Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Alfavirussen zijn door muggen overgebrachte RNA-virussen die vatbare muggencellen persistent infecteren met minimale cytopathologie. Dit protocol toont het nut aan van infectieuze alfavirus-transductiesystemen die fluorescerende reporters tot expressie brengen voor de detectie van vectorinfectie en virustransmissie. Voer vrouwelijke muggen eerst een bloedmaaltijd met het betreffende alfavirus, bepaal vervolgens de infectie-efficiëntie van de muggen en selecteer alleen de muggen die het markergen tot expressie brengen.

Oogst vervolgens speeksel van de geïnfecteerde muggen en toon de overdraagbaarheid aan door gekweekte muggencellen te infecteren met het verzamelde speeksel. De resultaten worden verkregen via epifluorescentiemicroscopie. Visualiseer een reportereiwit zoals GFP om zo de infectie van de vector en de virustransmissie door Aedes- of Culex-soorten muggen te volgen.

Alfavirus-expressiesystemen of ATS'en kunnen worden gebruikt om genexpressie en vectormuggen snel te beoordelen, zowel voor arbovirusstudies als voorafgaand aan complexere manipulaties van muggen, zoals muggentransgenese. Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door Dr. Irma Sanchez Vargas, Dr. Eric Mossel en Aaron Phillips uit het laboratorium van Dr. Ken Olson. Om een TS-virus in Bhk 21-cellen te produceren, wordt een symbis recombinant virus gebruikt dat GFP-reporter tot expressie brengt na in vitro transcriptie, waarna het genomische alfavirus-transducerende systeem-RNA via electroporatie in bhk 21-cellen wordt gebracht.

Red vervolgens het virus en vermeerder dit vóór de infectie. Bereid de muggen voor op een efficiënte bloedmaaltijd vanuit een kunstmatige voedingsbron door middel van voedselonthouding. Verwijder de suiker 24 uur en het water 12 uur vóór de voeding.

Meng commercieel verkregen gedefibrilleerd of gecitrateerd dierlijk bloed met de voorbereide kweek van TS-virus voor een efficiënte infectie van de middendarm van de muggen. Formuleer een virusconcentratie van 10⁷ plaque-vormende eenheden per milliliter voor de bloedmaaltijd om de muggen te stimuleren tot het opzuigen. Voeg TP toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,02 M.

Plaats een pore sign darmmembraan over de opening van de glazen toevoerbuis met watermantel. Stel vervolgens de toevoerbuizen in met circulerend water van 37 °C. Pipetteer daarna het voedsel in de kamer en plaats de toevoerbuizen stevig op het karton.

Sorteer de koud geneesmiddel-geanestheseerde muggen na een voedingsperiode van 10 tot 30 minuten om de bloedverzadigde exemplaren te selecteren, zodat replicatie en verspreiding van een TS-virus in de geselecteerde muggen kan plaatsvinden. Incubeer ze gedurende acht tot 10 dagen bij 28 °C en 75% relatieve vochtigheid. Om de muggen te immobiliseren.

Plaats het karton waarin de papieren houder zich bevindt gedurende ongeveer 15 minuten bij vier graden Celsius. Draag vervolgens vijf tot 10 muggen over naar een koeltablet die is aangepast voor gebruik op een fluorescentiemicroscoop. Onderzoek en sorteer de muggen op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van fluorescentie.

Plaats de geselecteerde muggen terug in de papieren doos voor verder gebruik naar behoefte. Bepaal op dit punt de infectie-efficiëntie met fluorescentie-intensiteit als proxy. Dissecteer tot slot weefsels zoals de middendarmen, SIV-klieren en vetlichamen, en controleer op fluorescentie.

Deze organen en weefsels kunnen naar wens op een eerder tijdstip worden gedissecteerd. Ontneem de muggen gedurende 24 uur vóór de voeding de suikerbron. Bereid een capillaire buis van 50 µL, die is verhit, uitgetrokken en afgeknipt, met drie tot vijf µL Cargill.

Voeg immersie-olie type B toe om te voorkomen dat de muggen ontsnappen. Verwijder hun poten en vleugels. Voer nu de proboscis in de buis in.

Houd de speekseldruppels die uit de proboscis in de immersie-olie sijpelen nauwlettend in de gaten. Indien nodig, breng een druppel 1% pilocarpine aan op het thorax van de mug om de speekselvloed te verhogen. Verwijder de muggen na 60 tot 90 minuten en bewaar deze voor toekomstige virusisolatie. Om de oplossing uit de capillaire buis te oogsten, wordt het mengsel van speeksel en olie uitgestoten in een buisje met 500 µL steriele 20% FBS-PBS.

Filter het inoculum door een spuitfilter van 0,2 micron en gebruik dit inoculum vervolgens om gekweekte mugcellen te infecteren. De efficiëntie van de infectie met het five prime DS MRE 16 GFP-virus wordt geëvalueerd aan de hand van de GFP-expressie. In de loop van de tijd werden deze cellen geïnfecteerd met het virus bij een multipliciteit van infectie van 0,01.

Een epifluorescentiemicroscoop maakt het mogelijk om GFP in de gehele geïnfecteerde mug, evenals in de verschillende lichaamsdelen, te visualiseren, hier 10 dagen na infectie. Orgaanspecifieke expressie van GFP is indicatief voor een gedissemineerde infectie. Middendarmen vertonen gewoonlijk duidelijke infectiehaarden kort na het consumeren van een bloedmaaltijd die het virus bevat, welke zich op latere tijdstippen na infectie door de gehele posterieure middendarm verspreiden.

Deze gebeurtenissen worden gesignaleerd door de GFP- en DS RED-reporters. De transmissie-assay geeft aan dat het five prime DS MRE 16 GFP-virus gedurende de gehele extrinsieke incubatieperiode stabiel GFP tot expressie brengt. Bij de hier gebruikte mug wordt GFP in het muggenspeeksel al gedetecteerd vanaf acht dagen na infectie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een A TS-virus oraal kan worden overgedragen aan een mug, hoe virusinfectie in een mug visueel kan worden beoordeeld en hoe de overdracht van het virus vanuit de mug kan worden geëvalueerd.