Name: Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer DNA-methylatiebepaling van genen in Arabidopsis-endosperm via bisulfietsequencing. Deze methode helpt onderzoekers genimprinting en epigenetische regulatie in planten te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken mevrouw Jennifer M. Lommel en Tara N. Rognan voor het onderhoud van Arabidopsis-planten. Dit werk werd ondersteund door start-up fondsen van Saint Louis University en de National Institutes of Health beurzen 1R15GM086846-01 en 3R15GM086846-01S1 aan W. Xiao.

I. Genetische Crossing 1. Emasculating de vrouwelijke ouder Met het oog op de moederlijke en vaderlijke allelen onderscheiden door gebruik te maken DNA-sequentie polymorfisme, twee verschillende ecotypes, bijvoorbeeld Columbia-0 (Col-0) en Ler, zal worden gekozen als vrouwelijke en mannelijke ouders. De planten moeten jong en gezond. Men kan ontmannen de vrouwelijke ouder met behulp van een dissectiemicroscoop, vergrootglas vizier, of blote oog. Zoek stage-12 bloemen (Smyth et al.., 1990) en verwijder alle bloemen of siliques boven en onder hen door het knippen van de basis van hoogte van de taille met de schaar. Steriliseren tang door dompelen de basis van de punt voorzichtig in een bekerglas van 95% ethanol, die elke stuifmeelkorrels zullen verwijderen op de tang en dood de pollen ook. Voorzichtig los te wrikken uit elkaar de bloemknoppen met behulp van pincet en verwijder voorzichtig 4 kelkbladen, 4 kroonbladen, en 6 meeldraden, waardoor de stamper kaal en intact. Probeer om schade aan de vruchtbladeren voorkomen dat tijdens dit proces. 2. Het kiezen van de pollen donor en het uitvoeren van bestuiving De beste pollen donors zijn anthesed open bloemen op het podium 14 met de bloemblaadjes te breiden in een hoek van 90 ° naar de stamper (Smyth et al.., 1990), waarin een veel stuifmeel is afwerpen. Pak de bloem aan de basis en net boven de taille, die zal leiden tot de bloem te verspreiden openen. Stof het stigma van de bereide stamper met de helmknop. Na de bestuiving, zal het stigma worden gedekt met de gele pollen, die gemakkelijk kan worden waargenomen onder een microscoop. 3. Etikettering van het kruis Na bestuiving van alle ontkracht stampers op een plant, we het etiket van het kruis met een sieraden-tag en de informatie van de vrouwelijke en mannelijke ouders en datum. Plaats een belang in de bodem dicht bij de plant, gebruik dan een string om de steel van de bloeiwijze koppelen aan de brandstapel, en de dekking van de bestoven stampers met een plastic zak. II. Isolatie van endosperm weefsels in Arabidopsis 1. Voorbereiden van materialen We krijgen meestal benodigde materialen klaar voor de oogst, het endosperm en embryo weefsels: een vloeibare stikstof tank, vloeibare stikstof, een dissectiemicroscoop, twee nieuwe paren van fijn-tip pincet (5 INOX FST door Dumont biologie, Zwitserland.), Microscoop objectglaasjes ( 3 "X een" X 1,0 mm), een pH 5,7 oplossing van 0.3 M sorbitol en 5 mM MES. 2. Verzamelen siliques Op 7 - of 8-dag-na-bestuiving (DAP), de zaden zijn klaar om te worden geoogst in het midden van de jaren torpedo stadium van de embryogenese en ontleed voor endosperm en embryo. Soms kan het nemen 90-10 DAP als de ontkracht bloemen zijn te jong. 3. Isoleren endosperm en embryo Omdat Arabidopsis zaden zijn klein, gebruiken we een dissectiemicroscoop om endosperm en embryo te isoleren. Zet een 8-DAP silique onder een microscoop, gebruik een pincet om de silique steeltje vast te houden en gebruik maken van de tip van een ander paar pincetten het openen van de schuif silique in de marge waar twee omwindselblaadjes zekering. Gebruik een tang op te halen een zaad op pH 5,7 oplossingen van 0.3 M sorbitol en 5 mM MES, maak een kleine snee aan het micropyle einde te glijden uit embryo, knijp de uncut einde te duwen uit endosperm en apart endosperm uit zaad jas (Kinoshita et al., 2004).. Zet het embryo en endosperm in afzonderlijke microbuisjes in vloeibare stikstof. Ga door met dit totdat we verzamelen embryo of endosperm 10-15 siliques en vervolgens de buis te slaan in een -80 ° C vriezer. In sommige gevallen, het endosperm niet hoeft te worden gescheiden van zaadhuid, dat wil zeggen, kan een isolaat totaal RNA van het endosperm en de zaadhuid mengsel voor gen-imprinting analyse. III. Bisulfiet Sequencing 1. Vereiste reagentia Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) voor het bereiden van genomisch DNA, restrictie-enzymen, 3 M NaOH (vers gemaakt), 6,42 M ureum / 4 M natriumbisulfiet (2 M natriummetabisulfiet, Sigma-Aldrich, S9000, Na2S2O5, Moleculair Gewicht: 190), 10 mM hydrochinon, een DNA-zuivering kit (Promega Wizard DNA Clean-up systeem, Cat. # A7280), TE-buffer, 6,3 M NaOH (vers gemaakt), 10 M NH 4 OAc, 20 ug / ul tRNA, en 100% ethanol . 2. Details van de bisulfiet behandelprotocol <ol><li> Isoleren genomische endosperm of embryo DNA met behulp van een CTAB procedure (Rogers en Bendich, 1988). </li><li> Digest 100 ng - 2 pg van genomisch DNA in 20 ui tot 100 pi het totale volume met restrictie-enzymen die dwars buiten de regio te analyseren. Voor de MEA-promotor, gebruiken we Xhol, Ndel en Pstl of HindIII. </li><li> Denatureren de restrictie-enzymen door het koken van het DNA voor vijf minuten en daarna lessen op ijs. </li><li> Voeg 1 / 9 volume (2,2 ul voor 20 pi verteerd DNA) van 3 M NaOH en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Breng de oplossing voor een 250 pi PCR-buis. </li><li> Los 7,5 g ureum in 10 ml steriel gedistilleerd water; Langzaam 7,6 g natrium metabisulfite toevoegen periode van 1-2 uur en de verwarming meestal helpt op te lossen; Stel de pH-waarde tot en met 5 vers gemaakte 10 M NaOH; Voeg steriel gedestilleerd water tot een uiteindelijke volume op 20 ml. Dit is 6,24 M ureum / 4 M natriumbisulfiet-oplossing. </li><li> Voeg 6,24 M ureum / 4 M natriumbisulfiet-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 5,36 M en 3,44 M, respectievelijk (Paulin et al.., 1998). Voeg bijvoorbeeld 208 ul van 6,42 M ureum / 4 M natriumbisulfiet oplossing voor het bovenstaande 22,2 ul van gedenatureerd genomisch DNA (Xiao et al.., 2003). </li><li> Voeg 10 mM hydrochinon aan het DNA in een uiteindelijke concentratie van 0,5 mM (12 pL voor 20 pi spijsvertering). </li><li> Gedrag bisulfiet behandeling in een PCR-machine: 30 cycli van 55 ° C gedurende 15 minuten en 95 ° C gedurende 30 seconden. </li><li> Ontzouten van de bisulfiet behandeld DNA met behulp van de Wizard DNA Clean-Up System van Promega en follow-up van de protocol (Jacobsen et al.., 2000). </li><li> Meet de exacte omvang van TE verhaald op de kolom na ontzouten en voeg 6,3 M NaOH tot een uiteindelijke concentratie van 0,3 M. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Voeg 10 M NH 4 OAc (pH 7,0) tot een uiteindelijke concentratie van 3 M, 2 pi van 20 ug / ul tRNA, en de drie volumes van 100% ethanol en vervolgens mixen. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 rpm. </li><li> Zodra Was de pellet met 70% ethanol, doe een korte centrifuge, en verwijder extra ethanol. </li><li> Droge pellet in een speedvac 5-10 minuten en resuspendeer in 25 tot 100 pi TE-buffer, afhankelijk van basisbedrag van DNA. De natriumbisulfiet behandelde DNA is nu klaar voor PCR analyse. </li></ol> 3. PCR-amplificatie <ol><li> Aangezien de niet-gemethyleerd cytosines worden omgezet in uracil, is het moeilijk te versterken een groot fragment met behulp van de bisulfiet behandelde DNA als een template. Zo, we meestal ontwerpen primers om een ​​product te versterken niet langer dan 500 bp. Om de sequentie van de 4-kb MEA promotor, hebben we veel sets van primers en versterkt 14 overlappende fragmenten van de hele regio te dekken (Xiao et al.., 2003). </li><li> Naar volgorde van de top-streng, kies in het ontwerpen van een voorwaartse primer, I) een G (guanine)-rijke regio met het oog op een hogere uitgloeitemperatuur hebben zonder extra lange nucleotiden in de primer worden gebruikt; II) te wijzigen C (cytosine) naar Y ( pyrimidine) op CG-en CNG contexten en veranderen van de resterende C tot T (thymine). Bij het ontwerpen van een reverse primer, I) kiezen voor een C-rijk gebied; II) G verandering in R (purine) op CG-en CNG contexten en veranderen van de resterende G naar A (adenine). </li><li> Om de sequentie van het bottom-streng, kies in het ontwerpen van een voorwaartse primer, I) een C-rijke regio; II) te wijzigen G op R op CG-en CNG-contexten en veranderen van de resterende G naar A. Bij het ontwerpen van een reverse primer, I) kiezen een G-rijk gebied; II) te wijzigen C tot Y (pyrimidine) op CG-en CNG contexten en veranderen van de resterende C T. </li><li> We meestal gebruik 1-2 pi van de natriumbisulfiet behandeld met DNA als een sjabloon voor elke PCR-amplificatie (Xiao et al.., 2003). Het PCR-product moet worden geanalyseerd met behulp van gelelektroforese om de juiste omvang van het fragment te bevestigen en te gel worden gezuiverd en gekloneerd in de TOPO TA kloneringsvector pCR2.1 (Invitrogen) als een insert. Een enkele kolonie is opgepakt en gekweekt; plasmide DNA geëxtraheerd en verstuurd voor het rangschikken. </li></ol> 4. Sequentie-analyse Het principe van bisulfiet sequencing is dat niet-gemethyleerd cytosine worden geconverteerd naar uracil te wijten aan hydrolytische desaminering door een hoge concentratie van natriumbisulfiet op pH5.0 die als thymine worden versterkt in PCR-product, terwijl 5-methyl cytosine zullen niet worden gewijzigd door natriumbisulfiet en blijven aan cytosine na PCR-amplificatie (Clark et al., 1994;. Frommer et al., 1992.). Na het behalen van de sequentie resultaat, we vergelijken met de streng-specifieke sjabloon dat wordt gebruikt voor de PCR-amplificatie. Als een cytosine residu in de sjabloon leest als een thymine in de sequencing resultaat, betekent dit dat de cytosine niet gemethyleerd is. Als een cytosine residu in de template blijft een cytosine in de sequencing, betekent dit dat het cytosine gemethyleerd is. IV. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="Figuur 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1 /"> Figuur 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

Het is relatief eenvoudig om embryo&#39;s te scheiden van het endosperm en de zaadhuid, maar het is vervelend om endosperm scheiden van zaadhuid, vooral voor zaden in een vroeg of midden-torpedo stadium van de embryogenese. Omdat zaadhuid alleen bij een zeer kleine hoeveelheid weefsel, voor sommige genen, bijvoorbeeld, MEA en de FWA, hoeven we niet te endosperm scheiden van zaadhuid. Dat betekent dat we kunnen isoleren RNA&#39;s uit een mengsel van endosperm en zaadhuid weefsels, controleer dan de expr...

Supplies <ul><li> Ontleden Microscoop </li><li> Schaar </li><li> Fijn Tip Forceps </li><li> Sieraden Tag </li><li> Plant Stakes </li><li> String of Twist-Stropdassen </li><li> 4 &quot;X 2&quot; x 8 &quot;polyethyleen zakken </li><li> 3 &quot;X een&quot; X 1,0 mm Microscope Slides </li><li> Vloeibare stikstof </li><li> Containers met vloeibare stikstof </li><li> Warmte Block </li><li> PCR-buisjes </li><li> Thermocycler </li><li> Reactievaatjes </li><li> Microcentrifuge </li><li> Gel Elektroforese faciliteit </li><li> Arabidopsis thaliana Columbia-0 Planten </li><li> Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Planten </li></ul> Reagentia <ul><li> Ethanol 70% </li><li> 95% Ethanol </li><li> 100% ethanol </li><li> 0,3 M Sorbitol en 5 mM MES-pH 5,7 </li><li> Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) </li><li> 100% ethanol </li><li> Cholorform </li><li> Restrictie-enzymen </li><li> 3 M NaOH </li><li> 6,3 M NaOH </li><li> 6,24 M Ureum / 4 M natriumbisulfiet </li><li> Steriel gedestilleerd H 2 O </li><li> 10 mM hydrochinon </li><li> Wizard DNA Clean-Up System (Promega) </li><li> 10 M NH 4 OAc </li><li> 20 ug / ul tRNA </li><li> TE-buffer </li><li> De TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) </li></ul>

bepaling van de dna-methylatie van genen in imprinted arabidopsis endosperm

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van epigenetische mechanismen. Een van de redenen is het verlies-van-functie null mutant van DNA-methyl-levensvatbaar is, en zo een systeem om te bestuderen hoe het verlies van DNA-methylatie in een genoom van invloed op de groei en ontwikkeling. Imprinting verwijst naar de differentiële expressie van de moederlijke en vaderlijke allelen en speelt een belangrijke rol bij de voortplanting ontwikkeling in zowel zoogdieren en planten. DNA-methylatie is van cruciaal belang voor het bepalen van de vraag of de moeders-of vaderskant allelen van een gen ingeprent is uitgedrukt of het zwijgen opgelegd. In bloeiende planten, is er een dubbele bevruchting gebeurtenis in de voortplanting: een zaadcel bevrucht de eicel naar embryo en een tweede zaadcel zekeringen formulier met de centrale cel aanleiding kan geven tot endosperm. Endosperm is het weefsel waar de inprenting voorkomt in planten. MEDEA, een SET-domeinnaam Polycomb groep gen, en FWA, een transcriptiefactor regulerende bloei, zijn de eerste twee genen aangetoond dat bedrukt in endosperm en hun expressie wordt gecontroleerd door DNA-methylering en demethylering in planten. Met het oog op imprinting status van een gen en methylatie patroon in endosperm te bepalen, moeten we in staat zijn om eerst te isoleren endosperm. Omdat zaad is klein in Arabidopsis, blijft het een uitdaging om Arabidopsis endosperm isoleren en de methylatie te onderzoeken. In deze video protocol, rapporteren we hoe een genetische kruis te voeren, om endosperm weefsel te isoleren uit zaden, en naar de methylatiestatus bepalen bisulfiet sequencing.

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kan moeilijk zijn. In dit protocol beschrijven we hoe de endosperm isoleren en te bepalen door de methylatie bisulfiet sequencing.

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

*Arabidopsis thaliana* is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van epigenetische mechanismen. Een van de redenen hiervoor is de loss-of-function null-mutant van DNA ...

Het algemene doel van deze procedure is om de DNA-methyleringsstatus van geïmprente genen in het endosperm te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de vrouwelijke ouder te emasculeren. De vrouwelijke ouder wordt vervolgens bestoven met pollen van de mannelijke ouder.Vervolgens wordt het endosperm uit het kruisbestuifde zaad gedisseceerd. De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van bisulfietsequencing van het endosperm-DNA. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de DNA-methyleringsstatus van het maternale of paternale allel van een geïmprint gen aantonen via DNA-sequencingpolymorfisme in verschillende ecotypen en bisulfietsequencing.Hallo, ik ben Dr. Yang Shaw van de afdeling Biologie aan de St. Louis University. Hallo, ik ben Matthew Ray van het lab van Dr. J en de afdeling Biologie aan de St. Louis University. Ik ben Diman Panu van het lab van Dr. J.Vandaag laten we u een procedure zien voor het disseceren van een rugby officer en het bepalen van de DNA-methylatiestatus via sulf FAR-sequencing. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om gen-imprinting te bestuderen die wordt gereguleerd door DNA-methylering en demethylering. Laten we beginnen.Om met deze procedure te beginnen, kiest u twee verschillende Arabidopsis-ecotypen als vrouwelijke en mannelijke ouders, om de maternale en paternale allelen te kunnen onderscheiden met behulp van DNA-sequentiepolymorfisme. Hier zijn Columbia zero en Landsberg Erecta respectievelijk gekozen als vrouwelijke en mannelijke ouders. Zorg ervoor dat u jonge en gezonde planten selecteert.Castreer de vrouwelijke ouderplant met behulp van een dissectiemicroscoop. Lokaliseer bloemen in stadium 12 en verwijder alle bloemen of LIC's boven en onder deze door de basis van de voet met een schaar af te knippen. Steriliseer de pincet door de basis van de punt voorzichtig in een bekerglas met 95% ethanol te dopen.Hiermee worden eventuele pollenkorrels op de pincet verwijderd en wordt het pollen gedood. Wrik de bloemknoppen voorzichtig open met een pincet en verwijder zorgvuldig vier kelkbladen, vier kroonbladen en zes meeldraden, zodat de stamper kaal en intact achterblijft. Probeer tijdens dit proces beschadiging aan de vruchtbladen te voorkomen.De volgende stap is het kiezen van de pollendonor en het uitvoeren van de bestuiving. De beste pollendonors zijn de open bloemen in stadium 14, waarbij de bloemblaadjes in een hoek van 90 graden ten opzichte van de stamper staan en er veel pollen vrijkomt. Pak de bloem vast bij de basis en net boven de bloemsteel, waardoor de bloem opensprijdt. Bestuif de stempel van de voorbereide stamper met de helm.Na de bestuiving zal de stempel bedekt zijn met geel pollen, wat gemakkelijk onder een microscoop kan worden waargenomen. Label vervolgens alle bestuifde, gecastreerde stempels op een plant als een kruising met een sieraad-label. Vermeld hierbij de datum en informatie over de vrouwelijke en mannelijke ouders.Plaats een stok in de bodem dicht bij de plant. Gebruik een touwtje om de stengel van de bloem aan de stok te binden en bedek de bestuifde stempels met een plastic zak. Zeven of acht dagen na de bestuiving (DAP) moeten de zaden klaar zijn voor oogst in het midden tot late torpedostadium van de embryogenese en kunnen ze worden geprepareerd.Plaats voor het endosperm en het embryo een salic van acht DAP onder de dissectiemicroscoop. Houd de EK P-cel vast met een pincet en gebruik de punt van een tweede pincet om de opening in de rand waar de twee carpelli samensmelten open te schuiven. Gebruik een BPS om één zaadje op te pakken en plaats dit op een glazen objectglas.Maak vervolgens een kleine snede aan het uiteinde van de micropoel om het embryo eruit te schuiven. Knijp in het niet-doorgesneden uiteinde om het endosperm naar buiten te duwen en het te scheiden van de zaadhuid. Plaats daarna het embryo en het endosperm in afzonderlijke microcentrifugebuisjes en vloeibare stikstof.Zet dit voort totdat er voldoende embryo of endosperm is verzameld uit 10 tot 15 CLIC's. Bewaar de buisjes vervolgens in een vriezer van -80 °C vóór de bisulfietbehandeling. Isoleer genomisch endosperm- of embryonaal DNA met behulp van een milde trimethylammoniumbromide- of CTAB-procedure.Zodra het genomische DNA van het endosperm is geïsoleerd, wordt 100 nanogram in een reactie met een totaalvolume van 20 microliter digested met restrictie-enzymen die buiten het te analyseren gebied knippen. Voor de ME-promotor worden de restrictie-enzymen xh, O one ND one en PST one gebruikt. Denatureer de restrictie-enzymen door het DNA vijf minuten te koken.Stop vervolgens de reactie op ijs. Voeg een negende volume of 2,2 µL van drie molair natriumhydroxide toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Breng de oplossing na incubatie over naar een PCR-buisje van 250 µL.Maak vervolgens een 6,24 M ureum- 4 M natriumbisulfietoplossing door 7,5 gram ureum op te lossen in 10 milliliter steriel gedestilleerd water, waarbij gedurende één tot twee uur langzaam 7,6 gram natriumbisulfiet wordt toegevoegd terwijl de oplossing wordt verwarmd en geroerd. Zodra dit is opgelost, wordt de pH bijgesteld naar 5 met vers bereide 10 M natriumhydroxide.Voeg steriel gedestilleerd water toe tot een eindvolume van 20 milliliters. Overbreng 208 microliters van deze oplossing naar 22.2 microliters van het gedenatureerde genomische DNA uit het endosperm. Voeg vervolgens 12 microliters vers bereide 10 millimolar hydrochinon toe aan het DNA.Voer de bisulfietbehandeling uit in een PCR-apparaat met 30 cycli van 55 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 95 °C gedurende 30 seconden. Ontzout vervolgens het bisulfietbehandelde DNA met behulp van het wizard DNA cleanup-systeem van Promega. Meet, conform de instructies van de fabrikant, het exacte volume TE dat na het ontzouten uit de kolom is teruggewonnen.Voeg vervolgens 6,3 M natriumhydroxide toe tot een eindconcentratie van 0,3 M. Incubeer het mengsel 15 minuten bij 37 °C. Voeg na incubatie ammoniumacetaat 10 M toe tot een eindconcentratie van 3 M, twee µL tRNA van 20 µg/µL en drie volumes 100% ethanol.Meng het monster en centrifugeer 15 minuten bij 14.000 RPM. Was de pellet één keer met 70% ethanol, gevolgd door een korte centrifugatie om overtollige ethanol te verwijderen. Droog de pellet tot slot vijf minuten in een speedvac en resuspendeer in 25 µL TE-buffer.Het met natrium-bisulfit behandelde DNA is nu klaar voor PCR-analyse. Om de promoter van vier kilobase van Madea te sequensen, worden meerdere sets primers ontworpen en worden 14 overlappende fragmenten geamplificeerd om de gehele regio te bestrijken. Begin met het ontwerpen van een forward primer om de bovenste streng te sequensen.Kies eerst een guanine-rijke regio om een hogere annealingtemperatuur te verkrijgen zonder overbodig lange nucleotiden in de primers. Vervang vervolgens cytosine door thymine in CG- en CNG-contexten. Verander daarna elke andere cytosine in thymine.Kies bij het ontwerpen van een reverse primer een cytisine-rijke regio. Verander guanine in purine in CG- en CNG-context en elke andere guanine in adenine. Om de onderste streng opnieuw te sequensen, begint u met het ontwerpen van een forward primer.Kies een cytosinerijke regio en verander guanine naar purine in CG- en CNG-contexten. Verander de overige guanines naar adenine. Kies bij het ontwerpen van de reverse primer een AINE-rijke regio.Vervang cytosine door paridine in CG- en CNG-contexten en vervang de resterende cytosines door thymine. Zodra de primers zijn ontworpen, bereidt u een PCR-reactie voor waarbij voor elke PCR-amplificatie twee µL van het met natriumbisulfiet behandelde DNA als template wordt gebruikt. Voer de PCR-reactie uit en analyseer het product via gelelektroforese om de correcte grootte van het fragment te bevestigen.Volgende gel. Zuiver het PCR-product en cloneer het in de Invitrogen topo TA cloning vector PCR 2.1. Voeg een insert toe en sequence individuele klonen; het principe van bisulfietsequencing is dat niet-gemethyleerde cytosine wordt omgezet in uracil door hydrolytische deaminering bij een hoge concentratie natriumbisulfiet bij pH 5.0.Omgekeerd zal 5-methylcytosine niet worden gemodificeerd door natriumsulfiet. Uracil zal als thymine worden geamplificeerd in het PCR-product, terwijl gemethyleerd cytosine na PCR-amplificatie cytosine blijft. Vergelijk na het verkrijgen van het sequencingresultaat dit met de strengspecifieke template die is gebruikt voor de PCR-amplificatie.Als een cytosineresidu in de template als een thymine wordt gelezen in het sequentieresultaat, duidt dit erop dat het cytosine niet gemethyleerd is. Als een cytosineresidu in de template een cytosine blijft in het sequentieresultaat, betekent dit dat het cytosine gemethyleerd is. De methyleringsstatus van het maternale MEA-allel in de regio van minus 500 baseparen van de MEA-promotor voor vijf gemethyleerde CpG-sites in de gesequentieerde klonen van het endosperm van Columbia, g Clarus gekruist met RLD wordt getoond; gemethyleerde cytosines worden aangegeven door zwart ingevulde cirkels en ongemethyleerde cytosines door witte open cirkels. Op dezelfde wijze wordt de methyleringsstatus voor het maternale Madea-allel van het embryo van Columbia, Gladys gekruist met RLD getoond.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u endosperm isoleert en sulfite sequencing uitvoert bij deze procedure. Het is belangrijk om eraan te denken het protocol correct te volgen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

We presenteren de procedure om een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) monteren van Arabidopsis thaliana zaden. De MKBA bleek een krachtig instrument genetisch en in vitro onderzoeken worden hoe het endosperm controles zaadkieming slapende zaden en in reactie op licht signalen. De MKBA is in beginsel van toepassing onder elke situatie waar het endosperm wordt vermoed dat de embryonale groei beïnvloeden.

Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore<em&gt; In Vitro</em&gt; Hoe de Endosperm Controls zaadontkieming in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

De methylated RNA immunoprecipitation assay is een antilichaamgebaseerde methode die wordt gebruikt om te verrijken voor gemethyleerde RNA-fragmenten. In combinatie met diepe sequencing leidt het tot de identificatie van transcripties met de m5C-wijziging.

Gemethyleerde RNA ImmunoprecipatieTest voor studie m5C Modificatie in Arabidopsis

De huidige studie beschrijft de workflow om DNA-methylatiegegevens te beheren die zijn verkregen door microarray-technologieën. Het protocol demonstreert stappen van monstervoorbereiding tot data-analyse. Alle procedures worden in detail beschreven en de video toont de belangrijke stappen.

Monstervoorbereiding tot bio-informatica analyse van DNA-methylatie: associatiestrategie voor obesitas en gerelateerde eigenschappenstudies

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Leer DNA-methylatiebepaling van genen in Arabidopsis-endosperm via bisulfietsequencing. Deze methode helpt onderzoekers genimprinting en epigenetische regulatie in planten te bestuderen.

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Meer video's verkennen