Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen

Immunecellen infiltreren het centrale zenuwstelsel tijdens infectie, trauma, autoimmuniteit of neurodegeneratie. Hoewel histochemische benaderingen kunnen worden gebruikt om de locatie van de infiltrerende cellen te bepalen en de bijbehorende pathologie te analyseren, worden deze technieken beperkt door het aantal antilichamen dat gelijktijdig kan worden gebruikt. Hier wordt een methode voor snelle isolatie van mononucleaire cellen uit hersen- en ruggenmergweefsels getoond, waarbij het gedissecteerde weefsel eerst wordt gehomogeniseerd.

Vervolgens wordt een perolgradiënt ingesteld en na centrifugatie worden de mononucleaire cellen uit het grensvlak verzameld. Ten slotte worden de cellen gespoeld en gekleurd met antilichamen. Door middel van flowcytometrieanalyse worden hematogene cellen en surveillancemicroglia onderscheiden en kunnen hun relatieve verhoudingen tijdens ziektetoestanden worden bepaald. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Aris-gradiënt of in dergelijke histochemie, is dat deze minder tijdrovend is.

Dit stelt u in staat om meer weefsels tegelijkertijd te verwerken. Het demonstreren van de gradiëntinstelling zal zijn palino Een technicus uit mijn lab Bereid de reagentia voor die nodig zullen zijn voor dit protocol. Begin met vier milliliter stock isotone perol, aangeduid als SIP per hersenen.

Om dit te doen, combineer negen delen perol met één deel 10 keer HBSS zonder calcium en magnesium, gemengd door omkering. Bereid vervolgens 70%per aan terwijl de voorbereide SIP wordt gemengd met één keer HBSS zonder calcium en magnesium. Dispenseer vervolgens twee milliliter van de 70%per cole in een 15 milliliter polypropyleen conische buis om weefsel te verzamelen.

Plaats voor deze procedure de gedissecteerde hersenen en ruggenmergen van alle onderzoeksmuizen in bekers met 10 milliliter RPMI over ijs. Breng vervolgens het weefsel over naar een zeven of 15 milliliter down homogenisator met drie milliliter één keer HBSS met een los zittende pestelgrootte. Maak voorzichtig een celsuspensie met een pestel, schakel vervolgens over naar een strakke pestel van grootte B en dissocieer de weefsels verder.

Zodra het weefsel is gehomogeniseerd, voeg RPMI of één keer HBSS toe tot een eindvolume van zeven milliliter en ga verder met het instellen van de gradiënt om de percoco-gradiënt in te stellen. Begin met het toevoegen van drie milliliter SIP aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 30%PERCOCO Houd er rekening mee dat de perol op kamertemperatuur moet worden gebruikt. Als het koud wordt gebruikt, hebben de cellen de neiging om te klonteren en is de celscheiding minder efficiënt.

Gebruik vervolgens onze pipette hulp met instelling zwaartekrachtmodus langzaam de 10 milliliter celsuspensie op de 70%SIP. Vermijd het mengen van de 70%en 30%oplossingen. Dit is de meest kritische stap van de procedure.

Er zou een zeer duidelijke platte lijn zichtbaar moeten zijn op de 70 tot 30%verbinding. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden omdat de derde en 70%oplossingen zich tijdens het lageren zullen mengen. Volgende stap, compromis van het grensvlak Centrifugeer 30 minuten van 500 Gs bij 18 graden Celsius.

Zorg ervoor dat de centrifuge stopt met minimaal of geen breken, zodat het grensvlak niet wordt verstoord. Na het draaien van de gradiënten zou een dikke en viskeuze laag puin zich moeten ophopen aan de bovenkant van de buis. De volgende laag is de gelige 30%per kernlaag, die soms puin bevat.

Volgende is de 70 tot 30 grensvlak, die een gedefinieerde witte halo zou moeten hebben en de mononucleaire cellen bevat. Ten slotte is aan de onderkant van de buis de heldere 70%perolloog. Als er geen grensvlak wordt waargenomen, zal de opbrengst van cellen waarschijnlijk erg laag zijn, waardoor verdere analyse uiterst moeilijk wordt.

Daarom zouden op dat punt verse celsuspensies nodig kunnen zijn om besmetting te verminderen. Verwijder voorzichtig de laag puin van de bovenkant van de buis en gooi het weg. Gebruik vervolgens een plastic pipet, ga door de bovenste 30%per kernlaag en verzamel twee tot drie milliliter van de 70 30 interfase en breng deze over naar een schone conische buis met acht milliliter één keer HBSS.

Meng de verdunde grensvlakken een paar keer door omkering, centrifugeer vervolgens zeven minuten bij 500 GS bij 18 graden Celsius. Na het draaien, verwijder de supena en resuspendeer de pellet. Breng de celsuspensie over naar een 1,5 milliliter buis in één milliliter celkleuringsbuffer en was het nog een keer. Gebruik een microcentrifuge bij 10.000 GS gedurende één minuut bij vier graden Celsius voordat u doorgaat met antilichaamkleuring om antilichaamkleuring uit te voeren, resuspendeer de pellets in 50 microliter gezuiverd anti-US CD 16, CD 32, verdund één op 200 in celkleuringsbuffer om de FC-bindingsplaatsen te blokkeren. Zoals voor elke kleuringsprocedure, is het van cruciaal belang dat alle antilichamen adequaat worden getitreerd. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Tijdens de incubatie, verwijder twee tot vijf microliter cellen en tel ze met behulp van een hemo cytometer.

De gecombineerde naieve hersenen en ruggenmergweefsels zouden rond de drie tot vijf keer 10 tot vijf cellen per muis moeten opleveren. Ontstoken hersenen zullen variërende aantallen inflammatoire cellen hebben, afhankelijk van het tijdstip waarop ze worden verzameld en het ziektemodel. Na de incubatie met CD 16 en CD 32, voeg 50 microliter immuuncelspecifiek antilichaamcocktailmengsel toe. De mix die in dit voorbeeld wordt gebruikt, bevat antilichamen tegen CD 45, CD vier en CD 19. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.

Belangrijk is dat elke antilichaam eerst moet worden getitreerd. Gebruik geschikte fluorochroomcombinaties die zijn gekozen op basis van de mogelijkheden van laser- en filterinstellingen van uw specif