Monitoring immuuncellen Trafficking TL-Prion Rods uur na intraperitoneale infectie

Het hoofddoel van deze procedure is het monitoren van de opname en het transport van prionen door immuuncellen binnen enkele uren na infectie. Begin met het zuiveren en fluorochroom-labelen van geaggregeerde prionstaafjes uit een geïnfecteerd brein, en inoculeer deze prionstaafjes vervolgens in de peritoneale holte van muizen. Oogst na twee uur de cellen uit het peritoneum, de milt en tevens de mediastinale en mesenteriale lymfeklieren. Kleur tot slot de verkregen cellen met immuunfenotypische markers en analyseer deze op de retentie van PreOn.

De resultaten van de flowcytometrie kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om aan te tonen dat prionstaven primair worden vastgehouden en getransporteerd door macrofagen en dendritische cellen, secundair door monocyten en tertiair door B-cellen. Dit experimentele systeem is ontworpen om licht te werpen op prionreservoirs en potentiële therapeutische doelwitten door kernvragen te beantwoorden, zoals welke cellen PreOn direct na infectie opnemen. Waarnaartoe ze deze transporteren en hoe snel ze daar aankomen?

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Crystal Mt. en Brady Michael, promovendi uit mijn laboratorium. Om de PreOn-eiwitten te verzamelen: homogeniseer 100 mg PreOn-geïnfecteerd hersenweefsel in 900 ml ijskoude homogenisatiebuffer gedurende één minuut op maximale snelheid in een commerciële blender en plaats dit vervolgens direct twee minuten op ijs. Herhaal dit proces drie keer om de eiwitopbrengst te verhogen.

Centrifugeer het homogenaat gedurende 10 minuten bij 3000 Gs en vier graden Celsius. Verwijder en bewaar het supernatant op ijs. Resuspendeer de pellet in één liter hp en herhaal de homogenisatie- en centrifugatiestappen.

Voeg nu de supernatant samen en centrifugeer gedurende 60 minuten bij 100 000 g bij 0 °C. Verwijder de supernatant. Resuspendeer het pellet in 100 milliliter TBST.

Schat de eiwitconcentratie in met de Bradford-assay en pas het volume aan naar vijf milligram per milliliter eiwit in TBST. Koel 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens opnieuw 30 minuten bij 100, 000 GS bij nul graden Celsius.

Verwijder de SNA en was het pellet eerst met 50 milliliters TBST. Vervolgens 100 milliliters TBS resuspendeer het resulterende pellet in 100 milliliters 1x PBS bevattende 1% sarcas seal en proteaseremmercocktail en roer gedurende 120 minuten bij 37 °C. Om een sucrosegradiënt uit te voeren, wordt het monster over 900 milliliters 320 millimolar sucrose gelaagd en 60 minuten gecentrifugeerd.

Centrifugeer bij 100.000 g bij 10 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 10 mL 2,3 M natriumchloride, 5% Sarcosyl. Sonicate het monster vervolgens vijf keer gedurende 40 seconden bij 70% van het maximale vermogen met intervallen van één minuut.

Aliquoteer 1 mL monster in Eppendorf-buisjes en centrifugeer 15 minuten bij 13.000 ×g bij 4 °C. Was de pellets twee keer met TBS en bewaar de voorraden bij -70 °C. Conjugeer één buisje gezuiverde Prion-staven met één vial DyLight 649 fluorochroom volgens het protocol van de fabrikant.

Vervang ten slotte de dite-labelingsbuffer door PBS via centrifugatie door filterkolommen. Bewaar in aliquots van 20 µL bij -70 °C, beschut tegen licht, tot gebruik. Deze sectie omvat intraperitoneale prion-inoculatie en het terugwinnen van cellen uit het peritoneum, de mediastinale en mesenteriale lymfeklieren en de milt vlak voor het gebruik van D-loop fluorescent prion.

Fixeer muizen één tot 50 in PBS door ze bij de nekvel door de rugvacht vast te pakken met de duim en wijsvinger. Draai de muis voorzichtig naar u toe en fixeer de staart met uw pink. Supineer de muis door de achterzijde van de romp boven het hoofd te tillen en het dier licht ondersteboven vast te houden.

Inject met een insulinespuit van 30 gauge 100 µL fluorescerende pion-staafjes, één centimeter lateraal van de middellijn en één tot twee centimeter anterieur van het sacro-iliacale gewricht. Voer de naald één centimeter door de huid in, gericht in een hoek van 45 graden mediaal; gebruik voor controlemuizen een verdunning van 1:50 van fluorescerende kraaltjes of enkel PBS. Incubeer de muizen, conform het experimentele ontwerp, gedurende de vastgestelde tijd om met de analyses te beginnen.

Euthanaseer de muizen volgens de goedgekeurde protocollen van de commissie voor dierenzorg en -gebruik. Injecteer 10 milliliters PBS in de peritoneale holte met een 12 milliliter spuit en een 25 gauge naald. Schud de muis voorzichtig longitudinaal gedurende één minuut voordat u voortgaat met de dissectie van de muis.

Bevocht de ventrale zijde van de vacht van de muis grondig met 70% ethanol. Til met een pincet de huid op bij de middenlijn, net onder de ribbenkast, en maak met een schaar een kleine incisie door de huid. Maak vervolgens een drie tot vijf centimeter lange incisie door de huid in beide richtingen, zowel naar de kop als naar de staart.

Maak twee incisies van twee centimeter vanaf de middellijn, zijdelings vanaf beide uiteinden; pel de huid terug en zet deze vast met pinnen om de peritoneale en thoracale holtes bloot te leggen. Verzamel de celsuspensie uit het peritoneum met dezelfde spuit en een naald van 16 gauge. Plaats het exsudaat in een conische buis van 15 milliliter en bewaar deze op ijs.

Snijd voorzichtig door het dunne, doorschijnende membraan rondom het peritoneum en klap de thorax open om het mediastinum bloot te leggen. Zoek vervolgens twee tot vier mediastinale lymfeklieren en verwijder deze; deze bevinden zich iets dorsaal en lateraal naast de thymus, mediaal gelegen ten opzichte van de arteria brachiocephalica nabij de ventrale zijde van de trachea. Zoek daarna maximaal zes mesenteriale lymfeklieren die ingebed zijn in het zachte, witte mesenteriale weefsel dat de darmen aan de posterieure buikwand verankert, en verwijder deze.

Bewaar de lymfeklieren in één milliliter PMI 1640-medium op ijs totdat de dissectie voltooid is. Zoek ten slotte de milt en verwijder deze. Dit is een lang, donkerrood orgaan dat zich net lateraal van de middenlijn en dorsaal van de darmen aan de linkerzijde van de muis bevindt.

Gebruik de zuiger van een spuit van 1 mL om de lymfeklieren te macereren en door een zeef met een maaswijdte van 40 micron te persen in 3 mL PBS in een plastic petrischaal. Spoel de zeef met nog eens 2 mL PBS en breng de totale celsuspensie van 5 mL over naar een conische buis van 15 mL. Spoel daarnaast de petrischaal met nog eens 5 mL PBS en breng dit over naar dezelfde buis.

Centrifugeer het monster vijf minuten bij 250 gs. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet. Draag de geïsoleerde cellen in één milliliter FAX-buffer over naar een EOR-buis van 1,5 milliliter.

Over het algemeen kan dit kleuringsprotocol worden gebruikt voor het identificeren van immuuncel-subsets, gebruikmakend van fluorescerende antilichamen tegen goed gekarakteriseerde immuunceloppervlaktemarkers om alle antilichamen in fax-buffer op te lossen. Direct voor gebruik. Tel de cellen en verdeel 10^6 cellen over einor-buisjes, pellet de cellen door centrifugatie en was de pellet twee keer met één milliliter fax-buffer om endogene FC-receptoren te blokkeren.

Incubeer de cellen in 100 µL van 2 ng/mL rat anti-US CD 1632 gedurende 20 minuten op ijs, centrifugeer om een pellet te vormen en was de cellen met FACS-buffer. Voeg vervolgens 100 µL van 1 ng/mL van het geschikte fluorescente antilichaam of de geschikte fluorescente antilichamen toe aan elk monster en incubeer op ijs. Voeg na één uur 100 µL FACS-buffer alleen toe aan de controlecellen, centrifugeer en was de cellen tweemaal met FACS-buffer.

Resuspendeer de cellen in één milliliter act-buffer en incubeer gedurende één minuut op ijs. Om rode bloedcellen te lyseren, wordt de celpellet geoogst en gewassen met fax-buffer, waarna de cellen opnieuw worden gesuspendeerd in één milliliter fax-buffer. Analyseer de monsters op een flowcytometer, doorgaans uitgerust met excitatielasers van 405, 488 en 633 nanometer, en vijf tot 10 fluorescentie-emissiedetectoren.

Ruw prion-geïnfecteerd breinhomogenaat is sterk verrijkt met prionen. Het zuiveringsproces omvat detergent-solubilisatie en ultracentrifugatie van het E2-elkbreinhomogenaat. Het product is protease.

K-resistente FACS-analyse van specifieke celpopulaties toont aan dat antigeenpresenterende cellen na twee uur naar het peritoneum migreren en de fluorescerende beads en prionstaven vasthouden. Cellen uit muizen die waren geïnoculeerd met beads en prionen vertoonden significante fluorescentie, in het bijzonder bij monocyten, dendritische cellen en macrofagen.

PreOn-dragende monocyten, dendritische cellen en macrofagen werden ook aangetroffen in de mediastinale lymfeklieren. Twee uur na inoculatie detecteerden we geen beads of PreOn-staafjes in de orale of mesenteriale lymfeklieren. In dit experiment demonstreert de video verschillende protocollen om geaggregeerde prionstaafjes uit een geïnfecteerd brein te zuiveren voor intraperitoneale injecties, om lymfeklieren correct te identificeren en te isoleren, en tenslotte om immuuncellen te isoleren en te kleuren.