Peptiden van faag display bibliotheek Modulate genexpressie in mesenchymale cellen en versterken Osteogenesis in Unicortical Bone Gebreken

Het algemene doel van dit experiment is het identificeren van sequenties die de differentiatie van mesenchymale cellen potentieren en botherstel bevorderen. De eerste stap is het isoleren van de fagen die aan bot binden via biopanning. Vervolgens worden de peptidesequenties geïdentificeerd die binden aan mesenchymale cellen, waarbij tevens de daaropvolgende veranderingen in genexpressie worden bepaald.

Voer experimenten uit om vast te stellen hoe de peptidevolgordes aan het bot kunnen worden afgeleverd voor regeneratieve doeleinden. Onderzoek als laatste stap het botherstel histologisch; samen kunnen deze resultaten belangrijke inzichten bieden in de mechanismen van celdifferentiatie in vitro en botherstel in vivo. De voordelen van het gebruik van de biopanning-techniek met een phage display-bibliotheek zijn dat we in staat waren om peptiden te identificeren die zich op het bot richten en gebruikt kunnen worden om de differentiatie van mesenchymale cellen te stimuleren en botherstel te bevorderen.

Uiteindelijk kunnen deze peptidevolgordes nuttig zijn in therapeutische modaliteiten voor botherstel en voor de behandeling van botverlies, zoals osteopenie en osteoporose. Op basis van een studie waarin ULA en Pascal aantoonden dat biopanning kan worden gebruikt om peptidevolgordes te isoleren die zich richten op bloedvaten, hebben we ervoor gekozen deze methode aan te passen om mechanismen in het bot te onderzoeken. Voor de in vivo biopanning-procedure werden 10¹⁰ plaque-vormende eenheden van de N-E-B-P-H-D 12 phage display peptide-bibliotheek geperfuseerd door het hart van een 10 weken oude valve C-muis.

Euthanaseer de muis na ongeveer vijf minuten, leg de femura vrij en ontleed deze, snijd de uiteinden eraf en verwijder het beenmerg. Spoel het linker femur zowel aan de binnenzijde als de buitenzijde 10 keer met PBS. Voeg het bot vervolgens toe aan ER 2 5 3 7 bacteriën.

Om niet-gebonden fagen te verwijderen, wordt 2% gedroogde magere melk in een spuit met een 21 gauge naald gebruikt om het intermediaire kanaal van het rechter dijbeen 10 keer te spoelen. Elueer vervolgens de gebonden fagen uit het intermediaire kanaal met zoutzuur-glycinebuffer, pH 2.2, geneutraliseerd met 1 M Tris.

Om de faag te amplificeren, voegt u EIT toe aan ER 2 5 3 7 bacteriën en kweekt u deze gedurende 4,5 uur. Breng de supernatanten voorzichtig over naar nieuwe buisjes en precipiteer de faag drie keer door toevoeging van polyethyleenglycol. Natriumchloride-oplossing, incubeer de buisjes gedurende de nacht bij vier graden Celsius.

Resuspendeer tot slot het pellet in TBS met 0,02% natriumazide. Plaats de faag op platen om de plaque-vormende eenheden van de geamplificeerde EIT's te bepalen. Herhaal de in vivo bio-panning procedure vier keer voor zowel de geëludeerde als de niet-geëludeerde faag.

Amplificeer gepoolde fagen in bacteriële culturen. Purificeer en kwantificeer de DNA-sequentie, het uiteindelijke fage-DNA, met behulp van de 98 primer die bij de phage display-kit is geleverd. Bereken vervolgens de frequentie van de representatie van de fage-DNA-sequentie.

Synthetiseer nu peptiden met een glycine-glycine-glycine-serine-lysine-sequentie en amplificeer D1-cellen, een gekloonde muis-multipotentiële beenmergstromale cellijn die in ons laboratorium is ontwikkeld, tot 90% confluentie. Behandel de cellen met trypsine en centrifugeer om een pellet te vormen en tel deze voor peptidekleuring; zaai de cellen uit op met gelatine gecoate chamber slide-wells en kweek deze gedurende 24 uur.

Was de cellen met PBS en fixeer deze gedurende 30 minuten met 4%paraldehyde. Voer vervolgens blokkeringsincubaties uit met glycine, gevolgd door BSA Aden en BBSA. Biotine-blokkeringsoplossingen.

Voeg 100 micromolair gebiotineerde L7- en R1-peptiden toe. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS gedurende vijf minuten per keer. Voeg een verdunning van 1:1000 LOR strippin toe, dek af met folie en incubeer 30 minuten in een donkere lade.

Was de cellen en monteer de dekglasjes met Vector Shield montagemedium. Analyseer de preparaten vervolgens 24 uur vóór de operatie onder een fluorescentiemicroscoop. Week de gelfoamcilinders.

Overbreng de gelfoam-cilinders met 20 µM peptide L7 of R1, of PBS-buffer zonder peptide, naar steriele 12-wells kweekschalen en bewaar deze koel bij 4 °C tot aan de operatie. Plaats het gelfoam-composiet op ijs tot aan gebruik.

Maak met een pneumatische frees onder zoutoplossing-irrigatie een groot, langwerpig unicorticaal defect van drie millimeter breed en acht millimeter lang. Behandel het botdefect met voorbereide gelfoams door alle geïmplanteerde scaffolds met voorzichtig tikken in te brengen. Euthanaseer de ratten en verzamel de tibia op vastgestelde tijdstippen, waarbij zorgvuldig op het botdefect wordt gecontroleerd, en fixeer de geoogste tibia in 10% neutraal gebufferde formaline voor paraffine-inslijten.

Kleur tot slot alle weefselcoupes met hematine eosine om de osteomatrix te labelen. Met fluoresceïne-isothiocyanaat gelabeld Aden is microscopische detectie mogelijk van de binding van peptiden op in vitro gekweekte cellen. Hier binden de peptiden aan mesenchymale cellen in kweek om het osteogene effect van peptiden op cellen te bepalen.

In vitro mesenchymale cellen in kweek kunnen worden behandeld met testpeptiden om veranderingen in de celmorfologie te bepalen. Op dag vier beginnen de cellen bijvoorbeeld te aggregeren en de aggregaten worden na verloop van tijd groter om knobbels te vormen. Interessant is dat botsecties gekleurd met h en e autofluorescentie vertonen onder uv-licht.

Dit grotere contrast tussen bot- en niet-botweefsels vergemakkelijkt analyses om de aanwezigheid van bot in de secties te kwantificeren, om zo het botherstel in de defecten te bepalen die zijn behandeld met gelfoam plus peptide. In vergelijking met gelfoam alleen, vertoonden de defecten die zijn gevuld met plus peptide in dit geval de grootste hoeveelheid corticaal herstel na verloop van tijd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uiterst methodisch te zijn bij de gegevensinvoer, vanwege het grote aantal specimens dat onvermijdelijk zal accumuleren in de tijd tot het moment dat de uiteindelijke groep peptiden is geselecteerd.

De ontwikkeling van in vivo biopanning als techniek om peptiden te identificeren die zich op het bot richten, betekent dat we nu potentiële geneesmiddelen hebben die kunnen worden ingezet als therapie voor botherstel en bij botverlies. Een van de mechanismen die ten grondslag ligt aan botherstel is ook betrokken bij botverlies. Het gedetailleerder begrijpen van deze mechanismen en het beschikken over instrumenten die kunnen worden gebruikt voor de behandeling van aandoeningen zoals vertraagde fractuurgenezing en osteoporose, zal helpen bij het verbeteren van de therapieën die voor de gezondheidszorg kunnen worden ontwikkeld.