Peptiden van faag display bibliotheek Modulate genexpressie in mesenchymale cellen en versterken Osteogenesis in Unicortical Bone Gebreken
10 december 2010
Een faag display bibliotheek werd gebruikt om de peptide-sequenties die zich richten op het bot te identificeren. Het doel was om het effect van deze peptiden op mesenchymale cel differentiatie te onderzoeken en om het effect op het bot regeneratie te bepalen.
Het algemene doel van dit experiment is om sequenties te identificeren die de differentiatie van mesenchymale cellen potentiëren en botreparatie bevorderen. De eerste stap is om door middel van biop-panning de faag te isoleren die zich bindt aan bot. Ga verder met het identificeren van de peptidesequenties die zich binden aan mesenchymale cellen en bepaal ook de daaropvolgende veranderingen in genexpressie.
Voer experimenten uit om te bepalen hoe de peptidesequenties kunnen worden afgeleverd aan bot voor regeneratieve doeleinden. Als laatste stap onderzoek je de botreparatie histologisch. Samen kunnen de resultaten belangrijke inzichten bieden in mechanismen van celdifferentiatie in vitro en botreparatie in vivo. De voordelen van het gebruik van de biop-panningtechniek met een fagendisplaybibliotheek zijn dat we sequenties konden identificeren die zich richten op bot en die kunnen worden gebruikt om de differentiatie van mesenchymale cellen te stimuleren en botreparatie te bevorderen.
Uiteindelijk kunnen deze peptidesequenties nuttig zijn in therapeutische modaliteiten voor botreparatie en voor de behandeling van botverlies zoals osteopenie en osteoporose. Op basis van een studie waarin ULA en Pascal aantoonden dat biop-panning kan worden gebruikt om peptidesequenties te isoleren die zich richten op bloedvaten, hebben we ervoor gekozen deze methode aan te passen om mechanismen in bot te onderzoeken. Voor de in vivo biop-panningprocedure werd 10 keer 10 tot de 10e plaque-forming units van de N-E-B-P-H-D 12 fagendisplay-peptidebibliotheek door het hart van een 10 weken oude valve C muis geperfundeerd.
Na ongeveer vijf minuten, euthanaseer de muis, leg de femurs bloot en ontleed ze, snijd de uiteinden af en verwijder het beenmerg. Spoel het linkerdijbeen zowel binnen als buiten met PBS 10 keer. Voeg vervolgens het bot toe aan ER 2 5 3 7 bacteriën.
Om niet-gebonden fagen te verwijderen, gebruik 2% gedroogde mageremelk in een spuit met een 21 gauge naald om het intermediaire kanaal van het rechter dijbeen 10 keer te spoelen. Elueer nu de gebonden fagen uit het intermediaire kanaal met zoutzuurgelycinebuffer. pH 2,2 geneutraliseerd met één mo la triss.
Om de faag te versterken, voeg EIT toe aan ER 2 5 3 7 bacteriën en kweek gedurende 4,5 uur. Breng de supernatanten voorzichtig over in verse buisjes en precipiteer de faag drie keer door de toevoeging van polyethyleenglycol. Natriumchlorideoplossing, incubeer de buisjes een nacht bij vier graden Celsius.
Hersuspendeer het pellet in TBS met 0,02% Natriumazid. Plaqueer de faag op platen om de plaquevormende eenheden van de versterkte EIT's te bepalen. Herhaal de in vivo biop-panningprocedure voor zowel de elueerde als niet-elueerde faag vier keer.
Versterk gepoolde faag in bacterieculturen. Zuiver en kwantificeer de DNA-sequentie, de uiteindelijke faag-DNA-sequentie met behulp van 98 primers die worden geleverd met de fagendisplaykit. Belangrijk is het berekenen van de frequentie van de vertegenwoordiging van faag-DNA-sequenties.
Synthetiseer nu peptiden met een glycineglycineglycine sine lysine-sequentiezaad en versterk D een cellen. Een gekloonde muis multipotente beenmergstromacelstamcellijn die in ons lab werd ontwikkeld bij 90% confluëntie. Trypsineer de cellen en centrifugeer om het pellet te bepalen en tel voor peptidekleuring platen op gelatine gecoate kamerputjes en kweek gedurende 24 uur.
Was de cellen met PBS en fixeer met 4% paraldeyhyde gedurende 30 minuten. Voer nu blokkerende incubaties uit met glycine gevolgd door BSA Aden en BBSA. Biotine blokkerende oplossingen.
Voeg 100 micromolar van biotinyleerde L zeven en R een peptiden toe. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS gedurende vijf minuten elk. Voeg een 1 op 1000 verdunning van LOR strippin cover en folie toe en incubeer in een donkere lade gedurende 30 minuten.
Was de cellen en monteer de deksels met vector shield montagemedium. Analyseer nu de dia's onder een fluorescentiemicroscoop 24 uur voor de operatie. Week de gelfoam cilinders in.
Breng de gelfoam cilinders met 20 micromolar peptide, hetzij L zeven of R een of PBS buffer zonder peptide, over naar steriele 12-putjes kweekschotels en bewaar ze een nacht in de koelkast bij vier graden Celsius op het moment van de operatie. Plaats de gelphone-composiet op ijs tot gebruik.
Gebruik een pneumatische boor onder saline irrigatie om een groot langwerpig uni corticaal defect van drie millimeter breedte door acht millimeter lengte te maken. Behandel het botdefect met voorbereide gelfoams door alle geïmplanteerde scaffolds in te brengen met zachtjes tikken. Euthanaseer de ratten en verzamel tibia op gedefinieerde tijdstippen, controleer zorgvuldig op het botdefect en fixeer de geoogste tibia in 10% neutraal gebufferd formaline voor paraffine secties.
Vervolgens kleuren alle weefselsecties met hematine eosine om de osteomatrix te labelen. Fluoresceïne isothiocyanate gelabelde Aden maakt microscopische detectie mogelijk van de binding van peptiden op cellen die in vitro worden gekweekt. Hier binden de peptiden zich aan mesenchymale cellen in cultuur om het osteogene effect van peptiden op cellen te bepalen.
In vitro mesenchymale cellen in cultuur kunnen worden behandeld met testpeptiden om veranderingen in celmorfologie te bepalen. Bijvoorbeeld op dag vier beginnen de cellen zich te aggregaten en de aggregaten vergroten zich in de tijd tot knobbeltjes. Interessant is dat botsecties gekleurd met h en e autofluorescentie onder UV-licht.
Dit grotere contrast tussen bot- en niet-botweefsels vergemakkelijkt analyse. Kwantificeer de aanwezigheid van bot in de secties om botreparatie te bepalen in de defecten behandeld met gelfoam plus peptide. Door vergelijking met alleen gelfoam, tonen defecten die werden gevuld met plus peptide de grootste hoeveelheid corticale reparatie met de tijd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uiterst methodisch te zijn bij het invoeren van gegevens vanwege het grote aantal monsters dat onvermijdelijk zal accumuleren totdat u de uiteindelijke groep peptiden heeft geselecteerd.
De ontwikkeling van in vivo biop-panning als een techniek om peptiden te identificeren die zich richten op bot betekent dat we nu potentiële medicijnen hebben die kunnen worden gebruik
Overzicht
Deze studie onderzoekt peptidesequenties die zich richten op bot en hun effecten op differentiatie van mesenchymatische cellen en botregeneratie. Met behulp van een faagdisplaybibliotheek, wil het onderzoek peptiden identificeren die botreparatiemechanismen kunnen verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Botregeneratie
- Differentiatie van mesenchymatische cellen
- Faagdisplaytechnologie
Achtergrond
- Botreparatie is cruciaal voor de behandeling van aandoeningen zoals osteopenie en osteoporose.
- Het identificeren van peptiden die zich richten op bot kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
- Biopanning is een techniek die wordt gebruikt om specifieke peptidesequenties te isoleren.
- Het begrijpen van de mechanismen van celdifferentiatie kan regeneratieve geneeskunde verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Peptidesequenties identificeren die differentiatie van mesenchymatische cellen bevorderen.
- Het potentieel van deze peptiden beoordelen om botreparatie te verbeteren.
- De bezorgmethoden voor deze peptiden naar botweefsel verkennen.
Gebruikte methoden
- In vivo biopanning om faag te isoleren die zich bindt aan bot.
- Genexpressieanalyse van mesenchymatische cellen behandeld met geïdentificeerde peptiden.
- Histologische onderzoek van botreparatie in behandelde defecten.
- Microscopische analyse van peptidebinding aan cellen in cultuur.
Belangrijkste resultaten
- Geïdentificeerde peptiden die effectief binden aan mesenchymatische cellen.
- Verbeterde botreparatie aangetoond in defecten behandeld met peptide-geladen scaffolds.
- Geobserveerde veranderingen in celmorfologie die indicatief zijn voor osteogene differentiatie.
- Histologische analyse bevestigde verhoogde corticale reparatie met peptidebehandeling.
Conclusies
- De studie biedt inzichten in peptide-gemedieerde botreparatiemechanismen.
- Geïdentificeerde peptiden hebben potentiële therapeutische toepassingen voor botverliesaandoeningen.
- Toekomstig onderzoek zou de rol van deze peptiden in botregeneratie verder kunnen verduidelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This study demonstrates how phage display-derived peptides can modulate mesenchymal cell differentiation to enhance bone repair, offering a target validation strategy for regenerative therapeutics. The approach supports early discovery by identifying bioactive sequences that potentiate osteogenesis in preclinical models. Such target-de-risking tools improve predictive confidence in bone anabolic pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies peptides that bind bone and modulate mesenchymal cell gene expression, supporting target hypothesis interrogation.
- Operational Value: Enables functional validation of osteogenic targets through alkaline phosphatase activity and nodule formation assays.
- Predictive Value: Increases confidence in lead selection by linking peptide binding to Runx2, Osterix, BSP, and Osteocalcin upregulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reproducible in vitro system to screen peptides for osteogenic potential using mesenchymal cell differentiation readouts.
- Operational Value: Standardizes assay conditions via collagen sponge delivery and histological quantification of cortical repair.
- Scalability Value: Supports phage display library screening for peptide candidates with defined binding and functional outputs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity from in vitro mesenchymal differentiation to in vivo unicortical defect repair.
- Operational Value: Uses collagen matrix delivery to enable standardized preclinical testing of peptide therapeutics.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by linking peptide treatment to both gene expression changes and histological bone formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation in bone repair models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of peptide-mediated mesenchymal cell differentiation and pathway clarification via Runx2/Osterix axis.
- Screening: Enables assay-ready systems for evaluating peptide effects on alkaline phosphatase and mineralization nodules.
- Analytics: Generates quantitative gene expression and histological readouts to compare osteogenic potential across peptide candidates.
- Translational Research: Connects in vitro osteogenic markers to in vivo bone defect repair, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes phage display as a reusable platform for identifying tissue-targeting peptides across regenerative indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by linking peptide binding to functional osteogenic outcomes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible readouts for mesenchymal differentiation and bone repair across models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by de-risking osteoinductive mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of peptide candidates based on in vitro and in vivo efficacy data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, peptide synthesis, and mesenchymal cell culture.
- Needs infrastructure for in vivo biopanning, histological staining, and fluorescent microscopy.
- Demands standardization of peptide dosing, collagen scaffold preparation, and defect model surgery.
- Involves adaptation considerations when translating peptide activity across different mesenchymal cell sources or defect models.
- Limited by the need for empirical validation of peptide stability and bioavailability in delivery matrices.
