Modelleren van biologische membranen met Circuit Boards en meten van elektrische signalen in Axonen: Student Laboratorium Oefeningen

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe biologische membranen kunnen worden begrepen aan de hand van elektrische modellen en om procedures te demonstreren voor het registreren van actiepotentialen uit het ventrale zenuwstreng van de rivierkreeft. Deze demonstratie maakt eerst gebruik van componenten van een circuit op een breadboard om de elektrische eigenschappen van membranen weer te geven. De tweede stap van de procedure is het variëren van de weerstand en capaciteit in een modelcircuit om de effecten op de spanningscurven te observeren.

De derde stap van de procedure is het toepassen van concepten die zijn geleerd van een modelcircuit op een preparaat van een levende zenuw. De laatste stap van de procedure is het registreren van samengestelde actiepotentialen en het begrijpen van de eigenschappen van drempelrefractaire perioden en synaptische transmissie. Uiteindelijk laten de resultaten zien hoe het bestuderen van modellen van elektrische circuits van biologische membranen en de eigenschappen van levende zenuwen nuttige hulpmiddelen voor het onderwijs kunnen zijn, zoals aangetoond door het wijzigen van de componenten van een modelcircuit en door het variëren van de stimulatie van de levende zenuw.

Deze methode kan inzicht bieden in hoe biologische membranen kunnen worden begrepen aan de hand van elektrische modellen. Het kan ook worden toegepast op andere weefsels, zoals spierweefsel. Een demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de dissectie van het ventrale zenuwstreng en de registratie-opstelling in het begin lastig kunnen zijn; er moet zorgvuldig worden gewerkt om beschadiging van de zenuwen te voorkomen, zodat een goede opstelling wordt verkregen voor het stimuleren en registreren van de zenuwstreng.

In het eerste deel van het experiment worden weerstanden en condensatoren gebruikt om de elektrische activiteit van het zenuwcelmembraan te simuleren. De initiële schakeling bevat alleen weerstanden. Condensatoren worden in een latere stap toegevoegd.

De passieve resistieve eigenschappen van het zenuwmembraan worden weergegeven door het hier getoonde circuit. Het breadboard is opgezet met parallelle weerstanden van 33 kilo ohm, die de transversale membraanweerstand vertegenwoordigen, en serieschakelingen van weerstanden van 10 kilo ohm die de intracellulaire weerstand vertegenwoordigen. Dit circuit gaat ervan uit dat de weerstand van het externe vloeistof medium verwaarloosbaar is in vergelijking met de intracellulaire en transversale membraanweerstanden.

Wanneer uw modelcel voltooid is, sluit u de uitgangsdraden van de power lab aan op het model op het breadboard. De power lab genereert de stimulus en beschikt over een meetsonde voor het registreren van de spanning. Sluit vervolgens de power lab aan op de computer.

De computer wordt gebruikt om de elektrische signalen weer te geven die vanaf het breadboard zijn geregistreerd. De volgende stap is het instellen van de computersoftware die de stimulus aanstuurt die door de power lab naar de modelzenuwcel wordt gestuurd. Open het lab chart-programma vanaf het bureaublad.

Selecteer een nieuw bestand, selecteer setup en vervolgens de kanaalinstellingen. Selecteer het kanaal dat moet worden weergegeven en selecteer daarna het stimulatorpaneel. Lange pulsen van 1,5 volts zijn vereist.

Stel voor dit deel van het experiment de amplitude in op één volt. De power lab zal een spanning uitzenden die schommelt tussen positieve en negatieve 0,5 volt, wat resulteert in een piek-tot-piekstimulatie van één volt. Stel de frequentie in op 0,75 hertz en de polsduur op één seconde.

Selecteer voor de kanaalinstellingen kanaal één om te monitoren, klik op de ingangversterker en klik in het vak op de knop voor differentieel en stel het bereik in op vijf volt en selecteer OK. De volgende stap is het aanbrengen van een elektrisch signaal op het zenuwcelmodel en het onderzoeken van het signaalverlies over de lengte van het model. Breng een spanning aan aan één uiteinde van het circuit tussen A en B door op start te klikken op de computer.

Meet de spanning voor de eerste eenheidslengte langs het modelaxon en monitor deze op de computer. Houd de rode kabel van de spanningsmeetsonde stationair op punt A op het breadboard, terwijl u de andere kabel naar verschillende locaties tussen de in serie geschakelde weerstanden verplaatst. Let op de spanningsval bij de meer afgelegen locaties.

Stop nu de opname door op stop op de computer te klikken. Meet de opgeslagen spanningsverschillen op de sporen die op de computer zijn opgeslagen door de cursor te gebruiken om het spoor naar elke geregistreerde puls te verplaatsen. Gebruik de M-markeercursor in de linkerbenedenhoek om de onderkant van het spoor te markeren en plaats de vrije cursor op de piek van het spoor om het spanningsverschil te meten.

Lees de meting van het spanningsverschil op het scherm af en noteer deze in uw notebook voor elke meetlocatie langs het circuit. De volgende stap is het berekenen van de lengteconstante voor de modelcel, die wordt gebruikt om het exponentiële verval van het signaal over de afstand te beschrijven. Zet elke waarde van het spanningsverschil uit in een grafiek van het potentiaalverschil tegenover de afstand vanaf de bron, waarbij de membraanweerstanden als één eenheid worden beschouwd.

Bepaal, naast uw grafiek, de lengteconstante van dit circuit. De lengteconstante van een zenuwvezel is gedefinieerd als de afstand over welke een potentiaalverschil over het membraan afneemt tot 37% van de oorspronkelijke waarde op het punt van oorsprong. Om de passieve kabeleigenschappen van zenuw- en spiervezels beter te simuleren, zal de modelzenuwcel worden uitgebreid om zowel resistieve als capacitieve componenten te bevatten.

Naast de aanwezigheid van een transversale membraanweerstand in het zenuwcelmembraan is er ook sprake van een oppervlakte-membraancapaciteit, die het signaal van de zenuwcel vervormt. Om dit te simuleren, worden 10 micro-farad condensatoren parallel aan het transversale membraan geplaatst. Weerstanden op het breadboard op de computer.

Stel de stimulator in op één seconde, één volt, wat neerkomt op een amplitudinstelling van 0,5 volt en pulsen van 0,75 hertz. Stel daarnaast in de rechterbovenhoek van het paneel de acquisitiesnelheid in op 20 K per seconde. Klik vervolgens op kanaal één aan de rechterkant van het scherm.

Klik op de ingangsversterker in het vak. Klik op de differentiaalknop en stel het bereik in op vijf volt. Klik op oké.

Klik op start om deze wijzigingen op te slaan en te beginnen met het verzamelen van gegevens. Meet de gegevens op dezelfde punten op het breadboard. Gebruik na de gegevensverzameling het zoomvenster om de stijgtijd van een van de blokgolven te vergroten.

Herhaal het inzoomen indien nodig om het spoor verder uit te spreiden. Meet de tijd die het signaal nodig heeft om van de basislijn naar de top van het voltagespoor te stijgen, precies op het moment dat het afvlakt.

Observe het tijdsverloop van de potentiaalverandering en de vervorming van de vierkante pulsen. Noteer daarnaast of de gemeten spanning boven de 0,2 volt ligt met behulp van de M-cursor en de vrije cursor zoals voorheen; lees de spanningsverandering af en noteer de gegevens in uw notebook, waarbij de drempelspanning wordt gesteld op 0,2 volt. Meet de tijd die de potentiaal nodig heeft om de drempelwaarde te bereiken bij elke membraanweerstand.

Zet uw resultaten uit als tijd tegenover afstand en onthoud dat een toename in de dikte van de myelineschede leidt tot een afname van de membraancapaciteit. Simuleer dit door de 10 µF condensatoren op het breadboard te vervangen door kleinere 0,1 µF condensatoren. Herhaal het vorige experiment.

Let op de verandering in de tijd om de drempelwaarde te bereiken bij een geselecteerde weerstand. Leg de gegevens met de grotere condensatoren over de vorige grafiek van tijd versus afstand. Een toename van de dikte van de myelineschede zorgt ervoor dat elektrische signalen in een zenuwcel sneller stijgen en dalen, waardoor de geleidingssnelheid toeneemt.

In het volgende deel van het experiment worden de elektrochemische eigenschappen van axonen in het ventrale zenuwstreng van de rivierkreeft onderzocht. De eigenschappen van passieve stroomverspreiding die in de modelcircuits worden gepresenteerd, worden ook waargenomen in levende preparaten. Echter is een actiepotentiaal nodig telkens wanneer een signaal over een afstand van enkele millimeters moet worden overgedragen, omdat de passieve elektrische eigenschappen van cellen de signalen over deze afstand zouden dempen.

Wanneer signalen met verschillende geleidingssnelheden door het ventrale zenuwstreng van de rivierkreeft reizen, zullen de snelste signalen als eerste worden waargenomen en de tragere signalen iets later. Afhankelijk van de populatie axonen met vergelijkbare geleidingssnelheden zullen sommige signalen in de registratie samenvloeien. Dit gesommeerde elektrische signaal van meerdere axonen wordt een samengesteld actiepotentiaal genoemd.

De volgende reeks experimenten richt zich op het registreren van samengestelde actiepotentialen uit kreeftenzenuwen om het ventrale zenuwstreng van de kreeft te verkrijgen. Bereid eerst de dissectie-instrumenten voor het zenuwschaaltje en de zoutoplossingen voor. Plaats de kreeft ongeveer vijf minuten op ijs om deze te anesthetiseren.

Zodra de rivierkreeft is gebenestheseerd, wikkel je deze in een vochtig papieren handdoekje en houd je de kreeft in één hand vast, met de scharen tussen je duim en wijsvinger. Maak met de andere hand met de schaar een incisie door het rostrum tussen de oogkassen. Snijd vanaf de incisie naar beneden tot de kop volledig is afgescheiden.

Verwijder de klauwen en de loop poten. Maak een incisie aan de basis van de cephalische thorax boven het abdomen en scheid de cephalische thorax af. Verwijder de staart en de zwem vinnen.

Maak een insnijding aan beide zijden van de ventrale zijde van het abdomen. Wees voorzichtig om dieper gelegen weefsel niet te beschadigen. Pel het vrijgemaakte gedeelte van het exoskelet terug tot aan de basis van de staartwaaier om het ventrale zenuwstreng bloot te leggen.

Verwijder voorzichtig de ventrale zenuwstreng bij de punt met de rand van de pincet. Let erop dat u de zenuwstreng niet uitrekt of plet. Eventuele knobbels die op de zenuwstreng zichtbaar zijn, zijn ganglia van de rivierkreeft.

Leg het zenuwsnoer over de metalen staven in de zenuwkamer. Het is essentieel om het ventrale zenuwsnoer vochtig te houden. Voeg hiervoor voldoende crayfish-zoutoplossing toe aan de zenuwkamer tot het niveau van de metalen dwarsbalken is bereikt.

Pipette vervolgens voldoende van de rivierkreeften-zoutoplossing uit, zodat het vloeistofniveau net contact maakt met de onderkant van de staven. Zodra het zenuwstrenge op zijn plaats zit, bevestigt u de stimulatorkabel met de twee minihaakjes aan de zenuwkamer. Bevestig de positieve rode draad aan een van de externe metalen lussen nabij het uiteinde van het zenuwstreng en bevestig de negatieve zwarte draad aan de aangrenzende metalen lus die ook in contact staat met het zenuwstreng.

Gebruik de manipulator om de zuigelektrode nabij het uiteinde van de zenuw te positioneren, tegenover de negatieve en positieve aansluitingen. Zuig de punt van het ventrale zenuwstreng voorzichtig in de registreerelektrode. Sluit de elektrode aan op de headstage-probe door één draad van de zuigelektrode aan de positieve ingang van de probe te verbinden en de andere draad aan de negatieve ingang.

Het maakt niet uit welke draad naar welke ingang gaat. De probe kan worden geaard aan de kooi van Faraday of het zoutbad met behulp van een zilverchloride-draad, of kan worden aangesloten op de geaarde ingang van de differentiële versterker om potentiële 60 hertz-ruis te verminderen. Sluit de probe aan op de differentiële versterker en verbind de versterker met de power lab.

Controleer of de instellingen voor de versterker RS overeenkomen met de tabel in het bijbehorende artikel. Gebruik de USB-kabel om de power lab met de computer te verbinden. Open de scope-software op het bureaublad van de computer rechtsboven op het scherm.

Selecteer kanaal twee en schakel dit uit. Pas het scherm aan zodat alleen kanaal één zichtbaar is door de balk in het midden naar de onderkant van het scherm te slepen. Controleer de ingangsversterker met de instellingen die zijn gegeven in het bijbehorende artikel.

Select vervolgens bovenaan het scherm onder setup de stimulator, schakel isolated stem uit en stel de delay in op 5 milliseconden, de duration op 1 milliseconde, twee pulsen, een interval van 15 milliseconden, een range van 5 volt en een amplitude van 0,5 volt. Om de stimulatie van het ventrale zenuwsnoer te starten, klikt u op de startknop linksonder in het scherm. Er zou een duidelijk gedefinieerd actiepotentiaal moeten verschijnen in het kader voor de scope-dataverzameling.

Schets de algemene vorm van de actiepotentiaal in uw schrift. Verlaag langzaam het voltage met behulp van het tabblad linksboven in het scherm. De amplitude van de actiepotentiaal zou moeten afnemen totdat het karakteristieke golfpatroon verdwijnt.

Door het voltage te verlagen, wordt het aantal neuronen dat bijdraagt aan het samengestelde actiepotentiaal verminderd; om dit effect om te keren, moet het voltage stapsgewijs worden verhoogd. Naarmate er meer neuronen worden gerekruteerd, wordt de golf van het samengestelde actiepotentiaal groter. Deze oefening illustreert het feit dat individuele neuronen verschillende drempelwaarden hebben waarbij hun actiepotentialen worden uitgelokt.

Wanneer een verdere verhoging van de stimuleringsspanning de samengestelde actiepotentiaal niet meer doet toenemen, zijn alle neuronen gerekruteerd en zouden er twee duidelijke pieken in de actiepotentiaalgolf op het computerscherm zichtbaar moeten zijn. Het volgende deel van het experiment onderzoekt de refractaire periode van axonen. Wijzig de vertraging tussen de pulsen met behulp van het tabblad in de linkerbovenhoek van het scherm.

Blijf de vertraging verkorten totdat er geen tweede samengestelde actiepotentiaal meer kan worden opgewekt. De absolute refractaire periode wordt gedefinieerd als de tijdvertraging tussen pulsen waarbij een tweede actiepotentiaal niet langer wordt opgewekt. De relatieve refractaire periode wordt gedefinieerd als de tijd vanaf het einde van de absolute refractaire periode tot het moment waarop een tweede stimulus resulteert in een tweede actiepotentiaal met een volledige amplitude.

U kunt nu de eigenschappen van een gap-junction-remmer zoals heptanol onderzoeken. De verschillen in het samengestelde actiepotentiaal kunnen worden vergeleken bij dezelfde stimulatie-instellingen om te bepalen welke signalen via gap junctions langs het ventrale zenuwsnoer worden geleid. U zou ook koude zoutoplossing of warme zoutoplossing kunnen gebruiken en de verschillen in de geleidingssnelheden meten van de verschillende entiteiten die het samengestelde actiepotentiaal vormen.

Hier worden twee samengestelde actiepotentialen getoond die zijn geregistreerd vanuit het ventrale zenuwkoord van een rivierkreeft. Deze figuur illustreert de relatieve refractaire periode, namelijk de tijd na een volledig samengesteld actiepotential waarbij een tweede stimulus een kleiner samengesteld actiepotential uitlokt. Deze figuur toont de effecten van het gebruik van heptanol op het samengestelde actiepotential na deze procedure.

De componenten van het biologische membraankringcircuit kunnen worden gevarieerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van een gewijzigde dichtheid van lekkanalen in het membraan of de functie van spanningsafhankelijke kanalen na hun ontwikkeling. Deze technieken en procedures maken de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de fysiologie om te onderzoeken hoe cellen functioneren als elektrische circuits en hoe gap-junctions functioneren in levend weefsel bij dieren.