Name: In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Leer clathrine-gemedieerde endocytose bestuderen met behulp van levende celbeeldvorming en biochemische assays in gist. Deze methode onthult hoe adaptor-eiwitten zoals Sla1p interacties met clathrine reguleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DF wordt ondersteund door een NSF Bruggen naar het College voor Promoties gemeenschap. De microscoop gebruikt in dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de microscoop Imaging Network kerninfrastructuur subsidie ​​van Colorado State University. Werk aan clathrine adapters in het laboratorium van de auteur en wordt ondersteund door CSU start-up fondsen en American Heart Association Award 09SDG2280525 naar SD

1. Oprichting van een GFP-tag en selecteerbare marker in de SLA1 gen Breng de Longtine methode 17 om een GFP-tag direct zekering aan het 3 'einde van de SLA1 gen open reading frame (Sla1p C-terminus) en tegelijkertijd markeren het gen met de E. coli Kan r gen dat zorgt voor G418 selectie. <ol><li> Het genereren van een DNA-fragment door PCR gebruikt als een sjabloon het plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 en de volgende primers: voorwaartse, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG GGA TTT TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', en omgekeerd, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. De onderstreepte volgorde komt overeen met de SLA1 gen specifieke segment onmiddellijk voorafgaand aan (voorwaartse primer) en na het stopcodon (reverse primer). Isoleer het PCR-product door agarose gelelektroforese gevolgd door DNA-zuivering. </li><li> Bereid een 50 ml cultuur S. cerevisiae SEY6210 stam (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901, lys2-801, SUC2-Δ9 GAL-MEL) 19 in YPD, groeit in de vroege logaritmische fase (OD 600 = 0,2 tot +0,6). Spin bij kamertemperatuur gedurende 3 min bij 2000 xg, twee keer wassen met steriel water. </li><li> Transformeren van de PCR-fragment verkregen in stap 1 in de cellen met behulp van de lithium-acetaat procedure 20. Was de cellen met 1 ml steriel water, voeg 1 ml YPD en incubeer gedurende 4 uur bij 30 ° C in een shaker. </li><li> Spreid de cellen op YPD-G418 platen te selecteren voor de G418-resistente transformanten, incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Pick kolonies en streep ze op YPD-G418 platen. </li><li> Met behulp van kolonie-PCR, identificeren transformanten waarin het GFP-kan-module goed was met de SLA1 gensequenties geïntegreerd door homologe recombinatie. Gebruik een voorwaartse primer dat anneals binnen de SLA1 open reading frame en een reverse primer die anneals in het GFP-kan-module. Identificeer kolonies die PCR-producten hebben de verwachte grootte en controleer door sequentiebepaling. </li><li> Het scherm van de kolonies door middel van fluorescentie microscopie om te bevestigen dat zij hebben GFP fluorescentie. </li></ol> 2. Mutatie van de variant clathrine box (VCB) in de SLA1 gen <ol><li> Introduceer een LLDLQ te AAALQ mutatie in het gen SLA1 (nucleotiden 2407-2415) naar aanleiding van een benadering in twee fasen 15. </li><li> Ten eerste versterken SLA1 nucleotiden 1207-1410 en 2427-2589 door middel van PCR en kloon van de fragmenten in Notl / BamHI en EcoRI / Sall plaatsen van pBluescriptKS, respectievelijk. </li><li> Subkloon in de BamHI / EcoRI plaatsen een PCR-fragment met URA3. </li><li> Klieven van de resulterende plasmide met Notl / Sali, isoleren van de URA3 fragment door gel zuivering, en breng dit door lithium acetaat transformatie naar de Sla1-GFP stam gegenereerd in deel 1, of in TVY614 (MATA ura3-52-3112 leu2 his3-Δ200 trp1 -Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 PEP4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) 21. </li><li> Spreid de cellen op aangevuld met SD-platen ontbreekt uracil. Bevestig door kolonie-PCR en sequencing dat de Ura + koloniën goed geïntegreerd URA3 bevatten vervanging van de VCB fragment. </li><li> In een tweede stap, subkloon SLA1 nucleotiden 1207-2589 in Notl / Sall plaatsen van pBluescriptKS. Met behulp van de QuickChange-XL plaats-gerichte mutagenese kit (Stratagene), muteren van de VCB residuen LLDLQ naar AAALQ. Controleer door sequentiebepaling. </li><li> Klieven van de resulterende construct met BsgI / Agel, en isoleren van de mutant WCV bevattende fragment door gel zuivering. Cotransform de BsgI / Agel fragment met pRS313 (HIS3) 22 in de stam verkregen in deel 2.3. </li><li> Spreid de cellen op aangevuld met SD-platen ontbreekt histidine. Replica-plate Zijn + kolonies op agar medium met 5-fluorotic zuur naar cellen waarin het mutante sequenties vervangen URA3, waardoor regeneratie van de sla1 gen met de LLDLQ om AAALQ mutatie (sla1 AAA) te identificeren. Bevestig door kolonie-PCR en sequencing. </li></ol> 3. Fluorescentie microscopie <ol><li> Groeien de giststammen Sla1-GFP en sla1 AAA-GFP gegenereerd in deel 1 en 2 in 4 ml aangevuld met SD-media bij 30 ° C in een rotator in het donker tot aan een OD 600 = 0,1-0,4. Spin 1 ml van de cultuur in microcentrifugepuls bij 4.000 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Gooi ~ 950 ul supernatant. Resuspendeer cellen in de resterende vloeistof (~ 50 ul). </li><li> Borg 3 ul van de celsuspensie op een microscopie glijbaan en afdekken met een glazen dekglaasje aan. Bescherm het monster tegen licht. </li><li> Mount dia op een 100x olie-immersie objectief van een spinning-schijf confocale microscoop. </li><li> Zoek de juiste brandvlak van cellen met behulp van helderveld verlichting of 488 nm laser met de nodige filters te prikkelen en te ontdekken fluorescentie van GFP. </li><li> Capture time-lapse beelden van Sla1-GFP en sla1 AAA-GFP in cellen met een belichtingstijd van 500 ms (of passende waarde) op eenn interval van een beeld per seconde gedurende 150 seconden. Verwacht resultaat: GFP gelabelde puncta zal verschijnen op de binnenkant van de beperking van membraan van de cel, blijven gedurende enkele seconden, en verplaats naar het midden van de cel als het signaal snel verdwijnt (met vermelding van vacht demontage). </li><li> Selecteer een deel van een beeld waarin plekken worden gezien om te verschijnen, gedurende enkele seconden blijven, en verdwijnen. Crop dit gedeelte van het beeld voor elk frame van de time-lapse beelden. </li><li> Genereer een kymograaf vertegenwoordigt dit deel van de afbeelding in elk frame van de 150 seconden time-lapse beeld door het uitlijnen van de frames langs een as die overeenkomt met de verstreken tijd. </li><li> Bereken de duur van elke plek op basis van het aantal seconden (time-lapse frames) de vlekken aanwezig is in de kymograaf. Merk op dat elke plek moeten de "curve" in de richting van het inwendige van de cel als het verdwijnen is, als gevolg van endocytose en demontage van de vacht. </li><li> Vergelijk wild-type Sla1-GFP met sla1 AAA-GFP. Herhalen om te bepalen of de resultaten statistisch significant. Verwacht resultaat: sla1 AAA-GFP plekken aanhouden significant langer (~ 80 sec) dan wild type (~ 30 sec) duidt op een defect in de vacht vorming van 15. </li></ol> 4. De voorbereiding van gist cytosolische extract en de totale cel extract <ol><li> Inoculeren 3 liter YPD met een geschikte giststam, zoals TVY614 21, en ​​groeien bij 30 ° C in een incubator shaker tot het bereiken van een OD 600 = 1-2. </li><li> Centrifugeer de gistcultuur bij kamertemperatuur gedurende 20 min bij 3700 x g. Verwijder het supernatant, voeg 3-5 ml steriel water, en de pipet op en neer totdat de pellet volledig geresuspendeerd. </li><li> Giet ~ 150 ml vloeibare stikstof in een 250 ml plastic beker. Flash-bevriezing van de gist door het toevoegen van druppelsgewijs in de vloeibare stikstof in een cirkelvormig patroon om agglutinatie van de bevroren pellets te vermijden. Laat niet de pellets dooi, voeg meer vloeibare stikstof indien nodig. </li><li> Chill een roestvrijstalen blender container door gieten vloeibare stikstof in. Laat de vloeibare stikstof om bijna volledig verdampen. Voeg de bevroren gist pellets aan de koude blender container. Sluit de blender container met een koud rubber stop en maal de gist pellets gedurende 10 seconden. Keer de container 3-4 keer om inhoud te mengen en twee keer herhaal de malen stap. De grond bevroren gist hebben een poeder-achtige uitstraling. </li><li> Chill een trechter en een 50 ml conische buis met vloeibare stikstof. Met behulp van de koude trechter, de overdracht van de grond gist op de buis. De bevroren grond gist kan bewaren bij -80 ° C of onmiddellijk worden gebruikt. </li><li> Voor het verkrijgen van een cytosolische extract voor de GST-fusie-eiwit affiniteit assay (deel 5), gewicht 3 g bevroren grond TVY614 gist op in een 15 ml conische buis en resuspendeer in 3 ml op kamertemperatuur buffer A (10 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) met protease-remmer cocktail (Sigma). </li><li> Cap en draai de buis een paar keer totdat het volledig ontdooid en vervolgens op ijs gezet. </li><li> Ultracentrifuge het extract bij 4 ° C gedurende 20 minuten op 300.000 x g. Breng voorzichtig de supernatant (cytosolische extract) op een conische buis met behulp van een pipet, zonder de pellet te verstoren. Houd de cytosolische extract op ijs. </li><li> Voeg 100 ul van een 50% (v / v) glutathion-Sepharose slurry in buffer A. Het is handig om aan het einde van de tip gesneden ter vergemakkelijking van pipetteren de kralen. Draaien bij 4 ° C gedurende 15 minuten, spin-down de parels door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 2 min bij 1000 xg, en breng de supernatant (cytosolische extract) naar een nieuwe buis. Reserve 50 ul van het extract voor de invoer te controleren. </li><li> Voor het verkrijgen van totale cel extracten voor co-immunoprecipitatie experimenten (deel 6), gebruik stam TVY614 (WT SLA1), de sla1 AAA stam die een LLDLQ om AAALQ mutatie gegenereerd in deel 2 in TVY614 achtergrond, en een sla1 stam die een deletie van het SLA1 gen zoals GPY3130 23. Gewicht 2 g van de overeenkomstige bevroren grond gist in conische buizen en ze in 2 ml van de buffer op kamertemperatuur mengen A, met proteaseremmer cocktail (Sigma) en 2% Triton X-100. </li><li> Cap en draai de buis een paar keer totdat het volledig ontdooid en vervolgens op ijs incubeer gedurende 10 minuten, regelmatig mengen door inversie. </li><li> Overdracht van het materiaal microcentrifugebuizen en spin bij 4 ° C gedurende 15 min bij 16.000 xg (topsnelheid in microcentrifugepuls). Breng voorzichtig de supernatant (totale cel extract) tot een conische buis op ijs met behulp van een pipet, zonder de pellet te verstoren. </li><li> Voeg 100 ul van een 50% (v / v) proteïne A-Sepharose slurry in buffer A. Draai bij 4 ° C gedurende 15 min, spin-down de parels door centrifugeren bij 4 ° C gedurende 2 min bij 1000 xg, en overdracht het supernatant (totaal extract) naar een nieuwe buis. Reserve 50 ul van het extract voor de invoer te controleren. </li></ol> 5. GST-fusie-eiwit affiniteit assay <ol><li> Amplify door PCR een fragment containing van de Sla1p variant clathrine-box (VCB) (residuen 803-807), kloon het in pGEX-5X naar pGEX-5X-VCB te verkrijgen. Controleer door sequentiebepaling. </li><li> Met behulp van pGEX-5X-VCB als een template en de QuickChange-XL plaats-gerichte mutagenese kit (Stratagene), muteren van de VCB residuen LLDLQ om AAALQ te pGEX-5X-vCBmut te verkrijgen. Controleer door sequentiebepaling. </li><li> Express GST en de fusie-eiwitten GST-VCB en GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), zuiveren met behulp van glutathion-Sepharose, elueren uit de kralen met een gereduceerd glutathion, dialyze tegen PBS, en bepaal eiwitconcentratie. </li><li> Label 3 Reactievaatjes: GST, GST-VCB en GST-vCBmut, en voeg 1 ml PBS, 30 pi van een 50% (v / v) glutathion-Sepharose slurry in buffer A, en 50 ug van dialized GST, GST VCB-of GST-vCBmut fusie-eiwitten. </li><li> Draaien bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten te laten voor de binding. </li><li> Was de kralen 2 keer met PBS en een keer met buffer A. Voeg 1 ml van gist cytosolisch extract - bereid zoals beschreven in deel 4 - aan elke buis. </li><li> Draai de buizen 1 uur bij 4 ° C, spin 10 sec bij 5000 xg om pellet de kralen, gooi supernatant, en al snel was de kralen 3 keer met buffer A die 0,1% Triton X-100, en 1 keer met buffer A. </li><li> Spin down de kralen nog een keer en het gebruik van een gel laad-tip zo veel vloeistof te verwijderen als mogelijk. Op dit punt van de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C om verder te gaan op een later tijdstip. </li><li> Voeg 15 ul van 2x Laemmli sample buffer aan elke buis, incuberen bij 96 ° C gedurende 5 min, en spin 10 sec bij 5000 x g. </li><li> Het analyseren van de monsters door immunoblotting met behulp van een antilichaam tegen het clathrine zware keten. Verwachte resultaten: clathrine bindt aan GST-VCB, maar niet om GST-of GST-vCBmut. Ook de monsters analyseren door SDS-PAGE vergelijkbare belasting van de GST fusie-eiwitten te bevestigen. </li></ol> 6. Co-immunoprecipitatie assay <ol><li> Label 3 microcentrifugebuizen: WT (wild-type SLA1), sla1 AAA, en sla1Δ, en voeg 1 ml PBS, 30 pi van een 50% (v / v) proteïne A-Sepharose slurry in buffer A, en 2 ug van een konijn anti-Sla1p antilichaam. </li><li> Draaien bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Twee keer was de kralen met PBS en een keer met buffer A met 1% Triton X-100. </li><li> Voeg 1 ml van de overeenkomstige totale gistextracten bereid in deel 4: SLA1, sla1 AAA, en sla1Δ. Draai 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Spin 10 sec bij 5000 xg om pellet de kralen, gooi supernatant, en al snel was de kralen 3 keer met buffer A die 0,1% Triton X-100, en 1 keer met buffer A. </li><li> Spin down de kralen nog een keer en het gebruik van een gel laad-tip zo veel vloeistof te verwijderen als mogelijk. Op dit punt van de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C om verder te gaan op een later tijdstip. </li><li> Voeg 15 ul van 2x Laemmli sample buffer aan elke buis, incuberen bij 96 ° C gedurende 5 min, en spin 10 sec bij 5000 x g. </li><li> Het analyseren van de monsters door immunoblotting met behulp van een antilichaam tegen het clathrine zware keten. Verwachte resultaten: clathrine co-immunoprecipitaten met wild-type Sla1p, maar niet om met sla1 AAA, of in de sla1Δ monster. </li></ol> 7. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Analyse van de Sla1p clathrine adapter op endocytische plaatsen door live-cell fluorescentie microscopie. Een frame (links) uit een video en de bijbehorende kymographs (rechts) van gist cellen die Sla1-GFP of sla1 AAA-GFP die een LLDLQ te AAALQ mutatie. Zowel de wild-type en mutant Sla1-GFP werd tot expressie gebracht van de endogene SLA1 locus. Endocytische sites worden waargenomen als lichtpuntjes verspreid in de cel periferie (links beelden). Het gebied tussen de witte lijnen overeen met de regio waar kymographs werden gegenereerd. Films werden genomen op een frame rate van 1 frame / sec. Let op de langere levensduur van Sla1-GFP in de LLDLQ om AAALQ mutant (sla1 AAA) in vergelijking met wild type (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Fysieke interactie tussen clathrine en de Sla1p-variant clathrine box. GST gefuseerd aan fragment aa798-813 met daarin de volgorde LLDLQ (GST-VCB), de bijbehorende AAALQ mutant (GST-vCBmut), of GST alleen (GST) Sla1p waren gebonden aan glutathion-Sepharose kralen en geïncubeerd met een cytosolische extract van wild- soort gistcellen. De bijbehorende eiwitten werden geëlueerd en geanalyseerd door immunoblotting (IB) voor clathrine zware keten.

<ol><li>Mellman, I., Warren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+taken%3A+past+and+future+foundations+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The road taken: past and future foundations of membrane traffic.</a> Cell. 100, 99-112 (2000).</li>
<li>Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+assembly+and+endocytosis%3A+from+yeast+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).</li>
<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Traub, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+for+sorting+of+transmembrane+proteins+to+endosomes+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes.</a> Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).</li>
<li>Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+clathrin-mediated+membrane+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding.</a> Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Clathrin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).</li>
<li>Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basket+weaving%3A+formation+and+function+of+clathrin-coated+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).</li>
<li>Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptors+for+clathrin+coats%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptors for clathrin coats: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+AP-3+adaptor+complex+with+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin.</a> Science. 280, 431-434 (1998).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-binding+proteins%3A+got+a+motif%3F+Join+the+network%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!</a> Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).</li>
<li>Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic-lethal+interactions+identify+two+novel+genes%2C+SLA1+and+SLA2%2C+that+control+membrane+cytoskeleton+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).</li>
<li>Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sla1p+serves+as+the+targeting+signal+recognition+factor+for+NPFX%281%2C2%29D-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis.</a> J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).</li>
<li>Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Sla1p+homology+domain+1+and+interaction+with+the+NPFxD+endocytic+internalization+motif%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif.</a> EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).</li>
<li>Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+clathrin+adaptor+function+in+endocytosis%3A+A+novel+role+for+the+SAM+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain.</a> EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123, 305-320 (2005).</li>
<li>Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14, 953-9561 (1998).</li>
<li>Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+HIS3+marker+and+GFP+reporter+modules+for+PCR-targeting+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 13, 1065-1075 (1997).</li>
<li>Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sorting+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+isolation+of+mutants+defective+in+the+delivery+and+processing+of+multiple+vacuolar+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases.</a> Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li>
<li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li>
</ol>

Clathrine-gecoate blaasjes (CCV) deelnemen aan endocytose en vervoer van het trans Golgi netwerk en endosomen, geconserveerd paden die fundamenteel zijn voor eukaryote cel biologie. De benaderingen beschreven in dit document methoden zijn nuttig om de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het CCV vorming, in het bijzonder interacties tussen eiwitten en adapter clathrine te bestuderen. GST-fusie-eiwit affiniteit en co-immunoprecipitatie assays laten testen voor de fysieke relatie tussen een adap...

<table border="1"><th> Materiaal </th><th> Vennootschap </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL plaats-gerichte mutagenese kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> proteaseremmer cocktail </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo en in vitro studies van adapter-clathrine interactie

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Een belangrijke endocytische route start met de vorming van clathrine-gecoate blaasjes (CCV), dat het vervoer lading uit de cel oppervlak naar 1-6 endosomen. CCV onderscheiden zich door een polyhedrale rooster van clathrine die jassen de blaasje membraan en fungeert als een mechanische steiger. Clathrine jassen worden geassembleerd tijdens de vesicles van individuele clathrine triskelia, de oplosbare vorm van clathrine bestaat uit drie zware en drie lichte keten subeenheden 7,8. Omdat de triskelion niet de mogelijkheid om direct te binden aan het membraan, clathrine-bindend adapters zijn van cruciaal belang voor de vorming clathrine rooster link naar het membraan door associatie met lipiden en / of membraaneiwitten 9. Adapters Ook pakket transmembraan eiwit lading, zoals receptoren, en kunnen communiceren met elkaar en met andere componenten van het CCV formatie machines 9. Meer dan twintig clathrine adapters zijn beschreven, een aantal betrokken zijn bij clathrine gemedieerde endocytose en anderen lokaliseren op de trans Golgi netwerk of endosomen 9. Met uitzondering van HIP1R (gist Sla2p), alle bekende clathrine adapters binden aan de N-terminal-propeller domein van de zware keten clathrine 9. Clathrine adapters zijn modulair eiwitten die bestaan ​​uit gevouwen domeinen met elkaar verbonden door ongestructureerde flexibele linkers. Binnen deze linker regio&#39;s, korte bindingsmotieven bemiddelen interacties met de clathrine N-terminale domein of andere onderdelen van de vesicles machines 9. Twee verschillende clathrine-bindende motieven zijn gedefinieerd: de clathrine-box en de W-box 9. De consensus clathrine-box sequentie werd oorspronkelijk gedefinieerd als L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10, maar varianten zijn vervolgens ontdekt 11. De W-box voldoet aan de volgorde PWxxW (waarbij x is een residu). Sla1p (Synthetic Lethal met actine bindend eiwit-1) werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een actine geassocieerd eiwit en is nodig voor een normale actine cytoskelet structuur en dynamiek op endocytische sites in gistcellen 12. Sla1p bindt ook de NPFxD endocytische sorteer-signaal en is van cruciaal belang voor de endocytose van de lading met het NPFxD signaal 13,14. Meer recent, Sla1p werd aangetoond dat clathrine te binden door middel van een motief lijkt op de clathrine box, LLDLQ, aangeduid als een variant clathrine-box (VCB), en om te functioneren als een endocytische clathrine adapter 15. Daarnaast is Sla1p uitgegroeid tot een veel gebruikte marker voor de endocytische vacht in levende cellen fluorescentie microscopie studies 16. Hier gebruiken we Sla1p als een model om benaderingen voor adapter-clathrine interactiestudies te beschrijven. Wij richten ons op levende cellen fluorescentie microscopie, GST pull-down, en co-immunoprecipitatie methoden.

Clathrine-gemedieerde endocytose afhankelijk van de adapter eiwitten die lading selectie en clathrine vacht montage coördineren. Hier beschrijven we de procedures voor adapter-clathrine fysieke interactie en live cell imaging methoden gebruikt als een model de gist endocytische adapter eiwit Sla1p bestuderen.

In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie

Een belangrijke endocytische route begint met de vorming van clathrine-gecoate blaasjes (CCV's) die vracht van het celoppervlak naar endosomen transporteren1-6. CCV's ...

Tijdens clathrine-gemedieerde endocytose wordt een polyhedrisch rooster van clathrine gekoppeld aan membraaneiwitten of lipiden via clathrine-bindende adaptereiwitten zoals SLA1. SLA1 bindt clathrine via zijn variant clathrin box of VCB. In deze video worden drie methoden gebruikt voor de analyse van clathrine-SLA1-interacties. Ten eerste worden gistcellen die GFP-getagde native en VCB-gemuteerde SLA1 tot expressie brengen, gevisualiseerd met behulp van spinning disc confocale microscopie.Time-lapse video's worden vervolgens geanalyseerd om het effect van de mutatie op de kinetiek van endocytose te bepalen. Ten tweede worden cytosolische gistextracten geprepareerd uit wild-type cellen als bron van clathrine, waarna G-S-T-V-C-B fusie-eiwit pull-down assays worden uitgevoerd om de clathrine-VCB interactie in vitro te onderzoeken. Ten derde worden totale extracten geprepareerd uit gistcellen die native VCB en VCB-mutanten tot expressie brengen.SLA1- en coun-precipitaties worden uitgevoerd om het effect van de mutatie op de affiniteit van de SLA1-clathrinebinding in vivo te onderzoeken. Uiteindelijk tonen de verkregen gegevens aan dat mutatie van VCB endocytose vertraagt en dat de bind

in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele...

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

De subcellulaire lokalisatie van eiwitten is belangrijk bij het bepalen van de spatio-temporele regulatie van cell signaling. We beschrijven hier bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) als een eenvoudige methode voor het bewaken van de ruimtelijke interacties van eiwitten in de cel.

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een epitheliale chloride kanaal, is gemeld om te communiceren met verschillende eiwitten en belangrijke cellulaire processen te reguleren, onder wie de CFTR PDZ motief-gemedieerde interacties zijn goed gedocumenteerd. Dit protocol beschrijft methodes die we ontwikkeld tot een PDZ-afhankelijke CFTR macromoleculaire signaleren van complexe...

In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen

Een high-content screening methode voor de identificatie van nieuwe signalering bevoegde transmembraanreceptoren beschreven. Deze methode is ontvankelijk voor grote schaal automatisering en maakt...

Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Het protocol presenteert een methode voor in vivo covalente hechting van biotine aan eiwitten op basis van hun nabijheid tot een biotineligase die is gefuseerd met een interessant eiwit. Deze modificatie maakt een selectieve verrijking van de eiwitten mogelijk met behulp van streptavidinekorrels als dat nodig is in eiwitinteractiestudies.

In vivo Nabijheidsbiotinylering voor onderzoek naar eiwitinteractie in Paramecium tetraurelia

Leer clathrine-gemedieerde endocytose bestuderen met behulp van levende celbeeldvorming en biochemische assays in gist. Deze methode onthult hoe adaptor-eiwitten zoals Sla1p interacties met clathrine reguleren.

In vivo en in vitro studies van Adapter-clathrine Interactie

Meer video's verkennen