Name: Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Leer gepaarde patch clamp-opnames van motorneuronen en doelspieren bij larven van Danio rerio. Deze methode maakt gelijktijdige elektrofysiologische metingen mogelijk om synaptische transmissie en neuromusculaire interacties te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gefinancierd door de NIH (NS-18205).

1. Voorbereiding van de Vis voor Gekoppelde Recordings <ol><li> Voorafgaand aan het begin van de procedure, voor te bereiden vijf belangrijke oplossingen, waaronder: Bad Solution, bad Oplossing met tricaïne (MS222), bad Oplossing met Formamide, Neuron Interne Solution en Muscle interne oplossing. </li><li> Vervolgens verzamel een enkele larvale zebravis in de leeftijd van 72 tot 96 uur en de plaats in Bath Oplossing met tricaïne. Binnen een minuut van de blootstelling aan de narcose, zal de vis niet reageren op aanraking. </li><li> Leg de vis op de top van een plastic schaaltje en, met behulp van een stereomicroscoop, onthoofden met een dubbele rand scheermesje. </li><li> Breng de vis op een glazen opname kamer bedekt met Sylgard en gevuld met bad Solution. Bevestig aan de uiteinden door het invoegen van elektrolytisch aangescherpte wolfraam pinnen via de notochord. </li><li> Maak een huidflap de buurt van de rostrale einde van de vis met een pin die een voldoende grip voor een paar fijne tang zal bieden. Verwijder de overliggende huid door vastgrijpen het in de buurt van de rostrale pin met een paar fijne pincet. Peel langzaam in de caudale richting om de huid te verwijderen. </li><li> Behandel de vis met 3 ml van Bath Oplossing met Formamide gedurende 3-5 minuten om spiersamentrekkingen die kunnen interfereren met opnames te blokkeren. Was 5 keer met een normaal bad Solution. Verwijder een deel van de oppervlakkige laag van de spier in 5 tot 6 segmenten door voorzichtig sloop met de zijkant van een wolfraam pin. </li><li> Breng de vis op een rechtop microscoop in een kooi van Faraday om elektrische ruis schild. De microscoop is uitgerust met een vast podium, lange werkafstand 40x objectief en zoom van 0,5 tot 4x. De microscoop is gemonteerd op een gemotoriseerde XY vertaling fase in om de voorbereiding tussen zenuw en spier onder een hoog vermogen te verplaatsen. Het gebruik van differentieel interferentie contrast optiek helpt bij het visualiseren van de neuronen. </li><li> Onder de 0,5 x zoom, gebruik van een breed boring 15-micron pipet naar bovenliggende spier te verwijderen en het ruggenmerg bloot te leggen. Negatieve druk wordt aangebracht door middel van een 3 cc wegwerpspuit en spiercellen worden verwijderd een voor een. Deze procedure wordt herhaald voor 5 tot 6 dorsale segmenten van de skeletspieren. Dezelfde brede boring pipet wordt gebruikt om ook verwijderen van de bovenste twee lagen van ventrale spieren te richten op een snelle skeletspieren te verkrijgen. </li><li> Hiermee is de voorbereiding voor gepaarde opnames en de microscoop zoom is verhoogd tot ongeveer 1,6 x. </li></ol> 2. Gepaarde Opnamen van Cap Motor-neuron en Target Muscle Cellen <ol><li> De gereinigde segmenten worden gescand om de CaP neuronen te vinden. Elke hemi-segment van het ruggenmerg bevat een groot, 10 micron diameter, CaP motor-neuron. Deze traanvormige soma is oppervlakkig gelegen onder de spinale dura de buurt van de caudale meest einde van de segmentale grens. Een CaP neuron is gekozen voor het opnemen en het ventrale doel spier in de aangrenzende caudale segment wordt gescand om de integriteit te controleren. </li><li> Twee patch elektroden zijn geplaatst voor het opnemen, een voor de neuron en een tweede voor de spier. De bovenste elektrode heeft een ondiepe conus voor penetratie van de stoere spinale dura en de tip opening van ongeveer 2 micron. De onderste elektrode heeft een steilere conus voor lage weerstand voltage clamp-opname van de skeletspieren </li><li> Plaats de elektrode neuron in een hoek van ongeveer 30 graden aan de spinale dura dringen, ongeveer een half-segment rostraal van de geselecteerde CaP neuron. Vooraf de elektrode met behulp van een axiale aandrijving manipulator, terwijl het aanbrengen van een zachte continue positieve druk van ongeveer 60 millimeter kwik. Omdat de elektrode breekt door de dura, kan de CaP neuron worden verdrongen door de perfusie van de elektrode, die een aanpassing van de focus. </li><li> Wanneer de elektrode raakt de CaP neuron soma positieve druk wordt vrijgegeven en meestal resulteert in de onmiddellijke vorming van een gigaohm afdichting. Echter, in sommige gevallen een afdichting niet vorm aan, wordt het noodzakelijk om een ​​lichte negatieve druk toe te passen. Na de vorming van afdichting, is de elektrode potentieel aangepast aan-80mV en de toepassing van negatieve druk scheurt het celmembraan. De Cap neuron wordt gekenmerkt door een input weerstand van 140 tot 180 Mega-ohm en een actiepotentiaal dat schiet +40 millivolt. Dit wordt getoetst door het injecteren van stapsgewijs verhogen depolariserende stappen onder de huidige klem totdat de actiepotentiaal wordt opgewekt. </li><li> Vervolgens wordt de microscoop verplaatst naar ventrale spieren met behulp van de XY-gemotoriseerd vertaler onder hoge vermogen. Een snelle spiercel is gekozen uit het doel veld. </li><li> De spier elektrode is gevorderd in de richting van het doel spiercel onder positieve druk, die, wanneer losgelaten, vormt een gigaohm afdichting. De elektrode potentieel is aangepast tot -50 millivolt naar natrium kanalen inactiveren en onder zachte zuigen de celmembraan is gescheurd. Een daling van de weerstand tegen tot 100 tot 200 Mega-ohm en de plotselinge verschijning van de grote capacitieve transiënten signalen entry. </li><li> Om te testenvoor gepaarde opname, de motor-neuron is gedepolariseerd door stapsgewijs grotere injecties van stroom af tot een actiepotentiaal wordt opgewekt. Op dit punt een eindplaat stroom moet worden opgewekt in de spier. Voortzetting van stimulatie van de motorneuron op een Hertz resulteert in een eindplaat stromingen zonder falen. Als de stimulus frequentie wordt verhoogd tot 100 Hertz de eindplaat stromingen fluctueren in amplitude en ondergaan functionele uitputting binnen de 10 seconden van de stimulatie. </li></ol> 3. Representatieve resultaten Typisch, het neuron opname is stabiel tot maximaal een uur, maar de spiercellen verslechteren zoals blijkt als een toename van de serie weerstand. Wanneer dit gebeurt het experiment is of beëindigd of een andere spier cel patch geklemd. Alle opnames moeten binnen een uur. <img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Opnames van het motorneuron actiepotentiaal (AP, boven) en de bijbehorende spier eindplaat huidige (EPC, onderaan). De actie potentieel voor een CaP neuron moet overschrijding +40 mV en de EPC moet stijgen binnen de 300 μsec en verval langs een exponentiële tijdsverloop met een tijd constant onder 1 msec. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Recept </td></tr><tr><td> Bath Solution (in mm) </td><td> 134 NaCl, KCl 2,9, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7,8 </td></tr><tr><td> Bath Oplossing met tricaïne </td><td> Bath Oplossing bevattende 0,02% tricaïne </td></tr><tr><td> Bath Oplossing met Formamide </td><td> Bath Oplossing bevattende 2M formamide </td></tr><tr><td> Neuron interne oplossing (in mm) </td><td> 115 K-gluconaat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Muscle interne oplossing (in mm) </td><td> 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Solutions.

<ol><li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li>
<li>Fetcho, J. R., S, H. igashijima <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li>
<li>Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li>
<li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li>
<li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li>
<li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li>
</ol>

We hebben met behulp van zebravis gepaarde opnamen (Wen en Brehm, 2005) vooral om de processen van het blaasje release en recycling studie tijdens hoogfrequente stimulatie. Dit proces wordt verstoord in motiliteit mutanten waarin normale synaptische transmissie in het gedrang te wijten aan puntmutaties synaptische in de belangrijkste onderdelen. Bijvoorbeeld mutaties die postsynaptische receptor aggregaten (Ono et al.., 2001, 2002, 2004) en de synthese van presynaptische zender (Wang et al., 2008). Resulteren in niet-gecoördineerde zwemmen verstoren. Gekoppeld opnames de informatie dat de bron van de functionele defect kunnen lokaliseren, dus het koppelen van gedrag, genetica en fysiologie. Het zou nu mogelijk zijn om verder te ontleden van de processen die ten grondslag liggen synaptische transmissie door middel van voorbijgaande expressie in het CaP motor-neuronen met behulp van oordeelkundige promotors. Op deze manier dominant negatief of gemuteerde genen specifiek kan worden uitgedrukt in deze neuronen en zowel gedrags-en elektrofysiologische gevolgen bepaald. De extra voordeel van de hele cel configuratie maakt het mogelijk dialyse van het GLB soma met middelen die mogelijk kunnen veranderen blaasje recycling, zoals Clostridium-toxinen en calcium buffers. Vanwege de korte afstand tussen de soma en de spieren, moeten diffusie goed gebeuren binnen het tijdsbestek van de opnamen. Het potentieel van dit preparaat is alleen begonnen met worden aangeboord. De transparantie van de vis op deze leeftijd en oppervlakkige ligging van synapsen maakt ook gebruik van optische hulpmiddelen (Fetcho en O&#39;Malley, 1997; Fetcho en Higashijima, 2004). We zijn zeer succesvol geweest in het meten van endo-en exocytose in levende vis met behulp van FM-kleurstoffen en genetische indicatoren, zoals Synaptophluorin (Li et al.., 2003). Daarnaast kunnen fluorescerende geconjugeerd gifstoffen worden gebruikt om de synaptische proteïnen label voor de beeldvorming van levende vis (Ibanez-Tallon et al., 2004).. Gezien de eenvoud van deze voorbereiding in zijn bezit een grote belofte voor de toekomst te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Pneumatische transducer tester</td><td>Fluke Biomedical</td><td>DPM1B</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamstaaf van 0.002 x 3 inch</td><td>A-M Systems</td><td>715000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomeer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>De applicatiedikte heeft invloed op de DIC-optiek</td></tr></tbody></table>

gepaarde patch clamp recordings van motor-neuron en target skeletal muscle in de zebravis

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan ​​van een spinale motor-neuron en doel spier. Dit is een direct gevolg van de toegankelijkheid van beide celtypen en de mogelijkheid om de single segmentale CaP motor-neuron visueel te onderscheiden op basis van de morfologie en de locatie. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een ​​CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren. Identificatie van de Cap motor-neuron type wordt bevestigd door een kleurstof te vullen of door de biofysische eigenschappen zoals actiepotentiaal golfvorm en cel ingangsweerstand. Motor-neuron opnames routinematig duren een uur toestaan ​​op lange termijn opnames van meerdere verschillende doelgroepen spiercellen. Controle over de motor-neuron vuren patroon maakt metingen van de frequentie-afhankelijkheid van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie. Vanwege een grote quantale formaat en het lage geluidsniveau door hele cel voltage clamp, kunnen alle van de unitaire gebeurtenissen worden opgelost in de spier. Deze functie maakt studie van de basis synaptische eigenschappen zoals afgifte-eigenschappen, blaasje recycling, evenals synaptische depressie en facilitering. De voordelen van deze in vivo voorbereiding eclipse vorige neuromusculaire model bestudeerde systemen, waarbij de motor-neuronen worden meestal gestimuleerd door extracellulaire elektroden en de spieren te groot zijn voor de hele cell patch clamp. De zebravis voorbereiding is vatbaar voor het combineren van elektrofysiologische analyse met een breed scala van benaderingen waaronder transgene lijnen, morfolino knockdown, farmacologische interventie en in vivo beeldvorming. Deze benaderingen, in combinatie met het groeiende aantal neuromusculaire ziekten modellen die door mutant lijnen van zebravis, de deur open voor nieuwe begrip van de menselijke neuromusculaire aandoeningen.

Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan ​​van een spinale motor-neuron en target skeletspieren. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een ​​segmentale CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren.

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Zebravislarven vormen het eerste vertebraten-model dat gelijktijdige patchclamp-registraties van een spinale motorneuron en de doelspier mogelijk maakt.

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdige elektrofysiologische registraties te verkrijgen van een actiepotentiaal van een motorneuron en de bijbehorende synaptische respons in de doelspier. Dit wordt bereikt door eerst de huid aan de bovenzijde van de vis te verwijderen. De tweede stap van de procedure is het blootleggen van het ruggenmerg door alle bovenliggende dorsale spiercellen te verwijderen.De derde stap van de procedure is het blootleggen van de doelwit-snelle spier door de bovenste laag van de langzame spier te verwijderen. De laatste stap van de procedure is het toepassen van een current clamp op het primaire- of cap-neuron van de coddle en een voltage clamp op de doelwit-skeletspier. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de synaptische responsen in de spier tonen die geassocieerd zijn met het vuren van actiepotentialen van motorneuronen, door middel van gelijktijdige current clamp van het motorneuron en voltage clamp van de doelwitspier.LaVar Super Fish bood een combinatie van voordelen, zoals het faciliteren van gepaarde motorneuron-skeletspieropnames; de geringe omvang van de spier maakt een effectieve voltage clamp mogelijk, en de stereotiepe kenmerken van het cap-motorneuron maken identificatie en toegang via vi eenvoudig. Nu zal ik u door de procedures leiden die nodig zijn om patch clamp van zowel het neuron als de spier vast te stellen. Bereid voorafgaand aan de procedure vijf belangrijke oplossingen voor, waaronder badoplossing, badoplossing met Trica, badoplossing met IDE, neuron-interne oplossing en spier-interne oplossing.Verzamel vervolgens één zebravislarve in de leeftijd van 72 tot 96 uur en plaats deze in een badoplossing met trica. Binnen één minuut na blootstelling aan het anestheticum zal de vis niet meer reageren. Om de vis te fixeren, wordt deze op een plastic schaaltje geplaatst en vervolgens met een tweesnijdend scheermes gedecapiteerd onder een stereomicroscoop.Verplaats de vis naar een glazen registratiekamer die is bekleed met sard en gevuld is met bass-oplossing. Maak met een speld een huidflap nabij het rostrale uiteinde van de vis om voldoende grip te bieden voor een fijne pincet. Verwijder de bovenliggende huid door deze met een fijne pincet vast te pakken nabij de rostrale speld.Pel langzaam in de richting van de staart om de huid te verwijderen. Behandel de vis gedurende drie tot vijf minuten met drie milliliter bath-oplossing met form IDE om spiercontracties te blokkeren die de opnamen kunnen verstoren. Was vijf keer met normale bath-oplossing.Verwijder een deel van de oppervlakkige spierlaag over vijf tot zes segmenten door voorzichtig te schrapen met de zijkant van een wolfraampin. Verplaats de vis naar een rechtopstaande microscoop in een kooi van Faraday om elektrische ruis af te schermen. De microscoop is uitgerust met een vaste tafel, een objectief met een grote werkafstand van 40 x en een zoom van 0,5 tot vier x.De microscoop is gemonteerd op een gemotoriseerde XY-translatieplateau. Om het preparaat bij hoge vergroting tussen zenuw en spier te kunnen bewegen, helpt het gebruik van differentiële interferentiecontrast-optiek bij de visualisatie van de neuronen bij een zoom van 0,5 x. Gebruik een pipet met een grote boring van 15 micron om het bovenliggende spierweefsel te verwijderen en het ruggenmerg bloot te leggen.Er wordt negatieve druk uitgeoefend met een wegwerpspuit van drie cc en de spiercellen worden één voor één verwijderd. Deze procedure wordt herhaald voor vijf tot zes dorsale segmenten van de skeletspier. Dezelfde brede boar-pipet wordt gebruikt om ook de bovenste twee lagen van de ventrale spier te verwijderen om de doelwit-snelle skeletspier te verkrijgen.Hiermee is de voorbereiding voor gepaarde opnames voltooid en wordt de zoom van de microscoop vergroot tot ongeveer 1,6 x. De schone segmenten worden gescand om de cap-neuronen te lokaliseren. Elk HEMI-segment van het ruggenmerg bevat één groot cap-motorneuron met een diameter van 10 micron.Dit traanvormige soma bevindt zich oppervlakkig onder de spinale Jira, nabij het caudale uiteinde van de segmentale grens. Een cap-neuron wordt gekozen voor registratie en het bijbehorende caudale segment, ventraal doelspierveld, wordt gescand om de integriteit te controleren. Twee patch-elektroden worden geplaatst voor registratie, één voor het neuron en een tweede voor de spier.De bovenste elektrode heeft een flauwe taps toelopende vorm voor penetratie van de taaie spinale dura en een tipopening van ongeveer twee micron. De onderste elektrode heeft een steilere taps toelopende vorm voor voltage-clamp registratie met een lage weerstand van skeletspier. Positioneer de neuronelectrode in een hoek van ongeveer 30 graden om de spinale dura te penetreren.Bevorder de elektrode ongeveer een half segment rostroaal van het geselecteerde cap-neuron met behulp van een axiale drive-manipulator, terwijl een zachte, continue positieve druk van ongeveer 60 millimeters mercury wordt uitgeoefend. Wanneer de elektrode door de dura breekt, kan het cap-neuron worden verplaatst door de perfusie van de elektrode, waardoor een heraanpassing van de focus noodzakelijk is. Zodra de elektrode het SOMA van het cap-neuron raakt, wordt de positieve druk losgelaten, wat gewoonlijk resulteert in de onmiddellijke vorming van een giga seal.In sommige gevallen waarin er geen zegel wordt gevormd, is het echter nodig om een lichte negatieve druk toe te passen. Na de vorming van de zegel wordt het elektrodepotentiaal ingesteld op minus 80 millivolt en verbreekt de toepassing van negatieve druk het celmembraan. Het cap-neuron wordt gekenmerkt door een inputweerstand van 140 tot 180 megaohm en een actiepotentiaal die plus 40 millivolt overschrijdt.Dit wordt getest door stapsgewijs toenemende depolarisatiestappen toe te dienen onder current clamp totdat het actiepotentiaal wordt opgewekt. Vervolgens wordt de microscoop met de XY-gemotoriseerde vertaler verplaatst naar de ventrale spier. Onder hoge vergroting wordt een snelle spiercel gekozen uit het doelveld.De spierelektrode wordt onder positieve druk naar de doelspiercel bewogen, wat bij het loslaten een giga seal vormt; het elektrodepotentiaal wordt ingesteld op minus 50 millivolt om de natriumkanalen te inactiveren. Vervolgens wordt het celmembraan onder zachte zuiging geruptureerd. Een daling in de weerstand naar 100 tot 200 mega ohm en de plotselinge verschijning van de grote capacitieve transiënt signaleren de entry om te testen op pair.Er wordt geregistreerd dat het motorneuron gedepolariseerd wordt door stroominjecties van stapsgewijs toenemende grootte totdat er een actiepotentiaal wordt opgewekt. Op dit punt zou er een eindplaatstroom in de spier moeten worden opgewekt; voortgezette stimulatie van het motorneuron bij 1 hertz resulteert in eindplaatstromen zonder uitval. Wanneer de stimulusfrequentie wordt verhoogd naar 100 hertz, fluctueren de eindplaatstromen in amplitude en treedt er functionele uitputting op binnen 10 seconden stimulatie.Gewoonlijk is de neuronregistratie tot een uur stabiel, maar de spiercellen verslechteren, wat tot uiting komt in een toename van de serieweerstand. Wanneer dit gebeurt, wordt het experiment beëindigd of wordt er een andere spiercel via patchklemtechniek gemeten. Alle registraties moeten binnen één uur zijn voltooid.Zodra men bedreven is in het vastleggen van een paar, kan de opname binnen één tot anderhalf uur worden voltooid. Het is ook mogelijk om één of twee extra paren te verkrijgen in de aangrenzende segmenten. Een typische dag van opnames levert twee tot drie paren op.Gepaarde registraties van motorneuronen en skeletspieren bieden een unieke mogelijkheid om de fundamentele werking van de neuromusculaire transmissie te onderzoeken. Wanneer dit in combinatie met Motility-mutantvislijnen wordt gebruikt, kan de bron van neuromusculaire dysfunctie nauwkeurig worden bepaald en kunnen nieuwe inzichten worden verkregen in de mechanismen die ten grondslag liggen aan menselijke ziekten, zoals het metastatisch syndroom.

paired-patch-clamp-recordings-from-motor-neuron-target-skeletal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het doel van deze video aan te tonen procedures voor het verkrijgen van gezonde, intacte haarcellen van het binnenoor organen van volwassen zebravissen en gebruik voor patch clamp studies gericht op het karakteriseren van de biofysische eigenschappen van de voltage-gated kanalen.

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

This video demonstrates a non-invasive assay to study electrophysiology of motor neurons in zebrafish embryos. Upon measuring tail coiling in the embryos as a result of spontaneous depolarization of the spinal cord motor neurons, a sodium channel blocker is applied to reduce the coiling frequency. Next, the embryos are immobilized in agarose and placed under a fluorescence microscope. The genetically engineered motor neurons express a voltage-sensing biosensor with a donor and an acceptor...

A Non-invasive Approach to Study the Electrophysiology of Motor Neurons in Zebrafish Embryos

This video demonstrates the recording of electrical signals from the afferent neurons in a paralyzed zebrafish larva by positioning a micropipette near the lateral line ganglion and forming a loose seal for signal capture. The extracellular solution maintains neuronal viability during this process.

Monitoring Electrical Signals from the Afferent Neurons in an Immobilized Zebrafish Larva

Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

We beschrijven een protocol om veranderingen in de activiteit van het afferente neuron te volgen tijdens motorische commando's in een model gewerveld haarcelsysteem.

Activiteit van Posterior Lateral Line Afferent Neurons tijdens het zwemmen in Zebrafish

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

De neuromusculaire overgang van de zebravislarve is een aantrekkelijk model voor het bestuderen van synaptische fysiologie. Het is vatbaar voor vele experimentele technieken, waaronder elektrofysiologie en optische beeldvorming. Hier beschrijven we een protocol voor het in beeld brengen van synaptische transmissie met behulp van een op pHluorin gebaseerde sonde onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.

Live beeldvorming van het recyclen van synaptische blaasjes in de neuromusculaire overgang van ontlede larvale zebravissen

Leer gepaarde patch clamp-opnames van motorneuronen en doelspieren bij larven van Danio rerio. Deze methode maakt gelijktijdige elektrofysiologische metingen mogelijk om synaptische transmissie en neuromusculaire interacties te bestuderen.

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Meer video's verkennen