Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdige elektrofysiologische registraties te verkrijgen van een actiepotentiaal van een motorneuron en de bijbehorende synaptische respons in de doelspier. Dit wordt bereikt door eerst de huid aan de bovenzijde van de vis te verwijderen. De tweede stap van de procedure is het blootleggen van het ruggenmerg door alle bovenliggende dorsale spiercellen te verwijderen.

De derde stap van de procedure is het blootleggen van de doelwit-snelle spier door de bovenste laag van de langzame spier te verwijderen. De laatste stap van de procedure is het toepassen van een current clamp op het primaire- of cap-neuron van de coddle en een voltage clamp op de doelwit-skeletspier. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de synaptische responsen in de spier tonen die geassocieerd zijn met het vuren van actiepotentialen van motorneuronen, door middel van gelijktijdige current clamp van het motorneuron en voltage clamp van de doelwitspier.

LaVar Super Fish bood een combinatie van voordelen, zoals het faciliteren van gepaarde motorneuron-skeletspieropnames; de geringe omvang van de spier maakt een effectieve voltage clamp mogelijk, en de stereotiepe kenmerken van het cap-motorneuron maken identificatie en toegang via vi eenvoudig. Nu zal ik u door de procedures leiden die nodig zijn om patch clamp van zowel het neuron als de spier vast te stellen. Bereid voorafgaand aan de procedure vijf belangrijke oplossingen voor, waaronder badoplossing, badoplossing met Trica, badoplossing met IDE, neuron-interne oplossing en spier-interne oplossing.

Verzamel vervolgens één zebravislarve in de leeftijd van 72 tot 96 uur en plaats deze in een badoplossing met trica. Binnen één minuut na blootstelling aan het anestheticum zal de vis niet meer reageren. Om de vis te fixeren, wordt deze op een plastic schaaltje geplaatst en vervolgens met een tweesnijdend scheermes gedecapiteerd onder een stereomicroscoop.

Verplaats de vis naar een glazen registratiekamer die is bekleed met sard en gevuld is met bass-oplossing. Maak met een speld een huidflap nabij het rostrale uiteinde van de vis om voldoende grip te bieden voor een fijne pincet. Verwijder de bovenliggende huid door deze met een fijne pincet vast te pakken nabij de rostrale speld.

Pel langzaam in de richting van de staart om de huid te verwijderen. Behandel de vis gedurende drie tot vijf minuten met drie milliliter bath-oplossing met form IDE om spiercontracties te blokkeren die de opnamen kunnen verstoren. Was vijf keer met normale bath-oplossing.

Verwijder een deel van de oppervlakkige spierlaag over vijf tot zes segmenten door voorzichtig te schrapen met de zijkant van een wolfraampin. Verplaats de vis naar een rechtopstaande microscoop in een kooi van Faraday om elektrische ruis af te schermen. De microscoop is uitgerust met een vaste tafel, een objectief met een grote werkafstand van 40 x en een zoom van 0,5 tot vier x.

De microscoop is gemonteerd op een gemotoriseerde XY-translatieplateau. Om het preparaat bij hoge vergroting tussen zenuw en spier te kunnen bewegen, helpt het gebruik van differentiële interferentiecontrast-optiek bij de visualisatie van de neuronen bij een zoom van 0,5 x. Gebruik een pipet met een grote boring van 15 micron om het bovenliggende spierweefsel te verwijderen en het ruggenmerg bloot te leggen.

Er wordt negatieve druk uitgeoefend met een wegwerpspuit van drie cc en de spiercellen worden één voor één verwijderd. Deze procedure wordt herhaald voor vijf tot zes dorsale segmenten van de skeletspier. Dezelfde brede boar-pipet wordt gebruikt om ook de bovenste twee lagen van de ventrale spier te verwijderen om de doelwit-snelle skeletspier te verkrijgen.

Hiermee is de voorbereiding voor gepaarde opnames voltooid en wordt de zoom van de microscoop vergroot tot ongeveer 1,6 x. De schone segmenten worden gescand om de cap-neuronen te lokaliseren. Elk HEMI-segment van het ruggenmerg bevat één groot cap-motorneuron met een diameter van 10 micron.

Dit traanvormige soma bevindt zich oppervlakkig onder de spinale Jira, nabij het caudale uiteinde van de segmentale grens. Een cap-neuron wordt gekozen voor registratie en het bijbehorende caudale segment, ventraal doelspierveld, wordt gescand om de integriteit te controleren. Twee patch-elektroden worden geplaatst voor registratie, één voor het neuron en een tweede voor de spier.

De bovenste elektrode heeft een flauwe taps toelopende vorm voor penetratie van de taaie spinale dura en een tipopening van ongeveer twee micron. De onderste elektrode heeft een steilere taps toelopende vorm voor voltage-clamp registratie met een lage weerstand van skeletspier. Positioneer de neuronelectrode in een hoek van ongeveer 30 graden om de spinale dura te penetreren.

Bevorder de elektrode ongeveer een half segment rostroaal van het geselecteerde cap-neuron met behulp van een axiale drive-manipulator, terwijl een zachte, continue positieve druk van ongeveer 60 millimeters mercury wordt uitgeoefend. Wanneer de elektrode door de dura breekt, kan het cap-neuron worden verplaatst door de perfusie van de elektrode, waardoor een heraanpassing van de focus noodzakelijk is. Zodra de elektrode het SOMA van het cap-neuron raakt, wordt de positieve druk losgelaten, wat gewoonlijk resulteert in de onmiddellijke vorming van een giga seal.

In sommige gevallen waarin er geen zegel wordt gevormd, is het echter nodig om een lichte negatieve druk toe te passen. Na de vorming van de zegel wordt het elektrodepotentiaal ingesteld op minus 80 millivolt en verbreekt de toepassing van negatieve druk het celmembraan. Het cap-neuron wordt gekenmerkt door een inputweerstand van 140 tot 180 megaohm en een actiepotentiaal die plus 40 millivolt overschrijdt.

Dit wordt getest door stapsgewijs toenemende depolarisatiestappen toe te dienen onder current clamp totdat het actiepotentiaal wordt opgewekt. Vervolgens wordt de microscoop met de XY-gemotoriseerde vertaler verplaatst naar de ventrale spier. Onder hoge vergroting wordt een snelle spiercel gekozen uit het doelveld.

De spierelektrode wordt onder positieve druk naar de doelspiercel bewogen, wat bij het loslaten een giga seal vormt; het elektrodepotentiaal wordt ingesteld op minus 50 millivolt om de natriumkanalen te inactiveren. Vervolgens wordt het celmembraan onder zachte zuiging geruptureerd. Een daling in de weerstand naar 100 tot 200 mega ohm en de plotselinge verschijning van de grote capacitieve transiënt signaleren de entry om te testen op pair.

Er wordt geregistreerd dat het motorneuron gedepolariseerd wordt door stroominjecties van stapsgewijs toenemende grootte totdat er een actiepotentiaal wordt opgewekt. Op dit punt zou er een eindplaatstroom in de spier moeten worden opgewekt; voortgezette stimulatie van het motorneuron bij 1 hertz resulteert in eindplaatstromen zonder uitval. Wanneer de stimulusfrequentie wordt verhoogd naar 100 hertz, fluctueren de eindplaatstromen in amplitude en treedt er functionele uitputting op binnen 10 seconden stimulatie.

Gewoonlijk is de neuronregistratie tot een uur stabiel, maar de spiercellen verslechteren, wat tot uiting komt in een toename van de serieweerstand. Wanneer dit gebeurt, wordt het experiment beëindigd of wordt er een andere spiercel via patchklemtechniek gemeten. Alle registraties moeten binnen één uur zijn voltooid.

Zodra men bedreven is in het vastleggen van een paar, kan de opname binnen één tot anderhalf uur worden voltooid. Het is ook mogelijk om één of twee extra paren te verkrijgen in de aangrenzende segmenten. Een typische dag van opnames levert twee tot drie paren op.

Gepaarde registraties van motorneuronen en skeletspieren bieden een unieke mogelijkheid om de fundamentele werking van de neuromusculaire transmissie te onderzoeken. Wanneer dit in combinatie met Motility-mutantvislijnen wordt gebruikt, kan de bron van neuromusculaire dysfunctie nauwkeurig worden bepaald en kunnen nieuwe inzichten worden verkregen in de mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke ziekten, zoals het metastatisch syndroom.