Name: Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Leer hoe je alphavirus-transducerende systemen gebruikt om fluorescente markers in muggen te visualiseren. Deze methode volgt vectorinfectie en virustransmissie via GFP-expressie in Aedes- en Culex-soorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) en de RMRCE (NIH AI065357).

Het volgende protocol is geschreven voor de productie en het gebruik van een ATS op basis van de Sindbis virus MRE16. De ATS is ontworpen om GFP te drukken in de mug vector Aedes aegypti. cDNA Infectieuze klonen van een aantal alphaviruses (Sindbis virus, Chikungunya virus, O'nyong-Nyong virus, western paarden encephalitis virus) zijn op dit moment verkrijgbaar die zijn ontworpen als ATS's (tabel 1). Voor het beste resultaat plasmide DNA wordt versterkt in bacteriën zoals SURE bevoegde bacteriën (Stratagene / Agilent Technologies) om ongewenste recombinatie en het verlies van het virale cDNA te vermijden. Alle besmettelijke kloon plasmiden hebben een bacteriofaag T7 of SP6 promotor aan de onmiddellijke 5 'uiteinde van het virale cDNA voor de transcriptie van de volledige lengte genomisch RNA en een unieke restrictie endonuclease aan het 3' einde voor afvoer transcriptie. Voor elke ATS, moeten gebruikers gebruik maken van de juiste bacteriofaag DNA-afhankelijke RNA polymerase en unieke restrictie-endonuclease voor in vitro transcriptie van het virale RNA genoom. 1. Generatie van infectieuze RNA uit cDNA-kloon. <ol><li> Lineariseren de 5μg van de besmettelijke kloon plasmide (p5'dsMRE16 / GFP) met 20 eenheden van Xhol restrictie-enzym in een 100 ul reactie. Incubeer 2-3u bij 37 ° C </li><li> Zuiver gelineariseerde DNA met behulp van Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit alternatieve zuivering protocol, elueren DNA van spin-kolom met 50 pi RNase-vrij water. Plasmide concentratie moet ongeveer 1,0 g / ul. </li><li> In een RNase-vrij 0,2 ml PCR-buizen, set-up een 50 pi transcriptie reactie met gebruikmaking van Ambion MAXIscript Kit per protocol als volgt. <ul><li> 22,5 pi RNase-vrij dH 2 O <ul><li> 5,0 pi Gelineariseerde DNA-template (1,0 ug / ul) </li><li> 2,5 pi 10 mM ATP </li><li> 2,5 pi 10 mM CTP </li><li> 2,5 pi 10 mM UTP </li><li> 2,5 pi 1 mM GTP </li><li> 2,5 pi 10 mM cap analoge (m 7 G (5 ') ppp (5') G) </li><li> 5,0 ul 10X transcriptie buffer </li><li> 5,0 pi T7 of SP6 polymerase mix </li></ul></li><li> 50,0 uL Totaal </li></ul></li><li> Incubeer de transcriptie reactie gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na de incubatie moet de reactie onmiddellijk worden gebruikt voor elektroporatie van de BHK-21 cellen. Voorbereiding van de BHK-21 cellen voor elektroporatie moet beginnen tijdens de incubatie transcriptie reactie. </li></ol> 2. Generatie van Virus van Infectieuze RNA <ol><li> Trypsinize twee 70-80% samenvloeiende 150 cm 2 (T-150) flesje BHK-21 cellen per ATS. </li><li> Breng alle cellen om een ​​15 ml conische centrifugebuis. </li><li> Pellet de cellen door centrifugeren bij 2000 rpm, 10 min, 4 ° C in een conventionele tafelblad centrifuge. </li><li> Resuspendeer cellen in steriele PBS zonder Mg + + en Ca + +. Herhaal de stappen 2.3 en 2.4 tot de cellen zijn drie keer gewassen met PBS. </li><li> Resuspendeer de gepelleteerde cellen 0,5 ml MEM met 10% FBS. </li><li> Verdun 10 pi cellen met een 90 microliter MEM met 10% FBS en rekenen op een hemacytometer. Indien nodig, verdunnen cellen 2.5-12.5 x 10 7 cellen / ml met MEM dat 10% FBS. </li><li> Om een ​​ijskoude 0,2 cm elektroporatie cuvette, voeg 400 pi celsuspensie en 20 pi transcriptie reactie. Veeg condens van de cuvette. </li><li> Pulse de cuvet twee keer: 450V, 1200Ω, 150 uF. We maken gebruik van een Electro Cell Manipulator, Harvard Apparatuur Model ECM630. </li><li> Plaats de gehele inhoud van de cuvet in een 25 cm 2 weefselkweek kolf met 5 ml MEM met 10% FBS. </li><li> Incubeer kolf (s) bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Dagelijks toezicht op de infectie met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop met een geschikte filter set (bijvoorbeeld GFP filter: excitatie golflengte = 460-490 nm, emissie golflengte = 510-550 nm, of DsRed filter: excitatie golflengte = 460-560 nm, emissie golflengte =&gt; 590 nm). </li><li> Bij de fluorescentie suggereert infectie is samenvloeiend en / of CPE is zichtbaar in de fles, het verzamelen van de inhoud van de kolf, voeg 30% FBS, hoeveelheid zo nodig en bewaar bij -80 ° C. Indien gewenst, kan cellysaten worden gewist door centrifugatie (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) voorafgaand aan de toevoeging van FBS. </li><li> Passage virus ten minste een keer door middel van een nieuwe fles van cellen om het virus titer verhoging voor de volgende bloed voeden assays. </li></ol> 3. Per os Infectie van Muggen <ol><li> Meng het bloed (meestal gekocht de-fibrinated schapen bloed) en cel-cultuur afgeleid virus schorsing vanaf stap 2.13. Laatste virus titer in het bloed maaltijd meestal moet worden ~ 1x10 7 plaque-vormende eenheden (pfu) / ml voor een efficiënte middendarm infectie van de mug. Het stimuleren van muggen te snel te vullen, adenosine 5'-trifosfaat (ATP) kan worden toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 0,02 miljoen. </li><li> Muggen kunnenmoeten worden beroofd van water en suiker vóór infectie om hen te stimuleren om efficiënt bloed voeden van een kunstmatige feeder. Duur van de armoede moet vooraf worden vastgesteld om de sterfte te minimaliseren. Keer zal afhangen van muggensoorten, vochtigheid van de insectary enz. Als uitgangspunt, verwijder suiker 24u en 12u water voorafgaand aan het voer. Dit protocol maakt gebruik van watermantel glas feeders17 met circulerende 37 ° C water. Een varkens intestinale membraan (dat wil zeggen grondig gewassen worst behuizing verkrijgbaar bij de meeste supermarkten) is geplaatst over de monding van de feeder en de maaltijd wordt gepipetteerd in de kamer. Diverse uitvoeringen, membranen en protocollen zijn beschikbaar voor verschillende vector types. </li><li> Muggen worden gesorteerd om alleen die muggen volgezogen met bloed te selecteren. Gezwollen muggen worden overgebracht naar een doos met organdie op de bovenkant en de muggen worden geïncubeerd bij 28 ° C, 75-80% relatieve vochtigheid Tot de verwerking voor GFP expressie. </li></ol> 4. Intrathoracale Enten van Muggen Intrathoracale enting is een alternatieve methode voor het infecteren van de geleedpotige. Deze methode wordt gebruikt wanneer de verspreiding via de middendarm is niet vereist. (Methode hieronder beschreven, maar de techniek wordt niet weergegeven in dit visuele experiment). <ol><li> Een klein aantal van de muggen (5-10) wordt opgezogen uit het bedrijf kooien in plastic holding buizen. De verzegelde holding buisjes geplaatst worden bij 4 ° C gedurende 15 min om de muggen chill. </li><li> 2 5 muggen wordt gemorst uit de tube op een glazen petrischaal rust op het ijs. Plaats het deksel op de petrischaal wanneer het niet gebruikt of als er muggen beginnen te bewegen. Tijdens de behandeling van de muggen, moeten maatregelen genomen worden om te tellen en bij te houden van het aantal muggen gemanipuleerd. Omdat muggen worden gemorst op de tafel chill, zal het totale aantal opgenomen worden op een lab teller. </li><li> De naald wordt bereid door het smelten van capillaire buis met behulp van Nanoject specifieke glas en een naald trekker. </li><li> Het instellen van de Nanoject II microinjector per instructies van de fabrikant voor de levering van 69 nL inoculum. Zorg moet worden betracht bij het tekenen van de inoculum in de naald, zodat de naald niet beschadigd is. </li><li> Met behulp van een dissectiemicroscoop, steek de naald in de borstkas van de mug en activeer de Nanoject voor de inenting. Zorg moet worden betracht bij het inenten van muggen, zodat de naald niet volledig doordringen in de mug en verlaat de andere kant, resulterend in de daaropvolgende dood van de mug. Controleer elke mug om er zeker van dat de entstof ingevoerd voordat u deze uit de naald. </li><li> Na inoculatie, terwijl de mug nog gespietst op de naald, plaats het in een papieren doos houden door een klein gaatje in de zijkant die is aangesloten met katoen of een kurk stop op alle andere tijden. </li><li> Als de muggen hebben geïnoculeerd en geplaatst in de doos (tot ongeveer 50 per doos), zorgvuldig tape de kurk op zijn plaats per ongeluk vrijkomen van de muggen te voorkomen. Plaats de dozen in een veilige holding bak voor verdere incubatie in de insectary bij 28 ° C en 80% relatieve vochtigheid. </li></ol> 5. Monitoring Infectie van Muggen <ol><li> Plaats het papier holding doos bij 4 ° C gedurende ongeveer 15 minuten om muggen te immobiliseren. </li><li> Overdracht van een klein aantal muggen (5-10 per keer) om een ​​chill tabel aangepast voor gebruik op een fluorescentiemicroscoop. </li><li> Onderzoeken en sorteren muggen op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van fluorescentie. Daarnaast kan fluorescentie-intensiteit worden gebruikt als een proxy kwantitatieve meting van de infectie. Mug weefsels zoals midguts, speekselklieren, kan dik lichaam worden ontleed en gecontroleerd voor fluorescentie. </li><li> Indien nodig, terug geselecteerde muggen om papier te bewaren ter incubatie van geïnfecteerde muggen voort te zetten. </li></ol> 6. Transmission Assay (gedwongen speekselen tot overdracht van het virus te tonen) <ol><li> Ontnemen muggen van suiker bron voor de 24 uur voorafgaand aan de feed. </li><li> Verwijder de poten en vleugels </li><li> Om een ​​50 ul capillair dat is verwarmd, getrokken en geknipt aan de ene kant, voeg 3-5 ul Cargille Type B immersie olie of 10% serum-sucrose-oplossing. </li><li> Steek de snuit in de buis. Bij gebruik van olie, zal druppeltjes speeksel worden gezien als stralen uit de proboscis. Een pi van een 1%-oplossing pilocarbine in PBS en 0,1% Tween 80 kan worden toegepast op de thorax te stimuleren. </li><li> Na 60-90 minuten, verwijder muggen en op te slaan voor virusisolatie indien nodig. </li><li> Verwijder oplossing uit de tube door centrifugeren in een buisje met 100 ul 20% FBS-PBS. </li><li> Steriel filter het inoculum door een 0,2 um spuitfilter en gebruik dan de gefilterde de inoculum om gekweekte cellen te infecteren. </li></ol> BIOVEILIGHEID LET OP: Dit protocol beschrijfteen methode voor het genereren, het identificeren en monitoren besmette muggen. Op basis van uw faciliteiten (dat wil zeggen een chill tafel, containment facility, enz.) en IBC goedkeuring, kunt u worden beperkt tot het onderzoek van hen alleen na het verwijderen van vleugels en poten om ontsnapping te voorkomen. SINV op basis van ATS's kunnen worden gegenereerd en gebruikt worden in een BSL2 omgeving. Het gebruik van de ATS is gebaseerd op andere alphaviruses, zoals Chikungunya-virus of western paarden encephalitis virus vereist BSL3 faciliteiten. 7. Representatieve resultaten Een overzicht van de expressie van een marker-gen (GFP) met behulp van de ATS 5'dsMRE16 / GFP is weergegeven in figuur 1. Expressie van GFP in BHK-21 en C6/36 (Aedes albopictus) cellen is weergegeven in figuur 2 op bepaalde tijden na de infectie van cellen met 5'dsMRE16 / GFP virus op 0,01 multipliciteit van infectie. Figuur 3 is een overzicht van de Alphavirus en ATS virus infectie in de mug wanneer het virus wordt geleverd door middel van een infectieuze bloedmaaltijd. Figuur 4 toont de voorbereiding van een bloedmaaltijd met ~ 10 7 pfu / ml ATS virus gevolgd door een orale infectie van Aedes aegypti. Hele lichaam te bekijken van de geïnfecteerde mug en geselecteerde delen van het lichaam op 10 dagen na de infectie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop (figuur 5). Detectie van GFP en DsRed in midguts van geïnfecteerde muggen na infectie met ATS 5'dsMRE16 virussen uiten van elk fluorescente marker-gen (Figuur 6). Transmissie-test met behulp van muggen die besmet zijn met 5'dsMRE16 / GFP ATS virus (figuur 7). Tabel 1. ATS is op dit moment ontwikkeld voor genexpressie in muggen. <table border="1"><tbody><tr><td>  Alphavirus </td><td> ATS </td><td> Mug </td><td> Referentie </td></tr><tr><td> Sindbis Virus </td><td> TE / 3'2J en TE / 5'2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3'dsMRE16 en 5'dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5'dsTR339 </td><td> A. aeg ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chikungunya-virus </td><td> 3'dsCHIKV en 5'dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A. albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O'nyong Nyong virus </td><td> 5'dsONNV </td><td> Anopheles gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> West-equine encephalitis virus </td><td> 5'dsWEEV. McMillan </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft et al.., Ongepubliceerde </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Voordelen / nadelen van het gebruik van ATS voor genexpressie in muggen. <table border="1"><tbody><tr><td> Voordelen: </td></tr><tr><td> Snelle productie van high-titer virus </td></tr><tr><td> Breed gastheerbereik (SINV) </td></tr><tr><td> Hoog RNA replicatie-tarief </td></tr><tr><td> Hoge transgen expressie niveaus </td></tr><tr><td> Relatieve gemak van het manipuleren van genen </td></tr><tr><td> Stabiel, aanhoudende genexpressie bij insecten </td></tr><tr><td> Minimale pathologie bij insecten </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Nadelen: </td></tr><tr><td> Op korte termijn expressie mode in gewervelde cellen </td></tr><tr><td> Sterke cytopathische effecten op gewervelde cellen </td></tr><tr><td> Gene grootte beperkingen (&lt;1kb, ideaal) </td></tr><tr><td> Sommige alphaviruses vereisen BSL3 insluiting </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Overzicht van ATS virus productie in BHK-21 cellen met behulp van p5'dsMRE / GFP SINV uiten van GFP. Naar aanleiding van in vitro transcriptie, is genomische ATS RNA geëlektroporeerd in BHK-21 cellen waar het virus is gered. De ATS virus kan dan gebruikt worden om muggen te infecteren. SGP = subgenome promotor. Drie ATS RNA soorten zijn getranscribeerd in de cells, de genomische, subgenome 1 en 2 subgenome RNAs. C (capside), zijn E2 en E1 glycoproteïnen geassembleerd met ATS genoom aan besmettelijke virus te genereren. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: Expressie van GFP in mug (C6/36) cellen na infectie met SINV 5'dsMRE16 / GFP virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Overzicht van een ATS-virusinfectie in muggen leidt tot virusoverdracht. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infectie door het blootstellen van muggen aan een infectieuze bloedmaaltijd. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infectie op 10 dagen na infectie. Hele lichaam detectie van GFP toont aan dat virus is ontsnapt aan de middendarm en verspreid naar secundair weefsels. Figuur laat ook zien GFP expressie in bepaalde lichaamsdelen die ook duidt op een gedissemineerde infectie. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP en 5'dsMRE16 / DsRed infectie van midguts op bepaalde tijdstippen na infectie. Midguts hebben meestal verschillende brandpunten van besmetting vroeg na het innemen van een bloed-maaltijd met virus dat zich verspreidt door de achterste middendarm op latere tijdstippen post-infectie. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7: Detectie van ATS 5'dsMRE16 / GFP in de mug speeksel zo vroeg acht dagen na infectie. Test is ontworpen om de overdracht van de ATS virus en laat zien dat de 5'dsMRE16 / GFP virus stabiel kan GFP gedurende de extrinsieke incubatietijd in de mug te drukken show. Het linker paneel toont een mug kwijlen in een capillaire buis, het centrum paneel toont C6/36 cellen die geïnfecteerd zijn met speeksel op 1 dag en rechter paneel 3 dagen na infectie.

<ol><li>Brault, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+patterns+of+o%27nyong+nyong+virus+in+the+malaria-transmitting+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).</li>
<li>Campbell, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+uses+RNA+interference+in+defense+against+Sindbis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection.</a> BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).</li>
<li>Cirimotich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+interference+increases+alphavirus+replication+and+virus-associated+mortality+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes.</a> BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).</li>
<li>Capurro, deL. ara, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-expressed%2C+recombinant+single-chain+antibody+blocks+sporozoite+infection+of+salivary+glands+in+Plasmodium+gallinaceum-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).</li>
<li>Foy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+Sindbis+virus+transducing+system+and+its+characterization+in+three+Culicine+mosquitoes+and+two+lepidopteran+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species.</a> Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).</li>
<li>Foy, B. D., Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus+transducing+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alphavirus transducing systems.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).</li>
<li>Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).</li>
<li>Hahn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Sindbis+virus+transient+expression+vectors+for+studying+antigen+processing+and+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).</li>
<li>Keene, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+acts+as+a+natural+antiviral+response+to+O%27nyong-nyong+virus+%28Alphavirus%3B+Togaviridae%29+infection+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mammalian+membrane+proteins+in+mammalian+cells+using+Semliki+Forest+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors.</a> Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).</li>
<li>Myles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus-derived+small+RNAs+modulate+pathogenesis+in+disease+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+resistance+to+dengue-2+virus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes.</a> Science. 272, 884-884 (1996).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+chloramphenicol+acetyltransferase+in+Aedes+albopictus+%28C6%2F36%29+cells+and+Aedes+triseriatus+mosquitoes+using+a+double+subgenomic+recombinant+Sindbis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Sindbis+virus+expression+system+that+efficiently+expresses+green+fluorescent+protein+in+midguts+of+Aedes+aegypti+following+per+os+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection.</a> Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).</li>
<li>Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+haemocyte+tropism+for+an+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A haemocyte tropism for an arbovirus.</a> J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).</li>
<li>Pierro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+orally+infectious+Sindbis+virus+transducing+system+that+efficiently+disseminates+and+expresses+green+fluorescent+protein+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).</li>
<li>Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+feeding+response+of+mosquitoes+to+nutritive+solutions+in+a+new+membrane+feeder%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq.+News%22%5BJournal%5D)">Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder.</a> Mosq. News. 24, 407-407 (1964).</li>
<li>Sanders, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li>
<li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li>
<li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li>
</ol>

De methoden hier gepresenteerde onderzoekers in staat om de infectie van een mug Alphavirus in celkweek en de volwassen vrouwelijke mug te volgen. De voor-en nadelen van het gebruik van ATS virussen zijn samengevat in tabel 2. Een ATS besmettelijke kloon genetisch kunnen worden gemanipuleerd om een ​​Indiase overheid te uiten en zijn gebruikt om een ​​enkele keten antilichamen, onderdrukkers van RNAi, antisense RNA&#39;s gericht op endogene genen, en pro-apoptotische eiwitten te drukken. Als een verslaggever niet wordt gebruikt, dan is de beeldvorming deel van deze methode is niet relevant. Echter, veel van dezelfde protocollen nodig zijn voor ATS virus te redden, vermeerdering, en de mug infectie. Er zijn beperkingen in de maximale grootte van het transgen wanneer ze in een Alphavirus transducerende systeem. De grootte beperkingen variëren afhankelijk van de ouderlijke stam gebruikt om het ATS te genereren, maar zijn meestal ongeveer 1kb hoewel grotere reporter genen zoals vuurvlieg luciferase zijn gebruikt in de bouw van ATS voor gebruik in de muggen. Onderzoekslaboratoria met een bescheiden bedrag van virologie achtergrond moet in staat zijn om het gebruik ATS het volgen van deze protocollen. Een aantal onderzoekslaboratoria dat al hebben gedaan met behulp van SINV op basis van ATS&#39;s.

<table><tbody><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript Kit</td><td>Ambion</td><td>AB1312</td><td>Zorg ervoor dat u een kit gebruikt die de juiste polymerase voor uw construct bevat.</td></tr><tr><td>Cap-analoog (m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G)</td><td>Ambion</td><td>AM8050</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II nanoliter-injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Electro Cell Manipulator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 630</td><td></td></tr></tbody></table>

alphavirus transducing system: tools voor het visualiseren van besmetting in mosquito vector

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transductie systemen (ATSS) zijn een belangrijk instrument voor het uitdrukken van genen van belang (GOI) tijdens de infectie. ATSS zijn afgeleid van cDNA-klonen van door muggen overgedragen RNA-virussen (genus Alphavirus; familie Togaviridae). De Alphavirus geslacht bevat ongeveer 30 verschillende muggen overgebrachte virus soorten. Alphaviruses zijn omhulde virussen en bevatten enkelstrengs RNA genoom (~ 11,7 Kb). Alphaviruses transcriberen een subgenome mRNA dat de structurele eiwitten van het virus die nodig is voor inkapseling van het genoom en rijping van het virus codeert. Alphaviruses zijn meestal zeer lytische in vertebrate cellen, maar aanhoudend gevoelig mug cellen te infecteren met een minimale cytopathologie. Deze attributen maken ze uitstekende instrumenten voor de genexpressie in muggen. De meest voorkomende ATSS in gebruik zijn afgeleid van Sindbis virus (SINV). De brede soort tropisme van SINV zorgt voor infectie van insecten, vogels, zoogdieren en cells8. Echter, ATSS zijn afgeleid van andere alphaviruses ook 9,10,20. Buitenlandse genexpressie wordt mogelijk gemaakt door het aanbrengen van een extra viraal RNA subgenome initiatie site of promotor. ATSS waarbij een exogene gensequentie is 5 &#39;gepositioneerd om de virale structurele genen wordt gebruikt voor een stabiele eiwitexpressie bij insecten. ATSS, waarin een gen-sequentie is 3 &#39;gepositioneerd om de structurele genen, wordt gebruikt om RNAi en stilte expressie van dat gen in het insect te activeren. ATSS hebben bewezen waardevolle hulpmiddelen voor het begrijpen van vector-pathogeen interacties, moleculaire details van virale replicatie en het onderhoud besmettelijke cycli 3,4,11,19,21. In het bijzonder, is de uitdrukking van TL-en bioluminescente verslaggevers geweest voor het bijhouden van de virale infectie in de vector en virusoverdracht 5,14-16,18. Daarnaast heeft de vector immuunrespons is beschreven met behulp van twee stammen van SINV ontwikkeld om GFP 2,9 uit te drukken. Hier presenteren we een methode voor de productie van SINV met een fluorescerende reporter (GFP) uit de cDNA besmettelijke kloon. Infectieuze, full-length RNA wordt getranscribeerd van de gelineariseerde cDNA-kloon. Infectieuze RNA wordt ingebracht in permissieve doelcellen door elektroporatie. Getransfecteerde cellen genereren besmettelijke virusdeeltjes de uiting van de Indiase overheid. Geoogst virus wordt gebruikt om muggen, zoals hier beschreven, of andere host soorten (niet hierin afgebeeld) besmetten. Vector competentie wordt beoordeeld door het detecteren van fluorescentie buiten de middendarm of door het bewaken van virusoverdracht 7. Het gebruik van een fluorescerende reporter als de Indiase overheid zorgt voor gemakkelijke schatting van het virus verspreid over een celcultuur, voor de bepaling van de mate van besmetting, verspreiding in blootgesteld muggen, virusoverdracht van de mug en biedt een snelle graadmeter van vector competentie.

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Alphavirus-transductiesystemen (ATS's) zijn belangrijke instrumenten voor de expressie van genen van belang (GOI) tijdens een infectie. ATS's zijn afgeleid van cDNA-klonen van ...

Alfavirussen zijn door muggen overgebrachte RNA-virussen die vatbare muggencellen persistent infecteren met minimale cytopathologie. Dit protocol toont het nut aan van infectieuze alfavirus-transductiesystemen die fluorescerende reporters tot expressie brengen voor de detectie van vectorinfectie en virustransmissie. Voer vrouwelijke muggen eerst een bloedmaaltijd met het betreffende alfavirus, bepaal vervolgens de infectie-efficiëntie van de muggen en selecteer alleen de muggen die het markergen tot expressie brengen.Oogst vervolgens speeksel van de geïnfecteerde muggen en toon de overdraagbaarheid aan door gekweekte muggencellen te infecteren met het verzamelde speeksel. De resultaten worden verkregen via epifluorescentiemicroscopie. Visualiseer een reportereiwit zoals GFP om zo de infectie van de vector en de virustransmissie door Aedes- of Culex-soorten muggen te volgen.Alfavirus-expressiesystemen of ATS'en kunnen worden gebruikt om genexpressie en vectormuggen snel te beoordelen, zowel voor arbovirusstudies als voorafgaand aan complexere manipulaties van muggen, zoals muggentransgenese. Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door Dr. Irma Sanchez Vargas, Dr. Eric Mossel en Aaron Phillips uit het laboratorium van Dr. Ken Olson. Om een TS-virus in Bhk 21-cellen te produceren, wordt een symbis recombinant virus gebruikt dat GFP-reporter tot expressie brengt na in vitro transcriptie, waarna het genomische alfavirus-transducerende systeem-RNA via electroporatie in bhk 21-cellen wordt gebracht.Red vervolgens het virus en vermeerder dit vóór de infectie. Bereid de muggen voor op een efficiënte bloedmaaltijd vanuit een kunstmatige voedingsbron door middel van voedselonthouding. Verwijder de suiker 24 uur en het water 12 uur vóór de voeding.Meng commercieel verkregen gedefibrilleerd of gecitrateerd dierlijk bloed met de voorbereide kweek van TS-virus voor een efficiënte infectie van de middendarm van de muggen. Formuleer een virusconcentratie van 10⁷ plaque-vormende eenheden per milliliter voor de bloedmaaltijd om de muggen te stimuleren tot het opzuigen. Voeg TP toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,02 M.Plaats een pore sign darmmembraan over de opening van de glazen toevoerbuis met watermantel. Stel vervolgens de toevoerbuizen in met circulerend water van 37 °C. Pipetteer daarna het voedsel in de kamer en plaats de toevoerbuizen stevig op het karton.Sorteer de koud geneesmiddel-geanestheseerde muggen na een voedingsperiode van 10 tot 30 minuten om de bloedverzadigde exemplaren te selecteren, zodat replicatie en verspreiding van een TS-virus in de geselecteerde muggen kan plaatsvinden. Incubeer ze gedurende acht tot 10 dagen bij 28 °C en 75% relatieve vochtigheid. Om de muggen te immobiliseren.Plaats het karton waarin de papieren houder zich bevindt gedurende ongeveer 15 minuten bij vier graden Celsius. Draag vervolgens vijf tot 10 muggen over naar een koeltablet die is aangepast voor gebruik op een fluorescentiemicroscoop. Onderzoek en sorteer de muggen op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van fluorescentie.Plaats de geselecteerde muggen terug in de papieren doos voor verder gebruik naar behoefte. Bepaal op dit punt de infectie-efficiëntie met fluorescentie-intensiteit als proxy. Dissecteer tot slot weefsels zoals de middendarmen, SIV-klieren en vetlichamen, en controleer op fluorescentie.Deze organen en weefsels kunnen naar wens op een eerder tijdstip worden gedissecteerd. Ontneem de muggen gedurende 24 uur vóór de voeding de suikerbron. Bereid een capillaire buis van 50 µL, die is verhit, uitgetrokken en afgeknipt, met drie tot vijf µL Cargill.Voeg immersie-olie type B toe om te voorkomen dat de muggen ontsnappen. Verwijder hun poten en vleugels. Voer nu de proboscis in de buis in.Houd de speekseldruppels die uit de proboscis in de immersie-olie sijpelen nauwlettend in de gaten. Indien nodig, breng een druppel 1% pilocarpine aan op het thorax van de mug om de speekselvloed te verhogen. Verwijder de muggen na 60 tot 90 minuten en bewaar deze voor toekomstige virusisolatie. Om de oplossing uit de capillaire buis te oogsten, wordt het mengsel van speeksel en olie uitgestoten in een buisje met 500 µL steriele 20% FBS-PBS.Filter het inoculum door een spuitfilter van 0,2 micron en gebruik dit inoculum vervolgens om gekweekte mugcellen te infecteren. De efficiëntie van de infectie met het five prime DS MRE 16 GFP-virus wordt geëvalueerd aan de hand van de GFP-expressie. In de loop van de tijd werden deze cellen geïnfecteerd met het virus bij een multipliciteit van infectie van 0,01.Een epifluorescentiemicroscoop maakt het mogelijk om GFP in de gehele geïnfecteerde mug, evenals in de verschillende lichaamsdelen, te visualiseren, hier 10 dagen na infectie. Orgaanspecifieke expressie van GFP is indicatief voor een gedissemineerde infectie. Middendarmen vertonen gewoonlijk duidelijke infectiehaarden kort na het consumeren van een bloedmaaltijd die het virus bevat, welke zich op latere tijdstippen na infectie door de gehele posterieure middendarm verspreiden.Deze gebeurtenissen worden gesignaleerd door de GFP- en DS RED-reporters. De transmissie-assay geeft aan dat het five prime DS MRE 16 GFP-virus gedurende de gehele extrinsieke incubatieperiode stabiel GFP tot expressie brengt. Bij de hier gebruikte mug wordt GFP in het muggenspeeksel al gedetecteerd vanaf acht dagen na infectie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een A TS-virus oraal kan worden overgedragen aan een mug, hoe virusinfectie in een mug visueel kan worden beoordeeld en hoe de overdracht van het virus vanuit de mug kan worden geëvalueerd.

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Dit handschrift maakt gebruik van de Fiji-gebaseerde open-source softwarepakket VirusMapper single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie microscopie afbeeldingen om nauwkeurige modellen van de nanoschaal structuur te genereren.

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Wij rapporteren met behulp van een kunstmatige intronic kleine RNA expressie strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Een gedetailleerde procedure voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de rAaeDV vectoren evenals wat larvale infectie wordt beschreven.

Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Talrijke nieuwe virusachtige sequenties zijn gevonden in muggen als gevolg van het uitgebreide gebruik van sequencing-technologieën. We bieden een effectieve procedure voor het isoleren en versterken van virussen met behulp van gewervelde en muggencellijnen, die als basis kunnen dienen voor toekomstige studies naar muggengerelateerde virussen, waaronder door muggen overgedragen en muggenspecifieke virussen.

Muggen-geassocieerde virusisolatie van in het veld verzamelde muggen

Het huidige protocol beschrijft hoe gemeenschappelijke levensparametergegevens bij Aedes aegypti-muggen kunnen worden gemeten, waaronder vruchtbaarheid, vleugelgrootte, vruchtbaarheid, geslachtsverhouding, levensvatbaarheid, ontwikkelingstijden, mannelijke bijdrage en levensduur van volwassenen. Deze metingen kunnen worden gebruikt om de fitheid van transgene muggen te beoordelen.

Kwantificering van fitnesskosten bij transgene Aedes aegypti-muggen

Leer hoe je alphavirus-transducerende systemen gebruikt om fluorescente markers in muggen te visualiseren. Deze methode volgt vectorinfectie en virustransmissie via GFP-expressie in Aedes- en Culex-soorten.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Meer video's verkennen