Membraan Potentials, Synaptic Responses, neuronale circuits, Neuromodulatie en Muscle Histologie Met behulp van de rivierkreeftjes: Student Laboratorium Oefeningen

De algemene doelen van de volgende experimenten zijn om de eigenschappen van excitabele membranen en de ionische basis van het rustmembraanpotentiaal te begrijpen, en om methoden te leren om het membraanpotentiaal te meten en om eigenschappen van synaptische transmissie aan te tonen. In een deel van het experiment zal het rustmembraanpotentiaal worden gemeten terwijl extracellulair kalium wordt gewijzigd. In een ander deel van het experiment zullen mechanismen van synaptische differentiatie worden onderzocht door gestimuleerde synaptische reacties in verschillende motorische eenheden op te nemen.

Vervolgens wordt een zenuwcircuit gepresenteerd dat gemakkelijk te onderhouden is. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het onderwijzen en onderzoeken van verschillende aspecten van een sensorisch naar CNS naar motorisch neuron naar spiercircuit. Deze reeks experimenten toont de eenvoud van het gebruik van het rivierkreeftmodel om kwesties te behandelen met betrekking tot membraanpotentiaal synaptische integratie en transmissie, en structurele verschillen van spiervezeltypen.

De belangrijkste voordelen van het gebruik van de rivierkreeftvoorbereiding bij het onderwijzen van elektrofysiologische concepten en technieken zijn de eenvoud van dissectie, de levensvatbaarheid van de voorbereiding van minimale zoutoplossing, de gemakkelijke verkrijging van synaptische reacties en de eenvoud van het onderscheiden van de algehele anatomische rangschikking van de spieren. Deze technieken kunnen ook op andere voorbereidingen worden toegepast en zullen ons begrip van synaptische fysiologie en modulatie en biochemische en structurele verschillen in de gedemonstreerde voorbereiding bevorderen. Om de operatie te beginnen, selecteert u een rivierkreeft van ongeveer zes tot 10 centimeter lichaamslengte en plaatst u deze vijf minuten in gemalen ijs om deze te verdoven om de rivierkreeft te onthoofden, houdt u deze van achteren vast en zorgt u ervoor dat uw vingers buiten bereik blijven van de klauwen en mond van de rivierkreeft met behulp van grote scharen.

Verwijder snel het hoofd door een schone snede te maken van achter de ogen van de rivierkreeft, verwijder de poten en klauwen van de rivierkreeft om verwondingen te voorkomen. Verwijder de stijl op mannen en de zwempootjes op zowel mannen als vrouwen. Gooi het hoofd en de aanhangsels weg.

Vervolgens scheidt u het abdomen van de thorax door een snede te maken langs de articulaire membraan die het abdomen en de thorax verbindt. Bewaar het abdominale deel van de rivierkreeft en gooi de thorax weg, richt de schaar iets naar beneden op de ventrale kant en maak op een hoek een snede in de schaal langs de onderste laterale rand van elke zijde van het abdomen. Wees voorzichtig om niet te diep in de rivierkreeft te snijden.

Volg het natuurlijke schaalpatroon van lijnen van de rivierkreeft die de lengte van elk segment lopen. Gebruik een pincet. Verwijder het ventrale deel van de schelp door het omhoog en terug te trekken. Zorg ervoor dat de buikspieren niet worden vernietigd.

Verwijder de flexorspieren. Op dit punt is een witte massa weefsel te zien bovenop de diepe flexorspieren. Verwijder dit weefsel voorzichtig met een pincet.

Het maagdarmkanaal is nu zichtbaar als een kleine buis die langs de middenlijn van de diepe flexorspieren loopt. Verwijder het door het met een pincet bovenaan te knijpen en van het abdomen te trekken. Snijd de onderkant van het maagdarmkanaal aan het einde van de staart.

Spoel de dissectie met zoutoplossing om ervoor te zorgen dat fecale afvalstoffen de voorbereiding niet storen. Gebruik dissectiepennen om de bovenste en onderste hoeken van de voorbereiding op een S-guard gecoate petrischaal te spelden. De buikspierspieren zijn nu blootgelegd.

Plaats zoutoplossing in de petrischaal om de voorbereiding te bedekken totdat intracellulaire opnames worden uitgevoerd. Verplaats de petrischaal naar de microscoop en gebruik was onder de schaal om te voorkomen dat deze beweegt. De apparatuur die wordt gebruikt voor intracellulaire opnames is weergegeven in deze figuur.

De juiste verbindingen en instellingen worden gegeven in de bijbehorende tekst. Zet de labchartsoftware op volgens de instructies. Plaats in de bijbehorende tekst de aarddraad in het zoulbaad.

Plaats de punt van een glazen micropipet gevuld met drie molaire kaliumchloride in het zoulbaad en test de elektrodeweerstand. De elektrodeweerstand moet 20 tot 60 mega ohm zijn. Gebruik de grove knop op de versterker om de lijn op de labchart naar nul te verplaatsen onder hoog intensiteitslicht.

Kijk door de microscoop en identificeer de longitudinale DEM-spieren. Gebruik de elektrode sonde om de intracellulaire elektrode in een spiervezel van de DEM-spier te steken. De elektrode moet nauwelijks in het spiervezel worden gestoken.

Wees voorzichtig om niet door de cel heen te dringen. Meet de amplitude van het rustpotentiaal. Sleep de M-cursor naar de trace vanaf de locatie in de linkerbenedenhoek van het grafiekvenster.

Plaats de marker M op de basislijn en verplaats de cursor naar het laagste punt op het opgenomen signaal. Het verschil tussen de marker en de actieve cursor wordt weergegeven in de bovenste rechterkant van het scherm. Deze waarde is de spanning van het rustmembraanpotentiaal.

Deel de opgenomen spanning door de hoeveelheid versterking in dit geval werd 10 x versterking gebruikt. Converteer vervolgens de spanning van volt naar millivolt. Nadat het rustpotentiaal voor dat spiervezel is opgenomen, kijkt u door de microscoop en verwijdert u voorzichtig de elektrode uit het spiervezel.

Herhaal de intracellulaire opname op andere spiervezels. Het volgende deel van dit experiment zal het effect van het verhogen van de extracellulaire kaliumconcentratie op het rustmembraan controleren. Er zullen zes rivierkreeftzoutoplossingen worden gebruikt met kaliumconcentraties van 5,4 20, 40, 60, 80 en 100 millimolair.

Kies een spier die niet trilt voor de volgende intracellulaire opname tussen opnames. Vervang de badoplossing door de volgende hogere concentratie kaliumchlorideoplossing. Zorg ervoor dat de voorbereiding elke keer volledig wordt bedekt.