Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Alpha-virussen zijn door muggen overgedragen RNA-virussen die aanhoudend gevoelige muggencellen infecteren met minimale cytopathologie. Dit protocol toont de bruikbaarheid van besmettelijke alfa-virus-transducerende systemen die fluorescente reporters tot expressie brengen voor detectie van vectorinfectie en virusoverdracht. Eet eerst vrouwelijke muggen een bloedmaaltijd die het betreffende alfa-virus bevat, bepaal vervolgens de infectie-efficiëntie van muggen en selecteer alleen muggen die het markergen tot expressie brengen.

Verzamel vervolgens speeksel van de geïnfecteerde muggen en toon overdraagbaarheid aan door gekweekte mugcellen te infecteren met het verzamelde speeksel. Resultaten verkregen door epi-fluorescentiemicroscopie. Beeld een rapport af van een eiwit zoals GFP en volg zo de vectorinfectie en virusoverdracht door de jaren tachtig of QE-soorten muggen.

Alpha-virusexpressiesystemen of ATS's kunnen worden gebruikt om snel genexpressie en vectormuggen te beoordelen voor zowel arbovirusstudies als voordat moeilijkere mugmanipulaties worden uitgevoerd, zoals mug-transgenese. Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door Dr. Irma Sanchez Vargas, Dr. Eric Mossel en Aaron Phillips van het laboratorium van Dr. Ken Olson. Om een TS-virus in Bhk 21-cellen te produceren, gebruik een symbis recombinant virus dat de GFP-reporter tot expressie brengt na in vitro transcriptie, elektro-rateer het genomische alfa-virus-transducerende systeem RNA in bhk 21-cellen.

Vervolgens red en versterk het virus voor de infectie. Bereid muggen voor op efficiënt bloedvoeren vanuit een kunstmatige voeder door voedseldeprivatie. Verwijder suiker 24 uur en water 12 uur voorafgaand aan het voeren.

Meng commercieel verkregen defibrilleerde of geciteerde dierlijke bloed met de bereide celcultuurafgeleide TS-virussuspensie voor efficiënte middendarmsinfectie van de muggen. Formuleer 10 tot zeven plaquevormende eenheden per milliliter virustiter voor de bloedmaaltijd om de muggen te stimuleren tot voedselopname. Voeg een TP toe tot een uiteindelijke concentratie van 0,02 molair.

Plaats een poreuze darmwand boven de mond van de met een watermantel bedekte glazen voeder. Stel vervolgens de voeders op met circillerend 37 graden Celsius water. Pipet vervolgens de maaltijd in de kamer en plaats de voeders stevig op de kartonnen doos.

Nadat de muggen 10 tot 30 minuten zijn gevoerd, sorteren koude anesthesie muggen voor de bloed gevulde exemplaren om replicatie en verspreiding van een TS-virus in de geselecteerde muggen mogelijk te maken. Incubeer ze bij 28 graden Celsius en 75% relatieve luchtvochtigheid gedurende acht tot 10 dagen. Om de muggen te immobiliseren.

Plaats de kartonnen doos met papier op vier graden Celsius gedurende ongeveer 15 minuten. Breng nu vijf tot tien muggen over naar een koeltafel die is aangepast voor gebruik op een fluorescentiemicroscoop. Onderzoek en sorteer de muggen op basis van aanwezigheid of afwezigheid van fluorescentie.

Breng geselecteerde muggen terug naar de kartonnen doos voor gebruik zoals gewenst. Bepaal op dit punt de infectie-efficiëntie met behulp van fluorescentie-intensiteit als proxy. Ten slotte, dissecteer weefsels zoals middendarmen, SIV-klieren en de vetlichamen, en controleer op fluorescentie.

Deze organen en weefsels kunnen indien gewenst eerder worden gedisseceerd. Ontdoe muggen 24 uur voorafgaand aan het voeren van de suikerbron. Bereid een capillairbuisje van 50 microliter voor dat is verwarmd, getrokken en gesneden met drie tot vijf microliters van Cargill.

Type B-immersieolie om ervoor te zorgen dat de muggen niet ontsnappen. Verwijder hun poten en vleugels. Steek nu de probos in de buis.

Bewaak zorgvuldig de speekseldruppels die uit de probos in de immersie-olie uitstromen. Plaats indien nodig een druppel van 1% pilocarpine op de thorax van de mug om de speekselproductie na 60 tot 90 minuten te verhogen, verwijder de muggen en bewaar ze voor toekomstige virusisolatie. Om nu oplossing uit de capillairbuis te verzamelen, verdrijft u het speeksel-oliemengsel in een buisje met 500 microliter 20% F-B-S-P-B-S steriele.

Filter het inoculum door een 0,2 micron-seringfilter en gebruik vervolgens dit inoculum om gekweekte cellen in mugcellen te infecteren. De efficiëntie van infectie met vijf prime DS MRE 16 GFP-virus wordt geëvalueerd door expressie van GFP. Na verloop van tijd werden deze cellen geïnfecteerd met virus bij een multipliciteit van infectie van 0,01.

Een epi-fluorescentiemicroscoop geeft een volledig zicht op GFP in de geïnfecteerde mug, evenals in de verschillende lichaamsdelen hier 10 dagen na infectie. Selectieve expressie van GFP in organen is indicatief voor een verspreide infectie. Middendarmen hebben meestal duidelijke foci-infectie vroeg na het innemen van een bloedmaaltijd die zich verspreidt door de achterste middarm in latere tijden na infectie.

Deze gebeurtenissen worden gesignaleerd door de GFP- en DS RED-reporters. De overdrachtstest geeft aan dat vijf prime DS MRE 16 GFP-virus stabiel GFP tot expressie brengt gedurende de gehele extrinsieke incubatieperiode. In de mug hier, wordt GFP en muggenlijm gedetecteerd al vanaf acht dagen na infectie.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een A TS-virus oraal aan een mug kunt infecteren, hoe u visuele beoordeling van virusinfectie in een mug kunt uitvoeren en hoe u de virusoverdracht van de mug kunt beoordelen.