Name: Transfectie en mutagenese van Target genen in cellen Mosquito door Locked Nucleic Acid-gemodificeerde oligonucleotiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer site-directed mutagenese in Anopheles-muggen cellen via LNA-gemodificeerde oligonucleotiden. Deze methode maakt nauwkeurige nucleotidesubstitutie en genconversie-analyse met flowcytometrie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Abbie Spinner danken aan het California National Primate Research Center voor haar hulp bij flowcytometrie. Dit onderzoek werd ondersteund door de financiering van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799, en AI078183.

<ol><li> Vóór het begin van het protocol, is het van belang om vast te stellen dat de mug cellen die worden gebruikt in het experiment gezond zijn en op ~ 80% confluentie als aanhanger (figuur 1). Begroeid of ongezonde cellen zal resulteren in een lage transfectie-efficiëntie en geven inconsistente resultaten. </li><li> Warm-up van alle media voorafgaand aan in een 28 ° C waterbad te gebruiken gedurende 30 minuten. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 cellen nodig E5 medium: MEM, Earle's w / glutamine, 5% door warmte geïnactiveerd FCS, 0,2% D-glucose, 1% penicilline-streptomycine antibiotica, en 1% niet-essentiële aminozuren. </li><li> A. gambiae SUA5B cellen nodig S2 medium: Schneider Drosophila medium, 5% door warmte geïnactiveerd FCS en 1% penicilline-streptomycine antibiotica </li></ol></li><li> Ontdooien en op te slaan alle transfectiereagens materialen, plasmiden, en oligonucleotiden op ijs. </li><li> Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap met steriele techniek. </li><li> Voor hechtende cellen (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspireren uit oude media, zonder verstoring van de cellen, voeg een equivalent volume van verse media die is opgewarmd tot 28 ° C, en daarna afspoelen van de cellen van de onderkant van de fles met een pipet. </li><li> De concentratie van de cellen moet worden bepaald en aangepast tot een uiteindelijke concentratie van 1x10 6 cellen / ml. Cellen kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur tijdens de voorbereiding transfectiereagens materialen. </li><li> Voeg 1 mL van de mug cellen (1x10 6 cellen / ml) aan elk putje van een 6-wells plaat. Stel een plaat voor elk experimentele conditie (zie hieronder). Tabel I wordt een pipetteren regeling voor een algemeen transfectie. Tabel II schetst vijf voorwaarden om te testen voor een succesvolle mutagenese van een enkele nucleotide met behulp van BFP-specifieke LNA-ons. De eerste twee, pGFP en pBFP, zijn positieve en negatieve controles, respectievelijk. De overige zijn experimentele omstandigheden van pBFPs met toenemende concentraties van BFP-specifieke LNA-ons. In stappen 8 tot en met 12, dus toe te voegen voldoende hoeveelheden van de reagentia voor elke conditie. </li><li> Overdracht plasmide DNA om een ​​steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg geschikt volume van het EG-buffer. <ol class="lalpha"><li> Voor een pi plasmide DNA (1 pg / pl), voeg 99 ul van het EG-buffer. </li><li> Voor een pi pGFP (1μg / pi), voeg 99 ul van het EG-buffer. </li><li> Voor een pi pBFP (1μg / pi), voeg 99 ul van het EG-buffer. </li><li> Voor een pi pBFP (1μg / il) en 1 pi ON (ug / ul), voeg 98 ul van het EG-buffer. </li><li> Voor een pi pBFP (1μg / pi) en 5 pi ON (1μg / pi), voeg 94 ul van het EG-buffer. </li><li> Voor een pi pBFP (1μg / il) en 10 pi ON (1μg / pi), voeg 89 ul van het EG-buffer. </li></ol></li><li> Dan voeg langzaam Enhancer per 1 ug van de gebruikte DNA. <ol class="lalpha"><li> Voor 1 ui plasmide DNA, voeg 8 pi Enhancer. </li><li> Voor 1 ui pGFP, voeg dan 8 pi Enhancer. </li><li> Voor 1 ui pBFP, voeg dan 8 pi Enhancer. </li><li> Voor een pi pBFP en 1 uL ON, voeg 16 ul Enhancer. </li><li> Voor 1 ui pBFP en 5 microliter ON, voeg 48 ul Enhancer. </li><li> Voor 1 pL pBFP en 10 uL ON, voeg 88 ul Enhancer. </li></ol></li><li> Vortex DNA / buffer / Enhancer mengsel voor 1 seconde en zorg ervoor dat alle van de oplossing is op de bodem van de buis. Dan incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg Effectene reagens per 1 ug plasmide DNA en vortex voor 10 sec. Bevestigen dat alle van de oplossing is op de bodem van de buis en dan incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. <ol class="lalpha"><li> Voor 1 ui plasmide DNA, voeg 10 ul Effectene (tabel I). </li><li> Voor 1 ui pGFP, voeg 10 ul Effectene (Tabel II). </li><li> Voor 1 ui pBFP, voeg 10 ul Effectene (Tabel II). </li><li> Voor een pi pBFP en 1 uL ON, voeg 20 ul Effectene (Tabel II). </li><li> Voor 1 ui pBFP en 5 microliter ON, voeg 60 ul Effectene (Tabel II). </li><li> Voor 1 pL pBFP en 10 uL ON, voeg 110 ul Effectene (Tabel II). </li></ol></li><li> Breng elke buis tot een eindvolume van 1000 il door het toevoegen van warm media druppelsgewijs aan de DNA / buffer / Enhancer / Effectene mengsel. DNA kan neerslaan op dit moment als de media te snel toegevoegd. Voorzichtig mengen door en neer te pipetteren 3-4 keer. <ol class="lalpha"><li> Voor 1 ui plasmide DNA, voeg 882 ul media (tabel I). </li><li> Voor 1 ui pGFP, voeg 882 ul media (tabel II). </li><li> Voor 1 ui pBFP, voeg 882 ul media (tabel II). </li><li> Voor een pi pBFP en 1 uL ON, voeg 864 ul media (tabel II). </li><li> Voor 1 ui pBFP en 5 microliter ON, voeg 792 ul media (tabel II). </li><li> Voor 1 pL pBFP en 10 uL ON, voeg 702 ul media (tabel II). </li></ol></li><li> Volgende voeg langzaam 1 ml van de juiste DNA / Enhancer / Effectene mengsel aan elk putje een druppel per keer. </li><li> Swirl de plaat voorzichtig om een ​​uniforme verdeling van de cellen en transfectie mix te garanderen. Incubate-cellen in normale groeiomstandigheden. </li><li> Een dag na transfectie, Zuig voorzichtig uit de media en langzaam te vervangen door een gelijkwaardige hoeveelheid vers warm media. Het is belangrijk om niet de cel lagen verstoren op de bodem van de putten bij het doen van dit. </li><li> Twee dagen na transfectie onderzoeken positieve controle cellen getransfecteerd met pGFP bij tl-microscoop om transfectie-efficiëntie (figuur 2) te bepalen. </li><li> SUA5B cellen groeien zeer snel en zullen overwoekerd. Vier dagen na transfectie dun deze cellen door opzuigen uit de oude media en het toevoegen van langzaam een ​​gelijkwaardige hoeveelheid vers warm media. </li><li> Na het toevoegen van nieuwe media aan de putjes, los alle cellen van de onderkant van elk goed door pipetteren op en neer, gooi de helft van het volume (1 ml) van de cel mengsel en voeg 1 ml vers warm media om het uiteindelijke volume te brengen tot 2 mL. </li><li> Dagelijkse controle cellen die ervoor zorgen dat ze gezond zijn en niet overwoekerd, dun als dat nodig is. </li><li> Laat de cellen onder normale omstandigheden groeien vijf tot zeven dagen na transfectie alvorens ze te verzamelen voor analyse. </li><li> Om vijf tot zeven dagen na transfectie, het verzamelen van de cellen door aspireren van de oude media in alle putten en het toevoegen van 1 ml steriel kamertemperatuur PBS aan elk putje. </li><li> Los cellen van de onderkant van de goed door en neer te pipetteren en overdracht celmengsel tot 5 ml snap cap buizen en direct te analyseren cellen via flowcytometrie. </li></ol> Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Ongetransfecteerde gezonde A. stephensi MSQ43 (A) en A. gambiae SUA5B (B) cellen op ongeveer 80% confluentie. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. A. stephensi MSQ43 (A) en A. gambiae SUA5B (B) cellen getransfecteerd met positieve controle GFP plasmide uiten. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Flowcytometrie gegevens bevestigen conversie van BFP om GFP via mutagenese van een enkele nucleotide na transfectie met BFP-specifieke opgesloten nucleïnezuur-gemodificeerde oligonucleotiden (LNA-ons). SUA5B cellen werden getransfecteerd met een GFP expressie plasmide (pGFP) als positieve controle, met een BFP uiten van plasmide (pBFP) als een negatieve controle, of met pBFP en toenemende concentraties van BFP-specifieke LNA-ons. (A) Poortsignalen strategie voor flowcytometrie gegevens waaruit blijkt van links naar rechts: vooruit versus zijwaartse verstrooiing van levende cellen, propidiumjodide (PI) negatieve cellen, en GFP positieve cellen vijf dagen na transfectie. (B) Grafiek van het percentage van de GFP positieve cellen getoond in (A) na transfectie met pBFP en de toenemende concentraties van LNA-ons. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Tabel I. Transfectie omstandigheden. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tabel 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 2"> Tabel II. Transfectie voorwaarden worden gebruikt in figuur 1.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Hier presenteren wij een in-vitro-methode en aanwijzingen voor gerichte omzetting van een enkele nucleotide in een episomaal gen doelwit na transfectie van LNA-ONS in A. stephensi en A. gambiae cellen. LNA-ON-gemedieerde genconversie vereist inductie van een site-specifieke DNA-herstel reactie; onze gegevens blijkt dat de mug cellen kunnen dit mechanisme voor site-specifieke mutagenese ondersteuning. Terwijl de hier gepresenteerde methode is gebaseerd op de omzetting van een episomaal doel, on...

<table><tbody><tr><td>Effectene transfectiereagens</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>GFP-controleplasmide (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>BFP-plasmide (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Gift van Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>LNA-ONs </td><td></td><td></td><td>Gift van Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;s m. glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>Faalkalverse serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>10% D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine antibioticum</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>6-well kweekplaten</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

transfectie en mutagenese van target genen in cellen mosquito door locked nucleic acid-gemodificeerde oligonucleotiden

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasieten, de verwekker van malaria, worden overgedragen door de beten van geïnfecteerde Anopheles muggen wat resulteert in meer dan 250 miljoen nieuwe infecties per jaar. Ondanks tientallen jaren van onderzoek, is er nog steeds geen vaccin tegen malaria, met de nadruk op de noodzaak van nieuwe bestrijdingsstrategieën. Een innovatieve aanpak is het gebruik van genetisch gemodificeerde muggen zij daadwerkelijk toezicht kunnen malaria parasiet transmissie. Opzettelijke veranderingen van de cel signaalwegen in de mug, via gerichte mutagenese, is gebleken dat parasiet ontwikkeling 1 te reguleren. Uit deze studies, kunnen we beginnen om potentiële gen doelstellingen voor de transformatie te identificeren. Gerichte mutagenese is traditioneel gebaseerd op de homologe recombinatie tussen een target-gen en een groot DNA-molecuul. Echter, de bouw en het gebruik van dergelijke complexe DNA-moleculen voor het genereren van stabiel getransformeerde cellijnen is kostbaar, tijdrovend en vaak inefficiënt. Daarom is een strategie met behulp van gesloten nucleïnezuur-gemodificeerde oligonucleotiden (LNA-ons) biedt een bruikbaar alternatief voor de invoering van kunstmatige single nucleotide substituties in episomale en chromosomaal DNA-gen doelstellingen (beoordeeld in 2). LNA-ON-gemedieerde gerichte mutagenese is gebruikt om puntmutaties introduceren in interessante genen in gekweekte cellen van zowel de gist en muizen 3,4. We tonen hier dat LNA-ons kunnen worden gebruikt om een enkele nucleotide verandering in een getransfecteerde episomale doel dat resulteert in een switch van blauw fluorescerend eiwit (BFP) uitdrukking aan green fluorescent protein (GFP) tot uitdrukking in zowel de Anopheles gambiae en Anopheles stephensi cellen te introduceren . Deze conversie toont voor het eerst dat een effectieve mutagenese van target genen in mug cellen kan worden gemedieerd door LNA-ons en suggereert dat deze techniek van toepassing kunnen zijn op mutagenese van chromosomale doelen in vitro en in vivo.

Oligonucleotiden kunnen worden gebruikt om de website speciaal een single nucleotide van getransfecteerde doelwitgenen vervanger in beide<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; En<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Cellen.

Transfectie en mutagenese van Target genen in cellen Mosquito door Locked Nucleic Acid-gemodificeerde oligonucleotiden

Plasmodium-parasieten, de veroorzakers van malaria, worden overgedragen via de beten van geïnfecteerde Anopheles-muggen, wat resulteert in meer dan 250 miljoen nieuwe ...

Het algemene doel van deze procedure is om een nieuwe strategie voor site-gerichte mutagenese in mugcellen van de soort Anopheles te demonstreren. Dit wordt bereikt door eerst gezonde gecultureerde cellen voor transfectie voor te bereiden. De cellen worden vervolgens getransfecteerd met de juiste controle- en test-DNA's door middel van de toevoeging van transfectiereagentia.De volgende stap van de procedure is het bewaken van de controlecellen op fluorescentie en het verminderen van de dichtheid van de experimentele cellen. Tot slot kunnen de genconversiefrequenties in de experimentele cellen worden bepaald met behulp van flowcytometrie vijf tot zeven dagen na transfectie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die site-directed mutagenese van een episomaal gentarget aantonen door middel van DNA-herstel geïnduceerd door locked nucleic acid oligonucleotiden.Hallo, ik ben Dr. Nazy Pacor van het laboratorium van Dr. Shirley Lockhart van de afdeling Medische Microbiologie en Immunologie aan de University of California Davis. Vandaag laten we u een nieuwe procedure zien voor site-directed mutagenese van Anopheles-muggencellen. Wij gebruiken deze procedure om de functie van genen van de aangeboren immuunrespons van muggen te bestuderen via site-directed mutagenese.Laten we beginnen. Verkrijg voorafgaand aan de start van het protocol muskietencellen die gezond zijn en ongeveer 80% confluent zijn. Adherente, overgegroeide of ongezonde cellen zullen leiden tot een lage transfectie-efficiëntie en inconsistente resultaten geven.Dit protocol wordt gedemonstreerd met ananais Gambier SUA vijf B-cellen. Echter kunnen ook Ananais ensi MS Q4 drie cellen worden gebruikt. Begin de opstelling voor de transfectie door S twee media gedurende 30 minuten op te warmen in een waterbad van 28 °C.Plaats alle materialen voor het transfectiereagens, het plasmide en de oligonucleotiden op ijs. Zuig met steriele techniek in een weefselkweekkast het oude medium af zonder de cellen te verstoren, voeg een gelijk volume vers opgewarmd medium toe en spoel de cellen van de bodem van de kolf af. Bepaal vervolgens met een pipet de celconcentratie en pas deze aan naar een uiteindelijke concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter.Zodra de uiteindelijke concentratie is aangepast, voegt u één milliliter mugencellen toe aan elke put van een zesputsplaat. Terwijl de cellen op kamertemperatuur kunnen blijven tijdens het voorbereiden van de transfectiereagentia, wordt het plasmid-DNA overgebracht naar steriele microcentrifugebuisjes. Hierbij wordt een plasmid dat groen fluorescent proteïne tot expressie brengt gebruikt als positieve controle en een plasmid dat blauw fluorescent proteïne tot expressie brengt als negatieve controle.Het test-DNA bevat ook het BFP-exprimerende plasmide, maar met toenemende concentraties van BFP-specifiek locked nucleic acid, gemodificeerde oligonucleotiden of LNA-os. Nadat het DNA is gealiquoteerd, voegt u 99 µL kage- en EC-buffer toe per microgram plasmid-DNA en L-N-A-O-N. Voeg vervolgens langzaam acht µL enhancer toe per gebruikte microgram DNA en vortex het mengsel van DNA, buffer en enhancer.Centrifuge de oplossing kortstondig gedurende één seconde en incubeer de monsters vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg 10 µL van het beïnvloedende reagens toe per 1 µg plasma-DNA en vortex gedurende 10 seconden. Centrifugeer de oplossing kortstondig naar de bodem van de buisjes en incubeer vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur. Breng na incubatie het eindvolume van elk buisje aan tot 1000 µL door langzaam vers verwarmd medium toe te voegen aan het mengsel van DNA-buffer-enhancer en beïnvloedend reagens. Het DNA kan op dit punt neerslaan als het medium te snel wordt toegevoegd; meng voorzichtig door drie of vier keer op en neer te pipetteren.Voeg ten slotte langzaam één milliliter van het passende mengsel met DNA-enhancer toe aan elke put met cellen. Doe dit druppel voor druppel. Draai de plaat voorzichtig rond om een gelijkmatige verdeling van de cellen en het transectiemengsel te waarborgen.Incubeer de cellen onder normale groeicondities één dag na transfectie, aspireer voorzichtig het medium van de cellen en vervang dit langzaam door een gelijk volume vers opgewarmd medium. Let erop dat de cellagen op de bodem van de putjes niet worden verstoord. Onderzoek twee dagen na transfectie de positieve controlecellen die zijn getransfecteerd met GFP-expressieplasmid onder een fluorescentiemicroscoop om de transfectie-efficiëntie te bepalen.Vier dagen na transfectie van de B-cellen moeten deze worden uitgedund, aangezien ze zeer snel groeien en anders overwoekerd raken. Doe dit door het oude medium van de cellen af te zuigen en langzaam een gelijk volume vers, opgewarmd medium toe te voegen. Nadat het nieuwe medium aan de wells is toegevoegd, worden alle cellen van de bodem van elke well losgemaakt door met de pipet op en neer te gaan. Verwijder de helft van het volume van het cellengemengsel en voeg één milliliter vers, opgewarmd medium toe om het eindvolume op twee milliliter te brengen.Controleer de cellen dagelijks om er zeker van te zijn dat ze gezond zijn en niet overgroeid. Dun ze indien nodig uit. Laat de cellen vijf tot zeven dagen na transfectie onder normale omstandigheden groeien voordat ze worden geoogst voor analyse.Verzamel vijf tot zeven dagen na transfectie de cellen door het oude medium van de cellen af te aspireren en aan elk putje één milliliter steriele PBS op kamertemperatuur toe te voegen. Detacheer de cellen van de bodem van elk putje door met een pipet op en neer te bewegen. Breng het cellengemengsel tot slot over in buisjes van vijf milliliter met snap-cap en analyseer de cellen onmiddellijk via flowcytometrie.Een overzicht. MS Q4 drie en een gambier UA vijf B-cellen werden getransfecteerd met een positieve controle GFP-expressieplasmide. De cellen worden getoond onder licht- en fluorescentiemicroscopie en als samengevoegd beeld. Flowcytometrie-gegevens bevestigen de conversie van BFP naar GFP via mutagenese van een enkel nucleotide na transfectie met BFP-specifieke LNAO Ns. SUA vijf B-cellen werden getransfecteerd met het GFP-expressieplasmide als positieve controle, met een BFP-expressieplasmide als negatieve controle, of met een BFP-expressieplasmide en toenemende concentraties BFP-specifieke LNAO ns.De gating-strategie voor de flowcytometrie-gegevens toont de forward scatter versus side scatter van levende cellen, propidiumjodide-negatieve cellen en GFP-positieve cellen vijf dagen na transfectie; het percentage GFP-positieve cellen na transfectie met een BFP-expresserend plasmide en toenemende concentraties LNAO NS is hier in grafische vorm weergegeven, wat de conversie van BFP naar GFP door L aos bevestigt. We hebben zojuist een nieuwe procedure gedemonstreerd voor de site-directed mutagenese van anomalies in mugcellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen gezond zijn en de juiste dichtheid hebben voorafgaand aan de transfectie.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

transfection-mutagenesis-target-genes-mosquito-cells-locked-nucleic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Wij rapporteren met behulp van een kunstmatige intronic kleine RNA expressie strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Een gedetailleerde procedure voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de rAaeDV vectoren evenals wat larvale infectie wordt beschreven.

Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.

Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

Het bipartiete GAL4-UAS systeem is een veelzijdig instrument voor modificatie van genexpressie op een gecontroleerde spatiotemporale manier die functionele genetische analyse in Anopheles gambiae mogelijk maakt. De beschreven procedures voor het gebruik van dit systeem zijn een semi-gestandaardiseerde kloonstrategie, seksing en screening van poppen op fluorescerende eiwitmarkers en embryofixatie.

Gebruik van het GAL4-UAS-systeem voor functionele genetica in Anopheles gambiae

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

De protocollen die hier worden gerapporteerd, illustreren drie alternatieve manieren om de prestaties van genetisch gemanipuleerde muggen te beoordelen die bestemd zijn voor vectorcontrole in laboratorium-ingesloten kleine kooiproeven. Elk protocol is afgestemd op de specifieke modificatie die de muggenstam draagt (gene drive of non-gene drive) en de soorten gemeten parameters.

Laboratoriumproeven met kleine kooien van genetisch gemanipuleerde anophelinemuggen

Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor genoombewerking door middel van embryonale micro-injectie in de mug A. aegypti met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie.

Genoombewerking in de gelekoortsmug Aedes aegypti met behulp van CRISPR-Cas9

Leer site-directed mutagenese in Anopheles-muggen cellen via LNA-gemodificeerde oligonucleotiden. Deze methode maakt nauwkeurige nucleotidesubstitutie en genconversie-analyse met flowcytometrie mogelijk.

Transfectie en mutagenese van Target genen in cellen Mosquito door Locked Nucleic Acid-gemodificeerde oligonucleotiden

Meer video's verkennen