisatiebuffer overlay is weggegooid. Dia's worden vervolgens kort en voorzichtig gespoeld met voorverwarmde wasbuffer door pipetteren een klein volume van de buffer meer dan een gekantelde dia (3 spoelingen van 300 pi per stuk), of formeel gewassen (tot 30 min) met ofwel een overlay van de voorverwarmde wassen buffer of onderdompeling in een 50 ml polypropyleen centrifugebuis met voorverwarmde wasbuffer. In onze ervaring, hoewel een formele wasbeurt geeft betere resultaten (minder haze van ongebonden probe), een eenvoudige spoeling is voldoende voor eenduidige detectie van Salmonella spp. Vervolgens dia's worden de lucht gedroogd voordat ze naar de "Detection" stap hieronder. </li><li> Hybridisatie van vloeistofoppervlak miniculture monsters wordt uitgevoerd door te stoppen met draaien monsters (vers vaste of bewaard in opslagbuffer bij -20 ° C) gedurende 5 min bij 2000 xg, gevolgd door een krachtige vortexen van de pellet en resuspensie in 100 ul voorverwarmde hybridisatiebuffer met de sonde cocktail. Monsters worden gehybridiseerd bij 55 ° C gedurende 30 minuten op een warmte-blok of een andere geschikte incubatie station (Materialen tabel), gevolgd door de toevoeging van 500 ul voorverwarmde wasbuffer. Net als bij tape-gebonden samples, kunnen deze monsters formeel worden gewassen tot 30 min met verdere incubatie bij 55 ° C in deze wasbuffer, met intermitterende vortexen. Als alternatief kunnen monsters grondig vortex na toevoeging van 500 ul voorverwarmde wasbuffer, gevolgd door onmiddellijke oogsten voor de analyse (zie hieronder). </li><li> Ter voorbereiding voor de detectie van Salmonella spp. via flowcytometrie, vloeistofoppervlak miniculture monsters worden gecentrifugeerd bij 2000 xg gedurende 5 minuten, het supernatant wordt verwijderd en de monsters zijn geresuspendeerd in 300 pi kamertemperatuur (~ 25 ° C) PBS. Als monsters nodig vervoer naar een verre faciliteit, of als er een vertraging wordt verwacht tussen hybridisatie en analyse, kunnen monsters worden gekoeld of op ijs gehouden voorafgaand aan de analysis. Als alternatief, kunnen monsters worden overgebracht naar cel opslag buffer (50:50 mengsel van PBS en absolute ethanol) en gehouden op -20 ° C voor maximaal een week, zonder noemenswaardige verliezen in de probe-verleende fluorescentie (Bisha en Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Opsporing <ol><li> Voor on-tape detectie van Salmonella spp. via fluorescentie microscopie, zijn direct-to-tape of vaste fase verrijking monsters overlayed met ~ 10 pi Vectashield H-1200 montage medium dat de nucleaire tegenkleuring 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), gemonteerd met een dekglas, vervolgens geïncubeerd in het donker gedurende 10 minuten. </li><li> Immersie olie wordt geplaatst op de cover slip, en monsters worden onderzocht met behulp van een high-vergroting olie doelstelling (63x of 100x). De DAPI filter wordt gebruikt om het monster te brengen in beeld, de microscoop wordt vervolgens in de juiste filter (groen of rood, afhankelijk van de kleurstof gebruikt om de end-label van de probes) en Salmonella cellen zijn visueel gescoord op basis van hun fluorescentie (Cijfers 2 en 3). </li><li> Voor cytometrische detectie van vloeibare oppervlak miniculture monsters, kunnen verschillende instrumenten worden gebruikt, afhankelijk van de lokale beschikbaarheid. In ons lab, zijn PBS-opgeschort monsters overgebracht naar 5 ml met ronde bodem bemonstering buizen (BD Falcon) en onderzocht met behulp van een FACSCanto doorstroomcytometer met excitatie bij 647 nm (Materialen tabel). Voor verrijkte monsters met hoge aantallen van het totaal bacteriën, is de "low flow rate"-instelling (10 pL min -1) gebruikt en 5,000-50,000 gebeurtenissen zijn verzameld. De gegevens worden geanalyseerd met behulp FlowJo software (versie 8.8.6, Tree Star, Inc, Ashland, OR) of een andere geschikte analyse software (figuur 4, panelen A en B). </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Het gebruik van plakband voor de bemonstering van Salmonella spp. van het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaten. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Typische resultaten voor direct-to-tape bemonstering en FISH detectie van Salmonella Typhimurium ATCC 14028 van het oppervlak van een tomaat (100 X olie doelstelling). Een twee-probe cocktail van Texas Red-gelabelde probes (Sal3/Salm-63) werd gebruikt te labelen deze cellen. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Microkolonies van Salmonella Typhimurium ATCC 14028 gevormd op het oppervlak van Xylose Lysine Tergitol-4 (XLT-4) agar na een acht uur on-tape verrijking bij 37 ° C. De eerste inoculum werd bemonsterd van het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaten. Vaste fase verrijking verhoogt het aantal cellen beschikbaar zijn voor detectie en ook verbetert de cellulaire rRNA inhoud. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Het gebruik van plakband voor de bemonstering van S. enterica serovar Typhimurium van het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaten, gevolgd door een directe analyse via FISH en flowcytometrie (paneel A) of na 5 uur non-selectieve vloeistofoppervlak miniculture verrijking in een perfusie kamer gevuld met 500 pL trypticasesoja bouillon (paneel B ).

<ol><li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li>
<li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li>
<li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 Forthcoming.</li>
<li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts%2C+a+microbiologically+complex+food+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li>
<li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Lloydia%22%5BJournal%5D)">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li>
<li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F. Microbiological monitoring of the food processing environment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvancho%2C+GM+%22Compendium+of+Methods+for+the+Microbiological+Examination+of+Foods%22">Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods</a>. Pouch Downes, F., Ito, K. , 4th edition, American Public Health Association. Washington, D.C. (2001).</li>
<li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food.+Prot%22%5BJournal%5D)">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li>
<li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+barley+%28Hordeum+vulgare%29+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li>
<li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li>
<li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Prot.+Trends%22%5BJournal%5D)">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li>
<li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li>
<li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li>
</ol>

Eenvoudige en snelle methodes voor de detectie van pathogenen op de productie van oppervlakken kan helpen verzachten door voedsel overgedragen ziekten door het verstrekken van tijdige en bruikbare data. Zelfklevende tape op basis van bemonsteringsmethoden zijn gebruikt in milieu-, klinische en levensmiddelenmicrobiologie sinds de jaren 1950 en omvatten indrukken van &quot;Scotch&quot;-stijl tape aan oppervlakken voor het verwijderen van micro-organismen, gevolgd door direct microscopisch onderzoek of de overdracht van h...

<table><tbody><tr><td>Fungi-Tape bemonsteringsband</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>Con-Tact-It bemonsteringsband</td><td>Birko Corporation, Denver, CO</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>Transparante kantoortape, generiek</td><td>Diverse</td><td></td><td>Moet optisch helder zijn en een lage intrinsieke fluorescentie hebben</td></tr><tr><td>Voedseloppervlak</td><td>Lokale supermarkt</td><td></td><td>Tomaten (&amp;#8211; rode tomat&amp;#8211;en aan de tros, niet gewaxt of geolied) hier gebruikt</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>Voor niet-selectieve vloeibare oppervlakte-minicultuurverrijking</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agabase</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>Voor &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;-selectieve agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agarsupplement</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>Voor &lt;em&gt; Salmonella&lt;/em&gt;-selectieve agar (XLT-4)</td></tr><tr><td>Formalineluopting</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>10% oplossing, neutraal, gebufferd (celfixatief)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Moleculaire biologie graad (dehydratatie vóór hybridisatie)</td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td>Diverse</td><td></td><td>RNase- en DNase-vrij</td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes en dekglasjes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>Moleculaire biologie graad, 5M oplossing (component voor hybridisatiebuffer)</td></tr><tr><td>Tris-EDTA bufferoplossing (100X concentraat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (component voor hybridisatiebuffer)</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>10% oplossing in 18 megohm water (component voor hybridisatiebuffer)</td></tr><tr><td>Sal3 en Salm-63 oligonucleotide probes</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-gelabeld met 6-carboxyfluoresceïne (FAM) of Texas Red (voor microscopie) of Cy5 (voor cytometrie), HPLC-gezuiverd</td></tr><tr><td>Variabele snelheid microcentrifuge</td><td>Diverse</td><td></td><td>Gebruik de rotordiameter om het RPM te berekenen dat nodig is voor de in het protocol beschreven RCF-waarden</td></tr><tr><td>CoverWell perfusiekamer</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>Niet steriel</td></tr><tr><td>Gel-laadpipetpunten (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>Lange, dunne punten voor eenvoudige toegang tot kleine bemonsteringspoorten en manoeuvreerbaarheid binnen de kamer</td></tr><tr><td>Aluminium hitteblok of precisie-gestuurd verwarmingsstation</td><td>Diverse</td><td></td><td>Eppendorf Thermomixer R droogblok verwarmings- en koelshaker hier gebruikt</td></tr><tr><td>Bambino mini-hybridisatieoven</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 230300</td><td>Glaasjes worden in 50 ml polypropyleen centrifugebuisjes geplaatst voor hybridisatie, warmteoverdracht is niet direct</td></tr><tr><td>Slide Moat slide-hybridisator</td><td>Boekel Scientific</td><td>Model 240000</td><td>Zorgt voor snelle, directe overdracht van warmte via het glazen objectglas</td></tr><tr><td>Vectashield H-1200 montage medium met 4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Minimaliseert quenching van fluorescentie tijdens microscopie, levert DAPI-tegenkleuring</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Diverse</td><td></td><td>Leitz Laborlux S hier gebruikt</td></tr><tr><td>Digitale camera</td><td>Diverse</td><td></td><td>Canon PowerShot A640 camera hier gebruikt</td></tr><tr><td>Beeldacquisitiesoftware</td><td>Diverse</td><td></td><td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) gebruikt</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>Voor minimale bewerking van beelden (overlay van beelden genomen in verschillende kanalen)</td></tr><tr><td>Flowcytometer</td><td>Diverse</td><td></td><td>FACSCanto flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) met rode (647 nm) excitatie gebruikt</td></tr><tr><td>Flowcytometrie-analysesoftware</td><td>Diverse</td><td></td><td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) gebruikt</td></tr></tbody></table>

combinatie van adhesive-tape-gebaseerde sampling en fluorescentie in situ hybridisatie voor snelle detectie van salmonella op fresh produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Dit protocol beschrijft een eenvoudige benadering voor lijm-tape-gebaseerde steekproef van tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door on-tape fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) voor snelle cultuur-onafhankelijke detectie van Salmonella spp. Cell-tapes opgeladen kan ook het gezicht naar beneden worden geplaatst op selectieve agar voor vaste-fase verrijking voorafgaand aan de detectie. Als alternatief kan een laag-volume vloeistof verrijkingen (vloeistofoppervlak miniculture) worden uitgevoerd op het oppervlak van de tape in niet-selectieve bouillon, gevolgd door FISH en analyse via flowcytometrie. Om te beginnen, steriele zelfklevende tape is in contact gebracht met verse producten, wordt lichte druk toegepast, en de tape is verwijderd, fysiek extraheren microben aanwezig zijn op deze oppervlakken. Tapes zijn gemonteerd sticky-kant naar boven op glas microscoop dia&#39;s en de bemonsterde cellen gefixeerd met 10% formaline (30 min) en gedehydrateerd met behulp van een ethanolreeks (50, 80, en 95%, 3 minuten elke concentratie). Vervolgens cel geladen tapes zijn gespot met een buffer met een Salmonella-gerichte DNA-probe cocktail en gehybridiseerd gedurende 15 - 30 min bij 55 ° C, gevolgd door een korte spoeling in een wasbuffer om ongebonden probe te verwijderen. Aanhanger, zijn FISH-gelabelde cellen vervolgens tegengekleurd met de DNA-kleurstof 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en de resultaten worden bekeken met behulp van fluorescentie microscopie. Voor vaste-fase verrijking, worden cel-betalen tapes face-down geplaatst op een geschikte selectieve agar oppervlak en geïncubeerd om in situ groei van Salmonella microkolonies, gevolgd door FISH en microscopie zoals hierboven beschreven. Voor vloeistofoppervlak miniculture, zijn cel geladen tapes geplaatst kleverige kant omhoog en een siliconen perfusie kamer wordt toegepast, zodat de tape en het objectglaasje vormen de bodem van een waterdichte kamer waarin een klein volume (≤ 500 pi) van trypticasesoja bouillon (TSB) is geïntroduceerd. De inlaat poorten zijn afgesloten en de kamers zijn geïncubeerd bij 35 - 37 ° C, waardoor de groei-gebaseerde amplificatie van de tape-geëxtraheerde microben. Na de incubatie, inlaatpoorten zijn onverhard, cellen zijn vrijstaand en gemengd met krachtig heen en weer pipetteren, geoogst via centrifugeren en gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline. Tot slot, worden monsters gehybridiseerd en onderzocht via flowcytometrie om de aanwezigheid van Salmonella spp onthullen. Zoals hier beschreven, kan onze &quot;tape-FISH &#39;aanpak van eenvoudige en snelle bemonstering en opsporing van Salmonella op tomaten oppervlakken. We hebben ook gebruik gemaakt van deze aanpak voor de bemonstering andere soorten verse producten, waaronder spinazie en jalapeño pepers.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie van<em&gt; Salmonella</em&gt; Met behulp van fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH).

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Dit protocol beschrijft een eenvoudige aanpak voor bemonstering met behulp van plakband van tomaten en andere oppervlakken van verse produceproducten, gevolgd door fluorescentie op het plakband in ...

Het algemene doel van deze procedure is om bemonstering van verse produce met behulp van plakband te koppelen aan moleculaire detectie van salmonella-soorten in hele cellen middels rapid fluorescence in situ hybridization, ook wel bekend als FISH. Dit wordt bereikt door eerst plakband aan te brengen op het gewenste materiaal en oppervlaktegebonden cellen te extraheren. Tapes met celladen kunnen direct worden geanalyseerd of worden onderworpen aan verrijking in vaste of vloeibare fase.De tweede stap van de procedure bestaat uit fixatie op de tape en dehydratie in een ethanolserie voor cellen die zijn geïnoculeerd in of verrijkt in bouillon. De tweede stap omvat cellenfixatie in suspensie, gevolgd door resuspensie van de cellen in opslagbuffer. De derde stap van de procedure is het uitvoeren van een snelle hybridisatiestap op de tape met gebruik van een salmonella-specifieke oligonucleotide-sondecocktail, gevolgd door het verwijderen van overtollige sonde met een spoeling met wasbuffer; voor monsters die via FISH worden geanalyseerd, wordt de FISH-stap in suspensie uitgevoerd en kan overtollige sonde worden verwijderd middels een eenvoudige verdunningsstap voorafgaand aan de analyse.De laatste stap van de procedure is het tegenkleuren van de gehybridiseerde tape-bound cellen met DPI en het onderzoeken ervan met fluorescentiemicroscopie. Voor analyses op basis van feiten is een tegenkleuring niet nodig. Uiteindelijk biedt deze methode een manier voor visuele of cytometrische detectie van salmonellasoorten die aanwezig kunnen zijn op bemonsterde verse produce.Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik las over een Italiaanse groep die een vergelijkbare aanpak gebruikte om bacteriële gemeenschappen op Romeinse aero-steenrelikwieën te onderzoeken. Vervolgens hebben r en ik een discussie over dit werk gevoerd in een vak dat ik gaf over snelle methoden in de voedingsmiddelenmicrobiologie. Een paar weken later begon een salmonella-uitbraak, die werd teruggevoerd op verse producten, die uiteindelijk bijna 1500 mensen in 43 verschillende staten ziek maakte.Hoewel onze experimentele aanpak een actuele en praktische weg biedt voor de detectie van specifieke bacteriële typen op verse producten, is deze ook draagbaar genoeg om testen in het veld of in een voedselproductieomgeving mogelijk te maken. Begin met het selecteren van een tape voor de bemonstering. Enkele opties zijn de commercieel verkrijgbare schimmeltape of contactplates, die steriel zijn en verpakt zijn voor gebruiksgemak.Teken met een permanente marker vierkantjes van één centimeter op de niet-plakkerige zijde van een stuk plakband van 10 centimeter, gebruik hiervoor een steriele aluminium mal. Dit dient als visuele gids om aan te geven welk deel van het plakband is gebruikt om het voedsel of het omgevingsoppervlak te bemonsteren. Vorm een C-vormige lus van het plakband met de plakkerige zijde naar het te bemonsteren oppervlak. Doe dit door de plakkerige uiteinden met de duim en middelvinger vast te houden en de wijsvinger tegen het getekende vierkant op de achterzijde van het plakband te plaatsen.Plaats de tape op het te bemonsteren oppervlak en druk het gemarkeerde gebied voorzichtig tegen het oppervlak aan, zonder de randen van de tape los te laten. Gebruik de wijsvinger om ervoor te zorgen dat de plakzijde van de tape volledig in contact komt met het monsteroppervlak. Vermijd luchtbellen door een gelijkmatige beweging te maken.Trek de tape langzaam van het monster af. Door oppervlaktegebonden microben fysiek te extraheren, wordt de celconcentratie vastgelegd. Plak de tape met de plakzijde naar boven op een glazen microscoopglaasje. Gebruik hiervoor gewone transparante kantoortape en zorg voor de juiste spanning en rek van de tape, zodat er een vlak, rimpelvrij oppervlak ontstaat.Dit helpt om problemen met vervorming of kromtrekken van de tape te minimaliseren tijdens het daaropvolgende verhitten. Plaats de tape tijdens de hybridisatie met de zijde naar beneden op xylose slicing tertile four of XLT four agri-platen, zodat de bemonsterde cellen in direct contact zijn met het agri-oppervlak om het eenvoudig verwijderen van de tape van het agri-oppervlak te vergemakkelijken.Na verrijking wordt het gedeelte van de tape met het sjabloon van het monster strak tegen het agar-oppervlak geplaatst en wordt één uiteinde van de tape losjes vastgeplakt. De wanden van de Petri-schaaltjes worden omgekeerd om condensatie te voorkomen en geïncubeerd bij 35 °C. Om voldoende groei van salmonellasoorten mogelijk te maken, hangt de benodigde lengte van de incubatieperiode om de cellen tot een detecteerbaar niveau te verrijken af van de initiële salmonellabesmettingsniveaus.Open na de gewenste verrijkingsperiode de agarplaat; de tape behoudt zijn kleefkracht tijdens de incubatie. Druk de tape voorzichtig met de wijsvinger tegen de agar om een maximale terugwinning van microkolonies te garanderen die zich op de interface tussen de tape en de agar hebben gevormd. Pak de tape vast bij de rand die aan de wand van de Petrischaal is bevestigd en verwijder deze met een langzame, gelijkmatige beweging. Bevestig de tape met de celladen met behulp van gewone transparante kantoortape met de plakzijde naar boven op een microscoopglas, zodat een vlak, kreukvrij oppervlak ontstaat.Voer de fixatie van de cellen op de tape uit gedurende 30 minuten bij 25 °C door het contactoppervlak van het monster te bedekken met 500 µL 10% neutraal gebufferde formaline. Gooi het fixeer middel in een afsluitbare container onder een chemische afzuigkap om blootstelling aan irriterende of toxische dampen te minimaliseren, was de tape eenmaal in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS door het tape-oppervlak voorzichtig te overspoelen met PBS en dehydrateer het monster. Bereid met behulp van een progressieve ethanolserie pre-hybridisatie-, hybridisatie- en wasbuffers met behulp van commerciële oplossingen van moleculaire biologie-kwaliteit, filter deze met een 0,22 µm spuitfilter en verwarm de hybridisatie- en wasbuffers voor tot 55 °C.Voeg fluorescentie-gelabelde oligonucleotide-sondes toe aan voorverwarmde hybridisatiebuffer voor een uiteindelijke sondeconcentratie van 5 ng/µL. Bedek het contactoppervlak van de tape met het template-monster met 300 µL hybridisatiebuffer die de sondecocktail bevat. Incubeer de gehybridiseerde tape-gebonden cellen in een vochtige, afgesloten incubatiekamer op 55 °C, gebruikmakend van een direct-contact-incubator, zoals een instrument in slide-modus, gedurende 15 minuten. Verwijder na hybridisatie de slides en gooi de overlay van de hybridisatiebuffer met de sonde weg. Spoel kort en voorzichtig door middel van pipetteren met voorverwarmde wasbuffer.Een klein volume buffer over een gekanteld objectglas zorgt ervoor dat de glazen aan de lucht kunnen drogen voor de onap-detectie van salmonellasoorten via fluorescentiemicroscopie. Bedek het objectglas met ongeveer 10 µL Vector Shield H 1200, een montage medium dat dpi bevat, de nucleaire tegenkleuring, en incubeer dit 10 minuten in het donker. Breng immersieolie aan op het dekglas en onderzoek de monsters met een olie-objectief met hoge vergroting.Het DPI-filter wordt gebruikt om het monster scherp te stellen. De microscoop wordt vervolgens overgeschakeld naar het juiste filter, waarna de salmonella-cellen visueel worden gescoord op basis van hun groene of rode fluorescentie, afhankelijk van welke kleurstof is gebruikt om de probes te labelen. Voor detectie via flowcytometrie worden monsters gesuspendeerd in PBS overgebracht naar ronde bemonsteringsbuisjes van 5 ml en geanalyseerd met een flowcytometer met excitatie bij 647 nanometers.Analyseer de gegevens met FlowJo-software. Bemonstering met plakband van terica serovar, Ty Murium vanaf het oppervlak van een kunstmatig besmette tomaat, vergemakkelijkt directe analyse na de visgang via microscopie of celbelading via flowcytometrie. De tapes werden verwerkt voor snelle fluorescentie in C twee hybridisatie met behulp van een combinatie van salmonella-specifieke DNA-probes en gelabeld met Texas Red, afhankelijk van de initiële lokale concentratie van salmonella-cellen op de tape.Verrijking in de vaste fase leverde resultaten op variërend van geïsoleerde microkolonies tot confluente groei. Met tape bemonsterde cellen konden worden geanalyseerd via een combinatie van FISH en flowcytometrie, ofwel direct na bemonstering of na een vloeibare oppervlaktefase van vijf uur. Verrijking in miniculturen bij 35 °C.Hoewel we het gebruik van de tape-fish techniek voor voedselveiligheid hebben beschreven, heeft de methode ook een groot potentieel voor gebruik in andere disciplines, waaronder de milieumicrobiologie, plantenpathologie of klinische microbiologie. Parallel aan deze procedure kunnen aanvullende experimenten, zoals biochemische tests of PCR, worden uitgevoerd op verrijkingen in vaste of vloeibare fase vanuit de met tape geëxtraheerde monsters. Deze tests kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden over een eventueel aanwezige salmonella, vragen die buiten het bereik van de fish-procedure vallen.

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een procedure om de etikettering...

Het gebruik van TL-Immuno-Chemie voor de detectie van Edwardsiella ictaluri In kanaal meerval ( I. punctatus) Monsters

Beschrijven we een multiplex-PCR voor de snelle detectie van Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium. Specifieke Salmonella serovars kunnen worden geïdentificeerd door zich te richten een multiplex PCR om genen en sequenties die uniek zijn voor het O-antigen biosynthese cluster en flagelline van een bepaalde serovar. Serovar wordt vervolgens toegewezen aan een Salmonella isoleren op basis van het optreden van de specifieke, grootte amplicons (PCR-product) die...

Een Allelotyping PCR voor het vaststellen van Salmonella enterica Serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, en Typhimurium

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Het algemene doel van deze studie was om de potentiële verontreiniging kruis mechanisme van door voedsel overgedragen pathogeen Listeria monocytogenes in een retail broodjeszaak instelling tonen. Deze methodologie kan worden toegepast op een verscheidenheid van verschillende omgevingen pathogeen besmetting te volgen.

Tracking microbiële verontreiniging in Retail Environments met fluorescerende poeder - Een Retail Delicatessen Milieu Voorbeeld

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.

Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7

Een protocol voor de ontwikkeling van een elektrochemische DNA biosensor bestaat uit een polylactic acid-gestabiliseerde, gouden nanodeeltjes gemodificeerde, gezeefdrukt koolstof elektrode voor het detecteren van Vibrio parahaemolyticus wordt gepresenteerd.

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Salmonella spp. /Shigella spp. zijn gemeenschappelijke ziekteverwekkers toegeschreven aan diarree. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor de screening van Salmonella spp. /Shigella spp. PCR in real time te gebruiken in combinatie met begeleide cultuur.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Hier presenteren we een protocol ter voorbereiding van de DNA-monsters van het voedsel en milieu microbiomes voor gezamenlijke detectie en subtypering van Salmonella via quasimetagenomic sequencing. Het gecombineerd gebruik van cultuur verrijking, immunomagnetic scheiding (IMS) en meerdere verplaatsing mogelijk versterking (MDA) van de effectieve concentratie van Salmonella genomic DNA van voedsel en milieu monsters.

Quasi-metagenomic analyses van Salmonella uit voedsel en milieu voorbeelden

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.

Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie

Leer een snelle detectiemethode voor Salmonella op vers fruit met plakband-sampling en fluorescentie in situ hybridisatie. Deze techniek verbetert voedselveiligheid door snelle pathogeenidentificatie.

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce (Video) | JoVE Journal

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Meer video's verkennen