Fysiologische Opnamen van hoge en lage Output NMJs op de Crayfish Leg Extensor Muscle

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe de fasische en tonische motorische uiteinden in de strekspier van de rivierkreeft kunnen worden blootgelegd en onderscheiden met morfologische kleuring en elektrofysiologische registratie. Dit wordt bereikt door eerst het eerste of tweede loopbeen van een middelgrote rivierkreeft af te knijpen, de cuticula weg te snijden en de buigspier in het meite-segment te verwijderen. Hierdoor komen de strekspier en het zenuwbundel vrij.

De tweede stap van de procedure is het kleuren van het preparaat met vier ethylamino-acridine-methaangesulfate en methylperloidaat-jodide, of 4-D2-ASP, om de axonen en zenuwuiteinden te visualiseren. De derde stap van de procedure is het selectief stimuleren van tonische en/of fasische neuronen, terwijl gelijktijdig intracellulaire registraties van opgewekte EPSP's in de spiervezel worden uitgevoerd. De laatste stap van de procedure is het gebruik van een focale elektrode om spontane en opgewekte qu-gebeurtenissen vanuit de uiteinden te registreren.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die tonische en fasische uiteinden scheiden, zowel morfologisch als fysiologisch, middels immunofluorescentiemicroscopie en elektrofysiologie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de synaptische fysiologie in gebieden zoals spiervermoeidheid, synaptische depressie en synaptische crosstalk. Het experiment begint met het voorzichtig oppakken van de rivierkreeft, waarbij de scharen worden vermeden.

Scheid de poot van het lichaam bij het isia pod-segment. Een krachtige knijpbeweging bij het isia pod-segment stimuleert de rivierkreeft om de eerste loop-poot te automiseren of op natuurlijke wijze af te breken. De rivierkreeft zal stoppen met bloeden en wordt teruggeplaatst in het opvangreservoir.

De rivierkreeft wordt niet gedood. Plaats de poot op een stukje keukenpapier, zodat de preparaat gemakkelijk kan worden gedraaid tijdens het maken van de incisies. Draai de poot om totdat de buitenkant, de laterale zijde, naar boven is gericht op de dissectieplaat.

Over het algemeen is de gebogen zijde naar boven gericht. Ets met een scherp scheermesje, bevestigd aan een scalpelbladbreker, de cuticula binnen het meite-segment door het patroon in de figuur te volgen. Let erop dat u bij de dorsaal-ventrale snede langs het meite-carpusgewricht niet te ver distaal snijdt.

Deze snede resulteert in een venster in het exoskelet boven de onderliggende pootspieren. Laat de cuticula voorlopig op zijn plaats. Plaats het preparaat in een dissectieschaal met fysiologische zoutoplossing voor kreeften.

Plaats op dit punt met een fijne pincet een speld in het midden van het carpod-segment en in het dorsale aspect van het ischiapod-segment, til het in de cuticula gesneden venster bij het distale uiteinde iets op en snijd met het scheermesje de vezels van de flexormusculatuur los van de cuticula. Ga door met snijden in distale naar proximale richting en til tot slot het venster van de cuticula weg. Om de extensormusculatuur bloot te leggen, moet de bovenliggende flexormusculatuur worden verwijderd.

Scheid de pees van de flexormuskel door deze met een pin te verschuiven van de flexormuskel. Snijd vervolgens de pees door bij het Mari poddy carpod gewricht. Wees, zoals getoond, zeer voorzichtig om de pees weg te trekken van de beensholte voordat u de snede maakt, en snijd alleen de pees door en niet de hoofdbeenzenuw die zich aan de binnenzijde van de pees bevindt.

Klem de pees op de plek waar deze is doorgesneden met een pincet en trek de flexorspier van het pootje los door deze in een krullende beweging op te tillen. Om de zenuw naar de extensorspier bloot te leggen, dient de hoofdzenuw van het pootje bij het merepodaal-carpaal gewricht te worden doorgesneden, waarna de hoofdzenuw voorzichtig over de extensorspier naar achteren wordt getrokken. De scheiding van de zenuw naar de extensorspier van de hoofdzenuw van het pootje kan worden vergemakkelijkt door de distale stomp van de hoofdzenuw voorzichtig naar de zijkant van het preparaat te trekken. Bij het terugtrekken van de hoofdzenuw over de extensorspier moeten mogelijk kleine vertakkingen van het inhiberende axon worden doorgesneden.

De zenuwbundel kan worden gevisualiseerd met methyleenblauwkleuring. Methyleenblauw zou echter niet worden gebruikt voor elektrofysiologische registraties in deze bovenste afbeelding. Rode pijlen markeren het zenuwtraject van belang.

De zenuwbundel waar we ons op richten, is de grotere bundel die aftakt van de hoofdzenuw van het poot nabij het proximale uiteinde van het merepod. Let op de vertakking van de axonen en de twee duidelijk zichtbare axonen binnen de zenuw. Nu de zenuw en spier zijn blootgelegd, kan de apparatuur voor het experiment worden voorbereid.

De intra- en extracellulaire opnames worden uitgevoerd met een standaard headstage en versterker. We gebruiken een Axon Clamp 2B-versterker en een 1XLU headstage. Er zijn drie elektroden nodig: één intracellulaire en twee extracellulaire.

De twee extracellulaire elektroden zullen worden gebruikt om de zenuw te stimuleren en om synaptische opgewekte en spontane qual-gebeurtenissen te registreren. Vlampolish de focale elektroden en buig ze lichtjes over een verwarmingselement. Nadat een focale elektrode met zoutoplossing is gevuld, wordt deze in de houder voor de stimulerende elektrode geplaatst en wordt de stimulatiedraad ingevoerd zodat deze contact maakt met de zoutoplossing.

Dit is verbonden met een grass P 15 stimulatie-isolatie-eenheid, die op zijn beurt is verbonden met een S 88 grass stimulator. Tijdens elektrofysiologische opnames wordt de vitale kleurstof voor D twee ASP gebruikt om de axonen te visualiseren; om de axonen te kleuren, wordt de baadzoutoplossing gedurende vijf minuten vervangen door een zoutoplossing die vijf micromolair vier D twee as per dye bevat. Na vijf minuten wordt het schaaltje opnieuw gevuld met de fysiologische zoutoplossing voor rivierkreeften, waarna de preparatie onder een microscoop wordt geplaatst met gebruik van een Forex-objectief.

Verplaats bij een 10x oculair de stimulerende elektrode naar het gebied van belang. De volgende stap is om het lumen van de macro-patch stimulerende elektrode op het fasische of het tonische axon te plaatsen. Deze foto van een preparaat dat met vier kleurstoffen en twee as-kleurstoffen is gekleurd, laat zien dat het tonische axon helderder zichtbaar is vanwege het verhoogde mitochondriële gehalte.

Onder fluorescentiemicroscopie vertonen de tonische terminals talrijke varicositeiten, terwijl de fasische terminals een dunnere structuur hebben. Met het 20 x objectief wordt de elektrode op ofwel het tonische of het fasische axon geplaatst. Hier wordt de elektrode op het tonische axon geplaatst.

Plaats de intracellulaire elektrode in de micromanipulator en breng de intracellulaire elektrode vervolgens in een extracellulaire spiercel. Deze zal worden gebruikt om intracellulaire excitatoire postsynaptische potentialen of EPSP's te registreren. Voor het registreren van kwalitatieve EPSP's.

Plaats de tweede focale elektrode in een micromanipulator. Dit gebeurt door de vorige intracellulaire elektrode en houder te verwijderen en deze te vervangen door de schone elektrodehouder. Gebruik de micromanipulator om het lumen van de tweede focale elektrode direct boven een synaptische varicositeit te plaatsen.

De elektrode- en sealweerstand worden bepaald door teststroompulsen door de elektrode te sturen. In onze experimenten varieerden de sealweerstanden van 0,3 tot 1 MΩ en de elektrodeweerstand van 0,5 tot 1 MΩ. De sealweerstand kan gedurende de gehele opname worden gemonitord.

Wanneer u klaar bent om met de stimulatie te beginnen, start u de Scope 5.0-software en begint u met het stimuleren van het geïsoleerde axon. In het zenuwbundel wordt het tonische axon gestimuleerd door de zuigelektrode en worden de EPSP's van de spiervezel geregistreerd met een intracellulaire of extracellulaire elektrode. De EPSP's worden via een PowerLab-interface naar een computer geregistreerd.

Na stimulatie van het tonische axon kan de stimulerende elektrode naar het fasische axon worden verplaatst en kan het experiment worden herhaald na zenuwstimulatie. De intracellulaire elektrode registreert EPSP's die worden gegenereerd als reactie op zowel tonische als fasische activiteit van de motorische neuronen. Synaptische facilitatie van de tonische neuromusculaire overgangen is afhankelijk van de frequentie van de zenuwstimulatie, zoals hier getoond voor opeenvolgende treinen van ongeveer 20 stimuli per trein bij een frequentie van 60 hertz.

Let op de facilitatie die optreedt bij meerdere stimuli. Deze figuur vergelijkt de amplitudes van de EPSP's die worden gegenereerd door stimulatie van de tonische zenuw bij frequenties van 20 hertz in het blauw, 40 hertz in het groen en 60 hertz in het rood; let op de duidelijke facilitatie die zichtbaar is bij hogere stimulatiefrequenties. Tonische terminalen hebben een lage synaptische efficiëntie, maar vertonen de getoonde dramatische gefaciliteerde responsen.

Hier zijn enkel de tonische EPSP's, waarna de fasische responsen op dezelfde schaal zijn overgelegd. In tegenstelling tot de tonische uiteinden hebben de fasische uiteinden een hoge kwalitatieve efficiëntie, maar vertonen zij synaptische depressie bij hoogfrequente stimulatie. Synaptische depressie bij de fasische uiteinden is, zoals hier getoond, eveneens gerelateerd aan de stimulatiefrequentie.

Een continue stimulatie van vijf hertz gedurende 30 minuten onderdrukt de respons bij de neuromusculaire overgang. Bij een hogere stimulatiefrequentie zal het preparaat bij passende stimulatie sneller onderdrukt worden. De neuromusculaire overgang van de rivierkreeft genereert niet-spiking EPSP's.

Deze EPSP's kunnen worden gebruikt om de qual-eigenschappen te onderzoeken die de gegradeerde elektrische signalen in deze spieren vormen. Hier worden de qual-synaptische responsen van de tonische terminaal getoond. Let op dat niet alle stimulatiepogingen resulteren in een qual-gebeurtenis.

Directe telling van quantale events is mogelijk bij stimulatie met een lage frequentie voor elke opgewekte respons. Het aantal quantale events kan eenvoudig worden bepaald voor de tonische uiteinden. Door quantale events te tellen, kunnen de synaptische responsen van het fasische motorneuron op dezelfde wijze worden geregistreerd.

De opgewekte responsen zijn echter van multi-qual aard. De gemiddelde qual-inhoud wordt geschat door de gemiddelde amplitude of het oppervlak van de deflecties te gebruiken, samen met de gemiddelde piekamplitude of het oppervlak van spontane gebeurtenissen. Ter laatste herinnering: wees voorzichtig bij het verwijderen van de flexorspier om te voorkomen dat de zenuw wordt beschadigd bij het blootleggen van de extensorspier.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.