Name: Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryos voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Leer organotypische slicecultuur van GFP-expressie muizenembryo's voor real-time beeldvorming van perifere zenuwuitgroei. Deze methode maakt tijdopnamen van zenuwontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de originele bron voor de idee om slice cultuur uit te voeren op muizenembryo&#39;s 5. We willen graag Joachim Kirsch erkennen voor genereuze wetenschappelijke ondersteuning en Anna Degen voor het fungeren als onze gofer tijdens het filmen. Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) en de Universiteit van Heidelberg (Excellence Cluster mobiele netwerken).

Deel 1: Voorbereiding voor het snijden en het kweken. <ol><li> Bereid 10-cm weefselkweek platen met het snijden van medium (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) en 3-cm Millicell-CM 0.4-um cultuur membraan inserts en in de broedstoof bij 37 ° C te houden en 5% CO 2. </li><li> Verwarm 4% een laag smeltpunt agarose in PBS in de magnetron en houdt het bij verhitting plaat, zodat het blijft op ongeveer 37 ° C. </li><li> Vul 10-cm bacteriologische Petrischalen met PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4) en leg ze op ijs. </li><li> Stel microtoom koeling of ervoor te zorgen dat de buffer lade en koelelementen worden opgeslagen in de vriezer om pre-cool is. </li></ol> Deel 2: Embryo inbedding. <ol><li> Ontleden embryo uit de baarmoeder en bekijk je ze met een omgekeerde fluorescentie microscoop om te controleren of GFP expressie. </li><li> Plaats embryo's op een omgekeerde 10-cm petrischaal en oriënteren ze met behulp van Whatman papier strips te veel PBS te verwijderen. </li><li> Van toepassing zijn op de embryo agarose op te lossen in deze positie. Laat agarose stollen. </li><li> Beperk de omgeving van het embryo door te snijden met een scheermesje. </li><li> Draai de embedded embryo op zijn andere kant. </li><li> Toe te passen extra agarose op embryonaal weefsel om ervoor te zorgen dat het embryo volledig is ingebed. </li><li> Bereid agarose blok met schone randen en monteren op vibratome chuck met Loctite 406, een speciale lijm gelijkaardig aan "Krazy Glue". </li></ol> Deel 3: Fineersnijmachine procedure. <ol><li> Stel de voorgekoeld buffer lade en het koelelement. </li><li> Plaats de boorkop met de gelijmde weefsel en voeg 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 +-vrij HBSS, 10 mM HEPES buffer pH 7,3, 500 U / ml penicilline / streptomycine) tot gedekt. </li><li> Invoegen en vast een voorgereinigde (70% ethanol) microtoom mes. </li><li> Bereid 350 tot 450 micrometer plakjes en breng ze met behulp van verkorte glas pasteurpipetten in weefselkweek platen bewaard op ijs. </li><li> Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig agarose uit elke plak en overdracht van cultuur membranen Millicell. Ongeveer 4 plakjes kunnen worden gekweekt op een membraan in een 10-cm weefselkweek plaat gevuld met 6 ml kweekmedium. </li><li> Incubeer plakken bij 37 ° C en 5% CO 2 (Cultuur medium: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3). Als men voert time-lapse imaging serie een moet houden van het volume van het medium constant. In het geval van getimede imaging-serie voor een korte tijd is het voldoende om het medium te laten zoals het is. Voor langere periodes cultuur verandert na 12-20 uur wordt aanbevolen. </li></ol> Deel 4: Imaging spinale zenuw uitgroei aan de microscoop. <ol><li> Afbeelding spinale zenuwen het plaatsen van een 10-cm weefselkweek plaat, met daarin Millicell cultuur membranen met plakjes, onder een rechte fluorescentiemicroscoop. </li><li> Het etiket van de oriëntatie van Millicell cultuur membranen op microscoop podium om de juiste positie in de komende beeldvorming tijdstip. </li><li> Afbeelding spinale zenuw uitgroei met 4x (numerieke lensopening [NA] 0,1), 10x (NA 0.3) of 20x (NA 0,5) doelstellingen. </li></ol> Figuur 1 toont een imaging-serie afbeeldingen van de spinale zenuw uitgroei tijdens de 20 uur van de cultuur met 4x en 10x doelstellingen. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Imaging serie van spinale zenuw uitgroei in een transversale slice van een homozygote tauGPF embryo. * = Motorische neuronen van de ventrale ruggenmerg, pijl = DRG. De dorsale (D)-buik (V) as van het schijfje wordt aangegeven. Scalebars: 200 pm.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

In een uitgebreide vergelijking van methoden voor het embryonale slice culturen van mid-dracht muis embryo&#39;s (E10 - E12) voor te bereiden, hebben we vastgesteld dat een vibratome produceert zonder twijfel de meest betrouwbare resultaten met betrekking tot zowel de algemene leefbaarheid van de culturen en de reproduceerbaarheid van de zenuw uitgroei patronen. In tegenstelling, plakjes bereid met behulp van een tissue McIlwain chopper 3 bleek te zijn volledig inviable. We oorspronkelijk in dienst een guillo...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie-instrumenten</td><td>Fine Science Tools</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>L.M.P. agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Whatman-papier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Verkorte vuurgepolijste pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM inserts</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>10 cm kweekplaten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Scheermesjes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>geen</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>x4 objectief</td><td>Olympus Corporation</td><td>PL serie</td><td></td></tr><tr><td>x10 objectief</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLFL &amp;#8211;PH serie</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur voor verwarmde kamer</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 en incubator S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypische slice cultuur van gfp-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Voor vele doeleinden, de teelt van muizenembryo&#39;s ex vivo als organotypische plakken is wenselijk. Bijvoorbeeld, gebruiken we een transgene muis lijn (tauGFP), waarin de uitgebreide versie van het groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitsluitend wordt uitgedrukt in alle neuronen van de ontwikkelingslanden centraal en perifeer zenuwstelsel 1, waardoor de mogelijkheid om zowel film als de innervatie van de voorpoot en om dit proces te manipuleren met farmacologische en genetische technieken 2. De meest kritische parameter in de succesvolle teelt van dergelijke slice culturen is de methode waarmee de schijfjes worden bereid. Na uitgebreide testen van een verscheidenheid aan methoden, we hebben ontdekt dat een vibratome is de best mogelijke apparaat om de embryo&#39;s zodanig dat ze routinematig resulteren in een cultuur die levensvatbaarheid over een periode van enkele dagen, en vooral laat zien slice, ontwikkelt zich in een tijdperk -specifieke manier. Voor mid-zwangerschap embryo&#39;s omvat dit de normale uitgroei van de spinale zenuwen uit het ruggenmerg en de achterwortelganglia om hun doelen in de periferie en de juiste bepaling van de skelet-en spierweefsel. In dit werk, presenteren we een methode voor het verwerken van hele embryo&#39;s van embryonale dag (E) E10 tot E12 in 300 tot 400 micrometer plakjes voor de teelt in een standaard weefselkweek incubator, die kunnen worden bestudeerd voor tot twee dagen na de slice voorbereiding. Cruciaal voor het succes van deze aanpak is het gebruik van een vibratome aan elk agarose-embedded embryo slice. Dit wordt gevolgd door de teelt van de schijfjes op Millicell cultuur membraan inserts geplaatst op een klein volume van het medium, wat resulteert in een interface cultuur techniek. Een nest met een gemiddelde van 7 embryo&#39;s produceert gewoonlijk minstens 14 sneetjes (2-3 plakjes van de voorpoot regio per embryo), die een beetje varieert vanwege de ouderdom van de embryo&#39;s en aan de dikte van de plakken. Ongeveer 80% van de gekweekte plakjes tonen zenuw uitgroei, die kan worden gemeten througout het kweken periode 2. Representatieve resultaten met behulp van de muis tauGFP lijn worden gedemonstreerd.

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo&#39;s voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Voor vele doeleinden is de ex vivo kweek van muisembryo's als organtypische coupes wenselijk. Wij maken bijvoorbeeld gebruik van een transgene muizenlijn (tauGFP) in ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van organotypische transversale coupes van de voorpootregio van GFP-expresserende musembryo's om de uitgroei van spinale zenuwen in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door de embryo's eerst in laagsmeltende agarose in te bedden en het gebied van weefsel en agarose te beperken tot de regio van belang. Het agaroseblok wordt vervolgens gemonteerd voor het snijden.Vervolgens worden de in het blok ingebedde embryo's in plakjes gesneden met de vibratoom. De laatste stap van de procedure is het verwijderen van de omringende agarose rond de plakjes en het overbrengen van de plakjes naar kweekplaten. De plakjes worden vervolgens gekweekt en vertonen uitgroei van perifere zenuwen naar de periferie, wat gemonitord kan worden met fluorescentiemicroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een guillotine of een weefselhakker, is dat de coupes op een meer gecontroleerde wijze worden gegenereerd en een verbeterde levensvatbaarheid in kweek vertonen. Daarom kan deze methode helpen bij het bestuderen van de ontwikkelingsneurobiologie, zoals het observeren van de geleiding en uitgroei van spinale zenuwen; de procedure zal worden gedemonstreerd door Isabel barman. Begin deze procedure door 10 centimeter weefselkweekplaten voor te bereiden met zes milliliters kweekmedium en drie centimeter milli cell cm, 0,4 micron kweekmembraan-inserts.Bewaar deze in de incubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Verwarm vervolgens 4% low melting point agarose in PBS in de magnetron en houd dit op een warmteplaat zodat het op ongeveer 37 °C blijft. Vul bacteriologische Petri-schalen van 10 centimeter met PBS en plaats deze op ijs.Stel vervolgens het Viome-koelapparaat op. Bewaar de bufferlade en de koelelementen in de vriezer totdat ze volledig bevroren zijn om embryo-embedding uit te voeren. Disseceer eerst de embryo's uit de uterus.Onderzoek ze met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop en controleer op GFP-expressie. Plaats de embryo's vervolgens op een omgekeerde Petrischaal van 10 centimeter en gebruik stroken Watman-papier om ze te oriënteren en overtollig PBS te verwijderen. Breng aros aan op het embryo om het te fixeren.Wacht in de georiënteerde positie tot de aros is gestold, trim het overtollige aros en, indien gewenst, het weefsel rondom het middelste gedeelte van het embryo. Draai het ingebedde embryo naar de andere zijde. Breng extra aros aan op het embryonale weefsel om te garanderen dat het embryo volledig is ingebed.Wacht tot de aros is gestold. Bereid een embryo-ingebed aros-blok met schone randen voor. Lijm tot slot het monster op een viome-chuck met Loctite 4 0 6.Stel de voorkoelde bufferlade en de koelingselementen in. Plaats het klemblok met het gelijmde weefsel op de viome. Voeg één X-H-B-S-S toe aan het klemblok totdat het weefsel bedekt is.Plaats een vooraf gereinigde viome-mes in de meshouder. Bereid vervolgens transversale coupes voor met een dikte van ongeveer 350 tot 450 micron. Elke coupe wordt gesneden met een HM six 50 V microtoom.Breng de plakjes over naar weefselkweekplaten met een ingekorte glazen Pasteurpipet en bewaar deze op ijs. Verwijder met een pincet voorzichtig de haren van alle plakjes. Breng de plakjes vervolgens over naar de Millicell-kweekmembranen, waarbij vier plakjes per membraan worden geplaatst op 10 centimeter kweekplaten gevuld met zes milliliter voorverwarmd kweekmedium.Incubeer de coupes bij 37 °C en 5% CO2 tot aan het begin van de time-lapse imaging en tussen de beeldvormingsintervallen in. Plaats de weefkweekplaat met de Millicell-kweekmembranen met coupes onder een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop en lokaliseer de spinale zenuwen; beeldvorm de uitgroei van de spinale zenuwen af met 4x, 10x of 20x objectieven. Markeer de oriëntatie van de Millicell-kweekmembranen op de objecttafel van de microscoop om deze bij het volgende tijdstip van beeldvorming correct te kunnen herpositioneren, indien men niet beschikt over een temperatuur- en CO2-stabiele omgeving.De hier getoonde omgeving is een beeldserie van de uitgroei van spinale zenuwen gedurende 24 uur cultuur in een transversale snede van een homozygote tau GFP-embryo. De ster geeft de motorneuronen van het ventrale ruggenmerg aan en de pijl geeft het DRG aan. Het bovenste paneel is gefotografeerd met een 4X objectief en het onderste paneel met een 10X objectief.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het prepareren van organotypische transversale coupes van muisembryo's die gebruikt kunnen worden om de uitgroei van spinale zenuwen in beeld te brengen.

organotypic-slice-culture-gfp-expressing-mouse-embryos-for-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Imaging embryonaal weefsel in real-time is een uitdaging gedurende een lange periode van tijd. Hier presenteren we een test voor het toezicht cellulaire en sub-cellulaire veranderingen in de chick ruggenmerg gedurende lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze techniek kan worden aangepast voor andere gebieden van het zenuwstelsel en zich ontwikkelende embryo.

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

This video demonstrates the ex vivo culture and imaging of oculomotor slices from transgenic mouse embryos. The embryos are isolated and embedded in agarose. Using a vibratome, slices containing the oculomotor nuclei and eyes are obtained. The slices are maintained in culture and imaged using a fluorescence microscope.

Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Slices from Transgenic Mouse Embryos

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

We presenteren hier een geoptimaliseerd protocol om foetale muizen te genotyperen, kleuren en voorbereiden voor de beeldvorming van perifere nociceptor axon projecties in het hele dier, als een effectieve methode om sensorische axon groei fenotypen te beoordelen in zich ontwikkelende genetisch gemodificeerde muizen.

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.

Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer organotypische slicecultuur van GFP-expressie muizenembryo's voor real-time beeldvorming van perifere zenuwuitgroei. Deze methode maakt tijdopnamen van zenuwontwikkeling mogelijk.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo's voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Meer video's verkennen