Name: Fysiologische Opnamen van hoge en lage Output NMJs op de Crayfish Leg Extensor Muscle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer elektrofysiologische opnamen van synaptische reacties op de extensormusculatuur van rivierkreeften. Deze methode onderscheidt tonische en fasische motorische zenuwuiteinden morfologisch en fysiologisch.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de heer D. Craig Slaven (Department of Engels, Universiteit van Kentucky) voor de redactionele ondersteuning. Ondersteund door de Universiteit van Kentucky, Departement Biologie, Bureau van Undergraduate Studies en College of Arts &amp; Sciences.

1) Inleiding Motorneuronen communiceren met een spiervezel bij synapsen die gezamenlijk worden aangeduid als een neuromusculaire junctie (NMJ). NMJs is gemakkelijk te bereiken in de meeste kreeften spier preparaten. Veel van de rivierkreeft NMJs tonen niet-stekelige excitatoire postsynaptische potentialen (EPSP), vergelijkbaar met de gesorteerde elektrische signalen gegenereerd in postsynaptische dendrieten in het zoogdier CZS of subthreshold reacties genoteerd in gewervelde NMJs (Wiersma &amp; Van Harreveld, 1938; Katz &amp; Kuffler, 1946) . De rivierkreeft NMJs kan dienst doen als fundamenteel synaptische modellen om algemene inzichten te verschaffen in synaptische transmissie en synaptische differentiatie. In het algemeen, motor-eenheden regelen aspecten van het dierlijk gedrag via de aard van de synaptische communicatie in NMJs en eigenschappen van de spieren. Sinds de eerste waarneming van "snelle" en "slow" spiercontracties in de krab en kreeft dichter spier (Lucas, 1907, 1917), heeft soortgelijke gespierd contractiele differentiatie is beschreven in andere kreeften spier types zoals abdominale buigspieren (Kennedy &amp; Takeda, 1965a , b) en ledematen extensoren (Van Harreveld &amp; Wiersma, 1936). "Fast" weeën beginnen snelle reacties. Bijvoorbeeld, de rivierkreeft staart flip is een snelle gedrag. "Slow" contracties onderhouden langzame bewegingen en het handhaven van lichaamshouding (Bradacs et al.., 1997). Die overeenkomt met "snel" en "slow" spiercontracties, "fasisch / hoge output 'en' tonic / low output 'zijn over het algemeen gebruikt om de motor neuronen te beschrijven. Het verschil in snelheid en de timing van de spieren is voor een deel gerelateerd aan verschillen in de presynaptische synaptische structuur en synaptische sterkte (King et al., 1996).. Myofibrillar proteïne isovorm expressie is ook belangrijk in contractiele verschillen, maar in preparaten zoals die van het been extensor spier, waarbij een bepaalde vezel wordt geïnnerveerd door beide soorten van motor neuronen, ligt de focus op synaptisch verschillen van de terminals, omdat de terminals te delen dezelfde doelcel (Mykles et al.., 2002). Een eerdere studie onderzocht de twee prikkelende motor axonen van het been extensor en beschreef de fasische en tonische fenotypen (Bradacs et al.., 1997). In dit rapport tonen we aan hoe de dissectie uit te voeren en het verkrijgen van opnames, zodat anderen verder kunnen onderzoeken de eigenschappen van de synaptische differentiatie van deze zenuwuiteinden. Bekeken met transmissie elektronenmicroscopie, diverse series van de secties verkregen uit de tonic en driefase-terminals op de rivierkreeft been extensoren spier bleek dat tonic terminals meer RRP blaasjes dan fasisch terminals bevatten, de mitochondriën komen vaker voor in tonic neuronen en synapsen op de driefase-terminals complexer dan die op het lage-output synapsen, want zij bevatten meerdere actieve zones met gevarieerde afstanden (Miller et al., 2002; Johnstone et al., 2008;. King et al., 1996;.. Bradacs et al., 1997). De lage-output tonic terminals zijn ook meer vatbaar voor verbetering van synaptische transmissie met de neuromodulator serotonine (5-HT) dan zijn de driefase terminals (Cooper et al.., 2003). Het feit dat de tonic en driefase NMJ aanwezig zijn op dezelfde spiervezels maakt het gemakkelijker om presynaptische verschillen op een gegeven spiervezels te beoordelen en om vragen van spiervermoeidheid, synaptische depressie en synaptische overspraak te pakken. Verschillende vragen moeten nog worden aangepakt in dit preparaat, zoals de vraag of er verschillen zijn in de postsynaptische receptor dichtheid en glutamaat receptor subtypes in postsynaptische doelstellingen voor de tonic en driefase terminals, maar een beter begrip van de fundamentele verschillen in de anatomie en fysiologie van deze twee motor-eenheden zullen helpen bij het opbouwen van een meer diepgaande kennis. De hoop is dat de fundamentele beginselen geleerd in deze synaptische voorbereiding zal van toepassing zijn op andere synapsen in diverse voorbereidingen en zal de toekomstige onderzoeken in deze synaptische model van de rivierkreeft. 2) Methods <ol><li> Alle experimenten worden uitgevoerd op de eerste of tweede lopen de benen van middelgrote rivierkreeft (Procambarus clarkii). De dieren worden individueel gehuisvest in plastic containers met oxygenized water. De temperatuur van het dier kamer is in het bereik van 13 ° C-16 ° C. De dieren worden gevoed met droog visvoer en het water veranderd op een wekelijkse basis. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Schema van een rivierkreeft wandel-been en de zes distale segmenten. </li><li> De distale aspect van het lopen been in een rivierkreeft is anatomisch onderverdeeld in zes segmenten (Figuur 1). Het been extensor bevindt zich in de meropodite, en de zenuw bundel die zal worden geïsoleerd is dicht bij de meropodite ischiopodite gewricht. De tonic of driefase axon kan selectief worden gestimuleerd als needed voor fysiologische doeleinden nadat ze zijn blootgesteld. </li><li> Cooper en Cooper (2009) beschreef een aantal aspecten van de eerste dissectie, inclusief methodes voor het blootstellen van de Excitor van de opener motor neuron binnen de meropodite regio, maar hun beschrijving voorziet niet in de zorg die nodig is voor de bescherming van de extensor spieren tegen beschadiging, zoals het was niet nodig om de opener spier voorbereiding adres. Om de extensor te beschermen, is de eerste of tweede etappe lopen verwijderd van de rivierkreeft, het meten van 6-10 cm in lichaamslengte (Atchafalaya Biological Supply Co, Raceland, LA), door het induceren van het dier aan de ledematen Automize met krachtig knijpen distaal van de fractuur vliegtuig in de ischiopodite segment. Het been wordt geplaatst op de dissectie plaat met de laterale (buitenzijde) met uitzicht op de kijker. Het been is omgedraaid totdat de kijker kan er zeker van de buitenkant (laterale zijde) is gericht op het ontleden plaat, meestal met de gebogen kant naar boven (figuur 2). Het plaatsen van het been op een stukje weefsel papier maakt het makkelijker om de voorbereiding draaien, terwijl het maken van deze bezuinigingen. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: De laterale zijde van de meropodite, meestal de kant die is gewelfd, wordt naar boven op de dissectie plaat. </li><li> Met een scalpel breaker en houder, is een scherp scheermesje gebruikt om etsen van de cuticula tot net snijden door in het patroon in figuur 3 voor de meropodite segment. Zorg wordt genomen om niet te ver distaal bezuinigen op de rug te ventrale gesneden door de meropodite-carpopodite gewricht. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: De meropodite segment met lijnen als een voorgesteld patroon voor het etsen uit het raam van cuticula. Het preparaat wordt geplaatst in een zoutoplossing. De dissectie schotel moet een Sylgard (Dow Corning) coating aan de onderkant (1 cm dik). De Sylgard wordt gebruikt, zodat insecten pinnen kunnen worden geplakt in het voor het houden van de voorbereiding nog steeds. Op dit punt is een pin vast in het midden van de carpopodite segment en in het dorsale aspect van de ischiopodite segment (figuur 4). Ontleed voorbereidingen badend in standaard rivierkreeft zoutoplossing, gewijzigd uit de oplossing van Van Harreveld s (1936), die is gemaakt met 205 NaCl, 5.3KCl; 13,5 CaCl 2; 2H 2 O; 2,45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES en aangepast aan de pH 7,4 (in mm). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: De meropodite segment met gesneden venster wordt getild. Let op de locatie van de dissectie pinnen. </li><li> De cuticula is tilde in de distale regio en de spiervezels worden gesneden uit de buurt van de nagelriem door het maken van slagen naar de basis van het been. De cuticula kan worden getild. </li><li> De apodeme (pees) is afgesneden op de meropodite-carpopodite gewricht. Een pin is geplaatst op de binnenkant van de flexor pees te laten zien waar de snede moet worden gemaakt (figuur 5). De pees is dan geknepen waar hij werd gesneden met een pincet en de flexor spier getrokken uit door te tillen in een caudale richting (Figuur 6), waardoor de belangrijkste poot zenuw en de extensor spieren. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5: De apodeme van de m. flexor spier wordt gemarkeerd door het verplaatsen van het van de flexor met een speld. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6: De apodeme van de m. flexor spier wordt gesneden en met zorg verwijderd als niet aan de belangrijkste poot schade aan de zenuwen. </li><li> De belangrijkste poot zenuw wordt doorgesneden bij de meropodite-carpopodite joint en zorgvuldig getrokken terug over de extensor spieren. De mediale oppervlak van de spier wordt gebruikt in deze studie. De scheiding van de zenuw naar de spier extensor van de belangrijkste been zenuw kan worden verbeterd door voorzichtig te trekken de distale stomp van de belangrijkste been zenuw aan de zijkant van het preparaat. Als peeling van het hoofdkanaal been zenuw over de extensor spieren, kunnen kleine takken van de axon moeten worden gesneden. Dit zijn takken van de remmende motor neuron naar de extensor spieren. De grotere bundel vertakt off van de belangrijkste been zenuw in de buurt van het proximale uiteinde van de meropodite is de kleine zenuw bundel van belang. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7: De belangrijkste poot zenuw wordt doorgesneden en terug getrokken in een proximale richting. Deze zenuw bundel kan gezien worden met methyleenblauw kleuring (figuur 8) of met 4-Di-2-ASP fluorescerende vlek (Figuur 9). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8: De extensor spieren gekleurd met methyleenblauw. Let op de axon vertakking en de twee goed zichtbaar axonen in de zenuw. Rode pijlen Demark de zenuw track. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig9.jpg" alt="Figuur 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 9"> Figuur 9: De axonen van de motorische zenuw gekleurd met 4-Di-2-ASP. De tonic axon is meer helder zichtbaar is te wijten aan de verhoogde mitochondriale inhoud. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10a.jpg" alt="Figuur 10A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 10A"> Figuur 10a: Individuele terminals van fasische en tonische neuronen gekleurd met 4-Di-2-ASP. Let op de varicosities op de tonica terminals en de dunne de aard van de driefase terminals. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10b.jpg" alt="Figuur 10B" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 10B"> Figuur 10B-Tonic opgemerkt <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10c.jpg" alt="Figuur 10C" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 10C"> Figuur 10C-fasisch opgemerkt </li></ol> 3) Fysiologische Profielen <ol><li> Te houden aan de prikkelende postsynaptische potentialen (EPSPS) van de tonische of fasische neuronen, is een van de geïsoleerde axonen in de zenuw bundel gestimuleerd door een zuig-elektrode (Figuur 11) is aangesloten op een Grass stimulator terwijl intracellulaire potentialen in de spier worden bewaakt (Johnstone et al.., 2008). Stimulatie bij 70 Hz wordt toegepast op de tonica axon om een ​​gefaciliteerde reactie voor de lage output NMJs te bevorderen, of een enkele puls (1 Hz) wordt toegepast op de driefase axon om grote epsps van de hoge output te krijgen NMJs zoals in Figuur 12. De EPSPS worden opgeslagen op een computer via een PowerLab/4s interface. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig11.jpg" alt="Figuur 11" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 11"> Figuur 11: Het stimuleren van elektrode geplaatst over een axon in de zenuw bundel. Let op de groene lijn waarin de twee belangrijkste axonen. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig12.jpg" alt="Figuur 12" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 12"> Figuur 12: Postsynaptische potentials (EPSPS) van de tonische of fasische neuronen zoals verkregen door intracellulaire opnames. </li><li> Onderzoek in de aard van synaptische faciliteren en synaptische depressie kan worden benaderd door verschillende experimentele paradigma's met de lage en hoge output NMJs. Faciliteren van de lage output NMJs hangt af van de frequentie, zoals getoond voor de 20, 40 en 60 Hz pulsen van ongeveer 20 stimuli (figuur 13). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig13.jpg" alt="Figuur 13" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 13"> Figuur 13: EPSPS in reactie op een trein van stimulatie pulsen gegeven op drie verschillende frequenties 20, 40 en 60 Hz in normale rivierkreeft zoutoplossing. </li><li> Het tarief van de synaptische depressie om de frequentie van de stimulatie is ook gerelateerd aan de hoge output NMJs. Figuur 14 toont een continue 5 Hz stimulatie van het indrukken van de NMJ meer dan 30 minuten. Met hogere stimulatie frequentie, zal de voorbereiding druk sneller (Bradacs et al.., 1997). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig14.jpg" alt="Figuur 14" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 14"> Figuur 14: EPSP amplitude van de fasische respons gedurende 5 Hz stimulatie om depressie te veroorzaken. </li></ol> 4) quantale Reacties <ol><li> Een soortgelijke procedure die beschreven voor de opener spieren van de rivierkreeft (Cooper en Cooper, 2009) is gebruikt in deze voorbereiding. De quantale EPSPS direct over herkenbare regio's van het zenuwuiteinde worden opgenomen door het plaatsen van het lumen van een macro-patch registratie-elektrode op de synaptische varicosities gevisualiseerd met de vitale kleurstof 4-Di-2-Asp (5 uM, 5-minuten behandeling, Cooper et al., 1995;. Magrassi et al., 1987).. De spontane en riep quantale antwoorden kunnen worden opgenomen langs de zenuwuiteinden. De opgeroepen en spontane synaptische potentialen worden opgenomen met de macro-patch elektrode (Dudel, 1981; Wojtowicz et al., 1991;. Mallart, 1993). Kimax glas (buitendiameter: 1,5 mm) werd getrokken en vuur-gepolijst om patch tips te produceren met binnenin een diameter van 10 tot 20 urn (figuur 15). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig15.jpg" alt="Figuur 15" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 15"> Figuur 15: Het lumen van een macro-patch registratie-elektrode. Het lumen van de elektrode wordt gevuld met het baden medium. De versterker is dezelfde als die gebruikt worden voor de intracellulaire opname hierboven vermeld. Elektrode en seal weerstand kan worden bepaald door het passeren teststroom pulsen door de elektrode. In onze experimenten, afdichting weerstanden varieerde 0,3 tot 1,0 MOhm en de elektrode weerstand varieerde 0,5 tot 1,0 MOhm. Seal weerstand kan worden gecontroleerd in de opname. </li><li> Directe tellen van quantale evenementen is het mogelijk met een lage stimulatie frequenties. Voor elke opgewekte reacties, kan het aantal quantale gebeurtenissen gemakkelijk worden bepaald voor de lage output terminals (figuur 16). Deze directe tellingen kunnen helpen schatten het gemiddelde quantale inhoud (Del Castillo &amp; Katz, 1954;. Cooper et al., 1995). Sinds de opgeroepen hoge output NMJs produceren multi-quantale opgeroepen evenementen, de gemiddelde amplitude of gebied van de doorbuiging, samen met de gemiddelde piek amplitude of het gebied van de spontane gebeurtenissen, kan worden gebruikt om passendeximate het gemiddelde quantale inhoud (Cooper et al.., 1995). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig16.jpg" alt="Figuur 16" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 16"> Figuur 16 Focale sporen opgenomen van een driefase en een tonic NMJ. <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig17.jpg" alt="Figuur 17" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 17"> Figuur 17 </li></ol>

<ol>
	<li>Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+synaptic+physiology+of+crustacean+neuromuscular+systems.">Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems.</a> Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).</li><li>Atwood, H. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+diversity+and+differentiation:+Crustacean+neuromuscular+junctions.">Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions.</a> Invertebrate Neuroscience. 1, 291-307 (1996).</li><li>Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+physiology+and+morphology+of+phasic+and+tonic+motor+axons+in+a+crayfish+limb+extensor+muscle.">Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle.</a> J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).</li><li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions,+and+rat+hippocampus.">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J. Neurosci Methods. 61, 67-78 (1995).</li><li>Cooper, R. L., Donmezer, A., Shearer, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+sensitivity+to+5-HT+between+high-+and+low-output+terminals+innervating+the+same+target.">Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target.</a> Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).</li><li>Cooper, A. S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+view+and+demonstration+of+physiology+at+the+NMJ+at+the+crayfish+opener+muscle.">Historical view and demonstration of physiology at the NMJ at the crayfish opener muscle.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> J. Physiol. 124, 560-573 (1954).</li><li>Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+synaptic+function+during+short-term+facilitation+in+motor+nerve+terminals+in+the+crayfish.">Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 24-35 (2008).</li><li>Desai-Shah, M., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+Ca2++regulation+that+influence+synaptic+transmission:+Comparison+between+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: Comparison between crayfish and Drosophila neuromuscular junctions.</a> SYNAPSE. 63, 1100-1121 (2009).</li><li>Dudel, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+at+the+crayfish+neuromuscular+junction.">The effect of reduced calcium on quantal unit at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pfl gers Arch. 391, 35-40 (1981).</li><li>Griffis, B., Moffett, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+phenotype+remains+unaltered+after+limb+autotomy+and+unloading.">Muscle phenotype remains unaltered after limb autotomy and unloading.</a> J. Exp. Zool. 289, 10-22 (2001).</li><li>Harata, N., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Mozhayeva, M., Kavalai, E. T., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+numbers+of+recycling+vesicles+in+small+CNS+nerve+terminals:+implications+for+neural+signaling+and+vesicular+cycling.">Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling.</a> Trends in Neurosci. 24, 637-643 (2001).</li><li>Jeromin, A., Shayan, A. J., Msghina, M., Roder, J., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+frequenins:+molecular+cloning+and+differential+localization+at+neuromuscular+junctions.">Crustacean frequenins: molecular cloning and differential localization at neuromuscular junctions.</a> J. Neurobiol. 41 (2), 165-175 (1999).</li><li>Johnstone, A. F. M., Kellie, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+depression+in+phasic+motor+nerve+terminals+and+influence+of+5-HT+on+docked+vesicles.">Presynaptic depression in phasic motor nerve terminals and influence of 5-HT on docked vesicles.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 16-23 (2008).</li><li>Katz, B., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+the+nerve-muscle+system+in+Crustacea.">Excitation of the nerve-muscle system in Crustacea.</a> Proc. Roy. Soc. B. 133, 374-389 (1946).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+I.+The+twitch+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. I. The twitch system.</a> J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+II.+The+tonic+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. II. The tonic system.</a> J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).</li><li>King, M. J. R., Atwood, H. L., Govind, C. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+crayfish+phasic+and+tonic+neuromuscular+junctions.">Structural features of crayfish phasic and tonic neuromuscular junctions.</a> J. Comp. Neurol. 372, 618-626 (1996).</li><li>LaFramboise, W., Griffis, B., Bonner, P., Warren, W., Scalise, D., Guthrie, R. D., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+type+specific+myosin+isoforms+in+crustacean+muscles.">Muscle type specific myosin isoforms in crustacean muscles.</a> J. Exp. Zool. 286, 36-48 (2000).</li><li>Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+vesicles+pools+within+motor+nerve+terminals+during+short-term+facilitation+and+neuromodulation.">Regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation.</a> J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2006).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+complex+excitable+tissues+by+their+response+to+electric+currents+of+short+duration.">The analysis of complex excitable tissues by their response to electric currents of short duration.</a> J. Physiol. 35, 310-331 (1907).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+summation+of+propagated+disturbances+in+the+claw+of+Astacus+and+on+the+double+neuromuscular+system+of+the+abductor.">On summation of propagated disturbances in the claw of Astacus and on the double neuromuscular system of the abductor.</a> J. Physiol. 51, 1-35 (1917).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).</li><li>Millar, A. G., Bradacs, H., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+relationship+between+release+probability+and+readily+releasable+vesicles+in+depressing+and+facilitating+synapses.">Inverse relationship between release probability and readily releasable vesicles in depressing and facilitating synapses.</a> J. Neurosci. 22, 9661-9667 (2002).</li><li>Millar, A. G., Zucker, R. S., Ellis-Davies, C. G., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+of+neurotransmitter+release+differs+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium sensitivity of neurotransmitter release differs at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 25, 3113-3125 (2005).</li><li>Msghina, M., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+structure+and+transmitter+release+in+crustacean+phasic+and+tonic+motor+neurons.">Synaptic structure and transmitter release in crustacean phasic and tonic motor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 1374-1382 (1998).</li><li>Msghina, M., Millar, A. G., Charlton, M. P., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+entry+related+to+active+zones+and+differences+in+transmitter+release+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium entry related to active zones and differences in transmitter release at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 19, 8419-8434 (1999).</li><li>Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillar+protein+isoform+expression+is+correlated+with+synaptic+efficacy+in+slow+fibres+of+the+claw+and+leg+opener+muscles+of+crayfish+and.">Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and.</a> 205 (4), 513-522 (2002).</li><li>Sparks, G., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+offsets+homeostasis+of+synaptic+transmission+during+short-term+facilitation.">5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation.</a> J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).</li><li>Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical,+physiological+and+biochemical+characterization+of+muscles+associated+with+the+articulating+membrane+in+the+dorsal+surface+of+the+crayfish+abdomen.">The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen.</a> J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).</li><li>Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles,+quanta+and+synaptic+plasticity.+Molecular+Mechanisms+of+synaptic+function.">Vesicles, quanta and synaptic plasticity. Molecular Mechanisms of synaptic function.</a> , (2001).</li><li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+solution+for+freshwater+crustaceans.">A physiological solution for freshwater crustaceans.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).</li><li>Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+innervation+of+the+crayfish+muscle.">The triple innervation of the crayfish muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, 667-667 (1936).</li><li>Wiersma, C. A. G., Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+frequency+of+stimulation+on+the+slow+and+fast+contraction+in+crustacean+muscle.">The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle.</a> Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).</li><li>Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+recruitment+of+silent+synapses.">Activity-dependent recruitment of silent synapses.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).</li></ol>

We hebben aangetoond in dit rapport hoe te ontleden, te registreren en kwantificeren synaptische reacties in een unieke rivierkreeft neuromusculaire preparaat waarin zowel hoge-en lage-uitgangsklemmen innerveren dezelfde spiervezels. De neuromusculaire voorbereidingen in de rivierkreeft bieden vele voordelen ten opzichte van gewervelde neuromusculaire verbindingen, aangezien slechts een paar prikkelende motorische neuronen zijn nodig om een ​​spier innerveren, en aangezien de neuronen zijn herkenbaar aan de voorbereiding tot de voorbereiding (Atwood, 1976). Daarnaast is de excitatoire neurotransmitter glutamaat is, en de excitatoire postsynaptische potentialen (EPSP) worden gesorteerd, dus de biofysische eigenschappen van gesorteerde gebeurtenissen zijn analoog aan de dendrieten van de neuronen in het CZS van de gewervelde dieren. De quantale stromingen, echter rechtstreeks kan worden gevolgd op de postsynaptische sites (Cooper et al.., 1995). Repetitieve 5 Hz stimulatie van de driefase zenuw geeft aanleiding tot grote EPSPS die sterk depressief na enkele minuten. Dit type van depressie komt vaak voor bij geleedpotigen fasisch neuromusculaire verbindingen (Atwood en Cooper, 1996). De aanwezigheid van de tonica terminals langs de driefase terminals maakt het mogelijk om te beoordelen of de postsynaptische doelgroep sterk wordt gewijzigd tijdens en na de depressie van de driefase motor neuron. Daarnaast is de lage output terminals bieden ook een mooie voorbereiding op de mechanismen die ten grondslag liggen te onderzoeken synaptische facilitatie (Desai-Shah et al., 2008;. Desai-Shah en Cooper, 2009) De hoge uitgangsklemmen bieden een speeltuin aan de modulatie te onderzoeken in het tempo van de synaptische depressie en het herstel proces. Toegankelijk en levensvatbare voorbereidingen moeten helpen in het ontcijferen van de mechanismen achter synaptische depressie. In deze rivierkreeft been extensor voorbereiding, exogene toepassing van serotonine is een ander middel om het herstel van synaptische depressie en mogelijk een middel om het bevorderen van onderzoek naar de mobilisatie van synaptische vesicles zwembaden te onderzoeken. Dit preparaat biedt een aantal experimentele voordelen, aangezien individuele spiervezels worden geïnnerveerd door zowel driefase-tonic motorneuronen. Omdat serotonine verhoogt het aantal blaasjes die zijn vrijgegeven met opgeroepen stimulatie, en omdat het bevordert het herstel tijdens een depressie, blijkt dat er een modulatie van het blaasje zwembaden voor het verbeteren van de kans op fusie met serotonine aanwezig zijn (Johnstone et al.., 2008 ; Logsdon et al., 2006;. Sparks et al., 2004).. Modellen die de dynamiek van het blaasje zwembaden zou binnen de presynaptische zenuwuiteinde uit te leggen tijdens de lage frequentie stimulatie, in tegenstelling tot een depressieve toestand, ook moeten worden gerekend tot de verschillende experimentele protocollen die mogelijk zijn met deze voorbereiding. Het is opgemerkt in andere systemen, dat ongeveer 30% van het blaasje pool een snelle recycling ondergaat, terwijl de rest van de gerecycleerde blaasjes gaan door een traditionele slow recycling pad door het endoplasmatisch reticulum (harata et al., 2001;. Tsien et al.. , 2001). Dergelijke dubbele paden kunnen ook aanwezig zijn in dit systeem. Als ATP ontbreekt in de depressieve toestand van de presynaptische terminal, vervolgens vastzetten en losmaken misschien niet in staat zijn om zich voordoen, dus veel meer gelost blaasjes zou blijven op het synaptische oppervlakte. Sinds meer blaasjes worden snel vrijgegeven wanneer de klemmen worden blootgesteld aan 5 HT, is het mogelijk dat er meer zijn opgenomen in het gemakkelijk losneembaar zwembad (RRV). Echter, in de depressieve toestand, met verminderde ATP, kan het docking en loskoppelen geblokkeerd worden, zelfs in de aanwezigheid van 5 HT, wat ook weer gelost blaasjes bladeren aan de synaptische oppervlakte. Omdat de voorlopige gegevens blijkt dat er meer blaasjes worden vrijgegeven na verloop van tijd met verlengde 5 HT blootstelling en stimulatie, de verdeling van het blaasje zwembad van het snelle en langzame recycling paden kunnen worden scheefgetrokken aan de bevoegde blaasjes voor de re-release (van Johnstone et al. hebben. , 2008, zie reviews-Desai-Shah et al., 2008;. Desai-Shah en Cooper, 2009) Met de technieken van focale macropatch opnames van postsynaptische stromingen en maatregelen van enkele quanta Uit afgebakende gebieden van de motorische zenuw-terminal, kan men vragen stellen om te bepalen of synaptische depressie is ontstaan ​​als gevolg van minder blaasjes wordt vrijgegeven of door wijzigingen van de functie van postsynaptische receptoren. Het is aangetoond dat de blaasjes zijn gevoeliger voor fusie bij de driefase NMJ van dit preparaat voor een gelijke blootstelling aan calcium (Miller et al.. 2005), die waarschijnlijk goed is voor de hogere quantale inhoud van de driefase terminals (Msghina et al. betekenen. , 1998, 1999). Bovendien verschillen in de calcium-bindend eiwit frequenin (Jeromín et al.., 1999) en ultrastructuur (King et al., 1996). Bijdrage leveren aan de differentiële synaptische werkzaamheid (Cooperet al.., 2003). Sommige eerdere studies hebben onderzocht de spier fenotype van de extensor spiervezels (Bradacs et al., 1997;. Cooper et al., 2003.). Vergelijking van de regulering van de spier differentiatie voor zuiver tonic en driefase soorten vezels in de rivierkreeft op gemengde vezeltypen, zoals voor het been extensor dat dof is geïnnerveerd, kan aanwijzingen geven om spieren fenotype expressie en regelgeving (Laframboise et al., 2000;. Sohn et al., 2000;. Griffis et al., 2001;. Mykles et al., 2002).. Veel fundamentele vragen moeten nog worden aangepakt in de neurobiologie, en dit preparaat kan steun bij de aanpak van een aantal van hen. Een aantal onderwerpen die van belang op het gebied vandaag de dag die kunnen worden benaderd met het been extensor zijn onder meer: ​​1) Het bepalen van de cellulaire mechanismen die de synaptische depressie ten grondslag liggen binnen de high-output terminals (Is de depressie te wijten aan een vermindering van de Ca2 + toegang, het ontbreken van een bevoegde gemakkelijk losneembaar vesicle (RRV) zwembad, en / of gewijzigd postsynaptische ontvankelijkheid?) 2) Bepalen van de mechanische rol van 5-HT wanneer het wordt aangebracht na de inductie van synaptische depressie tot een sneller herstel, en 3 te bevorderen) Bepalen of de vormen van de quantale stromen die voortvloeien uit het stimuleren van driefase-terminals worden gewijzigd tijdens de inductie van depressie pre-en post-synaptische componenten van synaptische depressie te pakken. Dit NMJ is belangrijk om voortdurend onderzoek en toekomstige onderzoekers, omdat het ons in staat stelt te verkrijgen relevante informatie die de ondergeschikte mechanismen van synaptische prestaties direct gemeten bij de release plaatsen adressen. Het huidige onderzoek op dit gebied is het verstrekken van informatie over de modulatie van synaptische depressie door 5-HT en de dynamiek van het blaasje zwembaden. Dergelijke onderwerpen hebben betrekking op de fundamentele grondbeginselen van synaptische transmissie relevant voor alle neurale systemen.

<ol><li> Rivierkreeft (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biologische Supply Co, Raceland, LA., USA. </li><li> Standaard rivierkreeft zoutoplossing: <ul><li> Gewijzigd ten opzichte van oplossing van Van Harreveld&#39;s (1936). (In mm) 205 NaCl, KCl 5,3, 13,5 CaCl 2 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES en aangepast tot pH 7,4 </li></ul></li><li> Dissectie-instrumenten: Fijn # 5 pincet, fijne schaar, mes houder, # 26002-20 insect pins (alle verkregen van Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94.404 tot 1139) </li><li> Sylgard gecoat dissectie schotel, een opname schotel ofwel gebouwd met zuig-elektrode of gebruik een zuig-elektrode en helmknop manipulator om een ​​zuiging elektrode te houden. </li><li> Dissectiemicroscoop met zoom-functie voor intracellulaire opnames. Voor focale opnemen op gevisualiseerd terminals een verbinding microscoop met rechtopstaande doelstellingen (4 x en 20X) wordt gebruikt. Men heeft een Hg lichtbron. </li><li> Standaard intracellulaire versterker en A / D-board voor on-line opname op een computer. Elektrische signalen worden opgenomen op lijn naar een PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australië). We maken gebruik van standaard software van ADInstruments genaamd Grafiek of Scope. </li><li> Chemicaliën: <ul><li> We maken gebruik van een vitale fluorescerende kleurstof, 4 [vier (diethylamino) styrylkleurstoffen] N methylpyridinium jodide (4 Di 2 Asp, Molecular Probes, Eugene, OR), aan de varicosities (Marigassi et al., 1987 visualiseren;. Cooper et al., 1995a. ). Alle zoutoplossing chemicaliën werden verkregen van Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li></ul></li><li> Voor intracellulaire opnames gebruiken we glazen capillaire buis (catalogus # 30-31-0 van FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) en voor focale macropatch elektroden die we gebruiken Kimax-51, Kimble Products art. No 34502, ID 0.8-1.1mm, lengte 100mm. De intracellulaire elektrode moet een weerstand van 20 tot 30 mOhm. De macropatch elektrode wordt geconstrueerd door het afbreken van de punt van het glas na een fijne tip werd gemaakt van een elektrode trekker. De afgebroken tip moet een schone loodrechte breuk over 20μM in diameter. De tip is dan warmte gepolijst tot ongeveer 10μM binnendiameter. De as van de elektrode is dan lopen over een verwarmingselement waardoor dit tot ongeveer 45 graden buigen met een geleidelijke bocht. Dit levert een plat of loodrecht elektrode lumen op het zenuwuiteinde als de hoek met de micro-manipulator zal produceren over een andere 45 graden aan de voorbereiding. </li></ol>

fysiologische opnamen van hoge en lage output nmjs op de crayfish leg extensor muscle

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We leggen in detail uit hoe bloot te leggen en de elektrofysiologische opnames van synaptische reacties te voeren voor hoge (fasische) en lage (tonic) output neuronen innerveren de extensoren spier in de wandel-poot van een kreeft. Duidelijke verschillen aanwezig zijn in de fysiologie en morfologie van de fasische en tonische zenuwuiteinden. De tonica axon bevat veel meer mitochondriën, waardoor het te nemen een belangrijke vlek intensiever dan de driefase axon. De tonic terminals hebben varicosities, en de driefase aansluiting is filoremische. De tonic terminals zijn laag in de synaptische efficiëntie, maar tonen dramatisch vergemakkelijkt reacties. In tegenstelling, de driefase terminals hoog in quantale effectiviteit, maar tonen synaptische depressie met een hoge frequentie stimulatie. De quantale output wordt gemeten met een focale macropatch elektrode direct geplaatst over de gevisualiseerde zenuwuiteinden. Zowel de fasische en tonische terminals innerveren dezelfde spiervezels, waarin staat dat inherente verschillen in de neuronen, in plaats van differentieel retrograde feedback van de spier, verantwoordelijk voor de morfologische en fysiologische differentiatie suggereert.

Dit artikel legt uit hoe u elektrofysiologische opnames van synaptische reacties gedrag op de extensoren spier in de wandel-poot van een kreeft en hoe de zenuwuiteinden zijn gevisualiseerd op de bruto-morfologische verschillen tussen hoog-en laag-output zenuwuiteinden te tonen.

Fysiologische Opnamen van hoge en lage Output NMJs op de Crayfish Leg Extensor Muscle

We leggen in detail uit hoe men motorneuronen met een hoge (fasische) en lage (tonische) output kan blootleggen en hoe men elektrofysiologische registraties van synaptische responsen kan uitvoeren voor deze neuronen...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe de fasische en tonische motorische uiteinden in de strekspier van de rivierkreeft kunnen worden blootgelegd en onderscheiden met morfologische kleuring en elektrofysiologische registratie. Dit wordt bereikt door eerst het eerste of tweede loopbeen van een middelgrote rivierkreeft af te knijpen, de cuticula weg te snijden en de buigspier in het meite-segment te verwijderen. Hierdoor komen de strekspier en het zenuwbundel vrij.De tweede stap van de procedure is het kleuren van het preparaat met vier ethylamino-acridine-methaangesulfate en methylperloidaat-jodide, of 4-D2-ASP, om de axonen en zenuwuiteinden te visualiseren. De derde stap van de procedure is het selectief stimuleren van tonische en/of fasische neuronen, terwijl gelijktijdig intracellulaire registraties van opgewekte EPSP's in de spiervezel worden uitgevoerd. De laatste stap van de procedure is het gebruik van een focale elektrode om spontane en opgewekte qu-gebeurtenissen vanuit de uiteinden te registreren.Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die tonische en fasische uiteinden scheiden, zowel morfologisch als fysiologisch, middels immunofluorescentiemicroscopie en elektrofysiologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de synaptische fysiologie in gebieden zoals spiervermoeidheid, synaptische depressie en synaptische crosstalk. Het experiment begint met het voorzichtig oppakken van de rivierkreeft, waarbij de scharen worden vermeden.Scheid de poot van het lichaam bij het isia pod-segment. Een krachtige knijpbeweging bij het isia pod-segment stimuleert de rivierkreeft om de eerste loop-poot te automiseren of op natuurlijke wijze af te breken. De rivierkreeft zal stoppen met bloeden en wordt teruggeplaatst in het opvangreservoir.De rivierkreeft wordt niet gedood. Plaats de poot op een stukje keukenpapier, zodat de preparaat gemakkelijk kan worden gedraaid tijdens het maken van de incisies. Draai de poot om totdat de buitenkant, de laterale zijde, naar boven is gericht op de dissectieplaat.Over het algemeen is de gebogen zijde naar boven gericht. Ets met een scherp scheermesje, bevestigd aan een scalpelbladbreker, de cuticula binnen het meite-segment door het patroon in de figuur te volgen. Let erop dat u bij de dorsaal-ventrale snede langs het meite-carpusgewricht niet te ver distaal snijdt.Deze snede resulteert in een venster in het exoskelet boven de onderliggende pootspieren. Laat de cuticula voorlopig op zijn plaats. Plaats het preparaat in een dissectieschaal met fysiologische zoutoplossing voor kreeften.Plaats op dit punt met een fijne pincet een speld in het midden van het carpod-segment en in het dorsale aspect van het ischiapod-segment, til het in de cuticula gesneden venster bij het distale uiteinde iets op en snijd met het scheermesje de vezels van de flexormusculatuur los van de cuticula. Ga door met snijden in distale naar proximale richting en til tot slot het venster van de cuticula weg. Om de extensormusculatuur bloot te leggen, moet de bovenliggende flexormusculatuur worden verwijderd.Scheid de pees van de flexormuskel door deze met een pin te verschuiven van de flexormuskel. Snijd vervolgens de pees door bij het Mari poddy carpod gewricht. Wees, zoals getoond, zeer voorzichtig om de pees weg te trekken van de beensholte voordat u de snede maakt, en snijd alleen de pees door en niet de hoofdbeenzenuw die zich aan de binnenzijde van de pees bevindt.Klem de pees op de plek waar deze is doorgesneden met een pincet en trek de flexorspier van het pootje los door deze in een krullende beweging op te tillen. Om de zenuw naar de extensorspier bloot te leggen, dient de hoofdzenuw van het pootje bij het merepodaal-carpaal gewricht te worden doorgesneden, waarna de hoofdzenuw voorzichtig over de extensorspier naar achteren wordt getrokken. De scheiding van de zenuw naar de extensorspier van de hoofdzenuw van het pootje kan worden vergemakkelijkt door de distale stomp van de hoofdzenuw voorzichtig naar de zijkant van het preparaat te trekken. Bij het terugtrekken van de hoofdzenuw over de extensorspier moeten mogelijk kleine vertakkingen van het inhiberende axon worden doorgesneden.De zenuwbundel kan worden gevisualiseerd met methyleenblauwkleuring. Methyleenblauw zou echter niet worden gebruikt voor elektrofysiologische registraties in deze bovenste afbeelding. Rode pijlen markeren het zenuwtraject van belang.De zenuwbundel waar we ons op richten, is de grotere bundel die aftakt van de hoofdzenuw van het poot nabij het proximale uiteinde van het merepod. Let op de vertakking van de axonen en de twee duidelijk zichtbare axonen binnen de zenuw. Nu de zenuw en spier zijn blootgelegd, kan de apparatuur voor het experiment worden voorbereid.De intra- en extracellulaire opnames worden uitgevoerd met een standaard headstage en versterker. We gebruiken een Axon Clamp 2B-versterker en een 1XLU headstage. Er zijn drie elektroden nodig: één intracellulaire en twee extracellulaire.De twee extracellulaire elektroden zullen worden gebruikt om de zenuw te stimuleren en om synaptische opgewekte en spontane qual-gebeurtenissen te registreren. Vlampolish de focale elektroden en buig ze lichtjes over een verwarmingselement. Nadat een focale elektrode met zoutoplossing is gevuld, wordt deze in de houder voor de stimulerende elektrode geplaatst en wordt de stimulatiedraad ingevoerd zodat deze contact maakt met de zoutoplossing.Dit is verbonden met een grass P 15 stimulatie-isolatie-eenheid, die op zijn beurt is verbonden met een S 88 grass stimulator. Tijdens elektrofysiologische opnames wordt de vitale kleurstof voor D twee ASP gebruikt om de axonen te visualiseren; om de axonen te kleuren, wordt de baadzoutoplossing gedurende vijf minuten vervangen door een zoutoplossing die vijf micromolair vier D twee as per dye bevat. Na vijf minuten wordt het schaaltje opnieuw gevuld met de fysiologische zoutoplossing voor rivierkreeften, waarna de preparatie onder een microscoop wordt geplaatst met gebruik van een Forex-objectief.Verplaats bij een 10x oculair de stimulerende elektrode naar het gebied van belang. De volgende stap is om het lumen van de macro-patch stimulerende elektrode op het fasische of het tonische axon te plaatsen. Deze foto van een preparaat dat met vier kleurstoffen en twee as-kleurstoffen is gekleurd, laat zien dat het tonische axon helderder zichtbaar is vanwege het verhoogde mitochondriële gehalte.Onder fluorescentiemicroscopie vertonen de tonische terminals talrijke varicositeiten, terwijl de fasische terminals een dunnere structuur hebben. Met het 20 x objectief wordt de elektrode op ofwel het tonische of het fasische axon geplaatst. Hier wordt de elektrode op het tonische axon geplaatst.Plaats de intracellulaire elektrode in de micromanipulator en breng de intracellulaire elektrode vervolgens in een extracellulaire spiercel. Deze zal worden gebruikt om intracellulaire excitatoire postsynaptische potentialen of EPSP's te registreren. Voor het registreren van kwalitatieve EPSP's.Plaats de tweede focale elektrode in een micromanipulator. Dit gebeurt door de vorige intracellulaire elektrode en houder te verwijderen en deze te vervangen door de schone elektrodehouder. Gebruik de micromanipulator om het lumen van de tweede focale elektrode direct boven een synaptische varicositeit te plaatsen.De elektrode- en sealweerstand worden bepaald door teststroompulsen door de elektrode te sturen. In onze experimenten varieerden de sealweerstanden van 0,3 tot 1 MΩ en de elektrodeweerstand van 0,5 tot 1 MΩ. De sealweerstand kan gedurende de gehele opname worden gemonitord.Wanneer u klaar bent om met de stimulatie te beginnen, start u de Scope 5.0-software en begint u met het stimuleren van het geïsoleerde axon. In het zenuwbundel wordt het tonische axon gestimuleerd door de zuigelektrode en worden de EPSP's van de spiervezel geregistreerd met een intracellulaire of extracellulaire elektrode. De EPSP's worden via een PowerLab-interface naar een computer geregistreerd.Na stimulatie van het tonische axon kan de stimulerende elektrode naar het fasische axon worden verplaatst en kan het experiment worden herhaald na zenuwstimulatie. De intracellulaire elektrode registreert EPSP's die worden gegenereerd als reactie op zowel tonische als fasische activiteit van de motorische neuronen. Synaptische facilitatie van de tonische neuromusculaire overgangen is afhankelijk van de frequentie van de zenuwstimulatie, zoals hier getoond voor opeenvolgende treinen van ongeveer 20 stimuli per trein bij een frequentie van 60 hertz.Let op de facilitatie die optreedt bij meerdere stimuli. Deze figuur vergelijkt de amplitudes van de EPSP's die worden gegenereerd door stimulatie van de tonische zenuw bij frequenties van 20 hertz in het blauw, 40 hertz in het groen en 60 hertz in het rood; let op de duidelijke facilitatie die zichtbaar is bij hogere stimulatiefrequenties. Tonische terminalen hebben een lage synaptische efficiëntie, maar vertonen de getoonde dramatische gefaciliteerde responsen.Hier zijn enkel de tonische EPSP's, waarna de fasische responsen op dezelfde schaal zijn overgelegd. In tegenstelling tot de tonische uiteinden hebben de fasische uiteinden een hoge kwalitatieve efficiëntie, maar vertonen zij synaptische depressie bij hoogfrequente stimulatie. Synaptische depressie bij de fasische uiteinden is, zoals hier getoond, eveneens gerelateerd aan de stimulatiefrequentie.Een continue stimulatie van vijf hertz gedurende 30 minuten onderdrukt de respons bij de neuromusculaire overgang. Bij een hogere stimulatiefrequentie zal het preparaat bij passende stimulatie sneller onderdrukt worden. De neuromusculaire overgang van de rivierkreeft genereert niet-spiking EPSP's.Deze EPSP's kunnen worden gebruikt om de qual-eigenschappen te onderzoeken die de gegradeerde elektrische signalen in deze spieren vormen. Hier worden de qual-synaptische responsen van de tonische terminaal getoond. Let op dat niet alle stimulatiepogingen resulteren in een qual-gebeurtenis.Directe telling van quantale events is mogelijk bij stimulatie met een lage frequentie voor elke opgewekte respons. Het aantal quantale events kan eenvoudig worden bepaald voor de tonische uiteinden. Door quantale events te tellen, kunnen de synaptische responsen van het fasische motorneuron op dezelfde wijze worden geregistreerd.De opgewekte responsen zijn echter van multi-qual aard. De gemiddelde qual-inhoud wordt geschat door de gemiddelde amplitude of het oppervlak van de deflecties te gebruiken, samen met de gemiddelde piekamplitude of het oppervlak van spontane gebeurtenissen. Ter laatste herinnering: wees voorzichtig bij het verwijderen van de flexorspier om te voorkomen dat de zenuw wordt beschadigd bij het blootleggen van de extensorspier.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

physiological-recordings-high-low-output-nmjs-on-crayfish-leg

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Toepassing van elektrofysiologie toegankelijke synapsen biedt een kwantificeerbare maat van synaptische activiteit, nuttig bij het analyseren van synaptische mutanten. Dit artikel beschrijft een dissectie methode die wordt gebruikt om de neuromusculaire verbindingen (NMJ) van...

Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Niet-invasieve metingen van neurale activiteit patronen in vrij gedragen dieren zijn verkregen door het combineren van neurofysiologische-opnamen met hoge snelheid videografie.

Opnamen van Neurale Circuit Activering in vrij Behaving Dieren

De opener spier van de rivierkreeft been wordt gepresenteerd voor het historisch belang en experimentele veelzijdigheid in de spieren fenotype, synaptische fysiologie en plasticiteit.

Bekijk de historische en fysiologie demonstratie op het NMJ van de rivierkreeft Opener Muscle

De experimenten tonen aan een eenvoudige benadering voor studenten om ervaring op te doen bij de behandeling van spier-structuur, de synaptische reacties, de effecten van de ion gradiënten en permeabiliteit op membraan mogelijkheden. Ook is een zintuiglijke-CNS-motor-spier circuit voorgelegd aan een middel om effecten van de verbindingen op een neuronale circuit test tonen.

Membraan Potentials, Synaptic Responses, neuronale circuits, Neuromodulatie en Muscle Histologie Met behulp van de rivierkreeftjes: Student Laboratorium Oefeningen

Het primaire doel van dit experiment is om te begrijpen hoe de primaire sensorische neuronen informatie van gezamenlijke bewegingen en posities als proprioceptieve informatie voor een dier over te brengen. Een bijkomende doelstelling van dit rapport aanwezig is de anatomie van de voorbereiding door dissectie en het bekijken van neuronen in een dissectie microscoop.

Muscle Receptor Orgels in de rivierkreeftjes Buik: Een Student Laboratorium Oefening in Proprioceptie

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Fysiologische en anatomische technieken worden gedemonstreerd aan functie en structuur voor gezamenlijke proprioceptoren en spierspanning receptoren in schaaldieren wandelen ledematen te pakken.

Proprioceptie en Tension Receptoren in Crab Ledematen: Student Laboratorium Oefeningen

Muscle sensorische neuronen betrokken zijn bij proprioceptor signaleren en rapporteren over metabole toestand en verwondingen gerelateerde gebeurtenissen. We beschrijven een volwassen muis in vitro spier-zenuw voorbereiding op studies over-stretch geactiveerde spieren afferenten.

Een In Vitro Adult Mouse spier-zenuw Voorbereiding voor het bestuderen van de Firing Eigenschappen van Muscle afferenten

Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Gepresenteerd is een protocol om verschillende soorten mediane zenuw (MN) laesies te produceren en reparatie in de rat. Bovendien laat het protocol zien hoe het functionele herstel van de zenuw kan worden geëvalueerd met behulp van verschillende niet-invasieve gedragstests en fysiologische metingen.

Functionele en fysiologische methoden voor de evaluatie van mediane zenuwregeneratie in de rat

Leer elektrofysiologische opnamen van synaptische reacties op de extensormusculatuur van rivierkreeften. Deze methode onderscheidt tonische en fasische motorische zenuwuiteinden morfologisch en fysiologisch.

Fysiologische Opnamen van hoge en lage Output NMJs op de Crayfish Leg Extensor Muscle

Meer video's verkennen