Name: Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Leer genetische kruisingen produceren van de knaagdier malariaparasiet Plasmodium yoelii om recombinante nakomelingen te genereren. Deze methode helpt onderzoekers genetische determinanten van resistentie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Drs Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare en Tovi Lehman voor de kritische lezing van manuscripten. Dit werk werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de afdeling van de intramurale Onderzoek, Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, National Institutes of Health, en door de 973 National Basic Research Program van China, # 2007CB513103. Wij danken NIAID intramurale editor Brenda Rae Marshall voor hulp.

Aseptische technieken moeten worden toegepast op alle materialen die worden toegediend in de dieren om onbedoelde introductie van exogene ziekteverwekkers in muizen die kunnen verwarren experimentele resultaten te vermijden. 1. Infectie van laboratoriummuizen met Blood-traps malariaparasieten <ol><li> Bij kamertemperatuur, dooi twee flacons met daarin de bevroren bloed podium malariaparasieten te worden overschreden. In dit voorbeeld, twee knaagdier malaria parasiet gebruikte stammen zijn Plasmodium yoelii yoelii en Plasmodium yoelii nigeriensis. </li><li> Past een injectiespuit met een 22 tot 30 gauge (G) naald en het opstellen van 400 pi van een steriele, farmaceutische kwaliteit PBS (pH 7,4). </li><li> Met dezelfde injectiespuit, het opstellen van 100 pi van de ontdooide geïnfecteerd bloed; keren de spuit op en neer tot de inhoud is homogeen gemengd. (Optioneel: een pipet kan worden gebruikt om PBS en besmet bloed voor te zetten in een collectie buis op de overdracht met een spuit voor injectie). </li><li> Injecteer 200 pi van de parasiet bevattende oplossing direct in de peritoneum van een muis. Wanneer u klaar bent, gooi de spuit in een scherpe voorwerpen bak. (Zie ook aanvullende materialen voor het onderhoud van laboratorium-muizen). In het algemeen is de standaard grootte van het inoculum is tussen de 100 tot 500 uL, afhankelijk van het niveau van parasitaire infecties in de originele bevroren materialen. </li><li> Injecteer de twee stammen parasiet te worden gekruist in twee muizen per stuk. Muizen zullen microscopisch positief worden 3 tot 5 dagen na de injecties. Wanneer parasitemias bereiken tussen de 1-5%, verder met de volgende stap. </li></ol> 2. Gemengde Clone Infectie van Muizen <ol><li> Voorafgaand aan de gemengde klonen infectie, verzamel staart bloed van de donor twee muizen geïnfecteerd met de parasiet verschillende stammen voor microscopisch onderzoek door Giemsa gekleurde dunne bloeduitstrijkjes (afb. 3), en voor de meting van de rode bloedcellen dichtheid (zie aanvullende materialen voor gedetailleerde procedures) . </li><li> Bereken het volume van een fysiologische zoutoplossing (1,5% w / v trinatriumcitraat dihydraat, 0,85% w / v natriumchloride) en de muis bloed nodig zijn om een ​​inoculum mengsel te produceren, met behulp van de parasitemie en rode bloedcellen dichtheid van metingen eerder verkregen. </li><li> Stel de parasiet oplossing tot een uiteindelijke concentratie van een miljoen geïnfecteerde rode bloedcellen per 100μl. </li><li> Combineer het geïnfecteerde bloed van de twee donoren in een verhouding van 1:1 voor een mixed-kloon inoculum te verkrijgen. Wanneer de twee ouders klonen verschillen in groei, past u de proporties van een sneller groeiende ouders naar een langzamer groeiende ouderlijk kloon op 1:2 of 1:5. </li><li> Injecteer 100 pi van de gemengde monster in het buikvlies van elke muis te worden besmet. (Zie ook stap 3.9 van het aantal muizen te bepalen worden geïnjecteerd) </li><li> Met behulp van deze methode, besmetten twee muizen elk met de single ouderstammen. De single-kloon infecties zal de bepaling van de succesvolle uitzending van de twee ouders stammen. </li></ol> 3. Feeding Muggen <ol><li> Bereid drie kooien met 300 tot 500 volwassen (mannelijke en vrouwelijke) Anopheles muggen stephensi elk, leeftijd 5-7 dagen na de opkomst van de poppen. De containers zijn bedekt met gaas beveiligd door een plastic of metalen deksel. Twee kooien zijn voor het voeden over de ouderlijke klonen, de derde kooi is voor de voorbereiding van een genetische kruis. </li><li> Vanaf vier dagen na de mixed-kloon infectie, voor te bereiden Giemsa-gekleurde dunne staart bloed uitstrijkjes van de geïnfecteerde muizen. </li><li> Onderzoek de uitstrijkjes onder een microscoop door het scannen van ten minste 50 microscopische velden op 1000x vergroting en vast te stellen of mannelijke en vrouwelijke gameten aanwezig zijn. </li><li> Mannelijke en vrouwelijke gametocyten zijn herkenbaar door de aanwezigheid van grote vacuole en grote korrels (figuur 3). Mannelijke en vrouwelijke gametocyten hebben roze en blauw cytoplasma, respectievelijk. Als gametocyten aanwezig zijn, volgt stap 3.6. </li><li> Als gametocyten afwezig zijn, blijven monitoren dagelijks tot ze verschijnen. Als gametocyten aanwezig zijn, blijven de volgende stap. </li><li> Injecteer 50 ul van anestheticum cocktail bevat 33 mg / ml ketamine en 3 mg / ml van xylazine in het peritoneum van een muis aan elke geïnfecteerde muis (per 20 gram muis lichaamsgewicht) verdoven. Uiteindelijke dosis van ketamine en xylazine is 82,5 en 7,5 mg / kg, respectievelijk. </li><li> Leg de muizen gezicht naar beneden op de bovenkant van een kooi met daarin volwassen Anopheles stephensi muggen die zijn van suiker leveren uitgehongerd voor 24 uur en laat de muggen te voeden gedurende 30 minuten zonder onderbreking. </li><li> Houden de muggen in een insectary onder standaard condities (temperatuur wordt gehouden tussen 24-26 ° C, ook aanvullende methoden te zien voor het onderhoud van laboratorium muggen). </li><li> Gebruik een besmette muis voor elke 50 tot 100 vrouwelijke muggen. Meteen euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie na de voeding, terwijl de muizen nog steeds onder narcose. </li></ol> 4. Ontleden Mosquito MidgUTS en Counting Oöcysten <ol><li> Negen dagen na de voeding, zal de muggen worden onderzocht op oöcysten in middendarm van het insect. De aanwezigheid van oöcysten in de muggen die zich voeden met single-kloon geïnfecteerde muizen die gametocyten van de twee ouders stammen aangeeft zijn besmettelijk. </li><li> Te ontleden een mug middendarm, gebruik een aspirator verbonden met een kleine container 5 tot 10 geïnfecteerde muggen uit de kooi halen. </li><li> Met behulp van CO 2 gas, verdoven de muggen en breng ze in een glazen petrischaal op ijs. Apart en gooi mannelijk muggen. De antennes van de mannetjes zijn opvallend bushier in vergelijking met de vrouwtjes. </li><li> Vul twee spuiten met PBS en monteer ze met 26 gauge half-inch (G ½) naalden. Borg ongeveer 100 pi PBS uit een spuit op een glasplaatje. </li><li> Overdracht 5-10 verdoofd vrouwelijke muggen op de daling van PBS en plaats de schuif op een dissectie microscoop. </li><li> Met dezelfde naalden, dan is elke mug de vleugels en de benen te verwijderen, en houdt de insecten op de thorax en posterior buik, uit elkaar te trekken van het lichaam tot aan de middendarm, een witte zak-achtig lichaam, wordt vrijgegeven. Maak de middendarm en gooi de rest van het lichaam. </li><li> Voeg meer PBS op de middendarm als de dia's zijn droog. De middendarm zal degenereren als laat gedroogd. Plaats een deksel glijden over de midguts. </li><li> Onderzoek de midguts onder een lichtmicroscoop bij een 100x vergroting. Tel het aantal oöcysten in elk middendarm (afb. 3). Oöcysten herkenbaar is als een dikke muur cirkelvormige structuren die liggen aan de buitenkant van de midguts. </li><li> Wanneer u klaar bent, gooi spuiten, naalden, en schuif in een scherpe voorwerpen bak. </li><li> Als oöcysten zijn afwezig in de midguts, feed muggen met geïnfecteerde muizen met het hogere aantal gametocyten en geven een langere voedertijd. Temperatuur is van cruciaal belang voor deze stap. Zorg ervoor dat de temperatuur is vastgesteld op 24 tot 26 ° C. </li></ol> 5. Het verzamelen van sporozoieten van Muggen door centrifugeren <ol><li> Bereid sporozoiet verzameling buizen als volgt: knip het deksel van een schone 0,5-ml centrifugebuis en punch een gat (0,1-0,2 mm diameter) aan de onderkant van de buis met behulp van een gevlamd 19 G naald. </li><li> Vul 1 / 3 van de buis met glaswol. Plaats de filter buis in een 1.5-mL collectie buis (een buis voldoende is om te oogsten sporozoieten van ~ 100 muggen) </li><li> Op dag 17 na het voeden, het verzamelen van muggen (Stap 4) uit de kooien in een kleine container met behulp van een afzuiger. </li><li> Gebruik CO 2-gas aan muggen verdoven. </li><li> Scheid de vrouwtjes van de mannelijke muggen. Breng de verdoofde vrouwelijke muggen uit de container naar een glazen petrischaal op ijs. </li><li> Bereid twee spuiten met 26 G ½ naalden gevuld met PBS. Borg ongeveer 100 pi PBS uit een spuit op een glasplaatje. </li><li> Overdracht van de muggen op een microscoopglaasje. Verwijder de muggen 'hoofd, vleugels, poten en buik, onder een dissectie microscoop. </li><li> Met behulp van fijne punt pincet overdracht van de thoraxes in 0,5 ml PBS in een 1.5-mL homogenisator (mortier en stamper). Bewaar de thoraxes op ijs (sporozoiet blijft besmettelijk voor 2-3 uur). </li><li> Homogeniseer de thoraxes op het ijs te sporozoieten vrijlating uit de speekselklieren (zie figuur 3), en breng de lysaten (homogenaten) in de buis gevuld met glaswol (Stap 5.1 tot 5.2) met behulp van een glazen pipet. </li><li> Centrifuge voor 10 tot 20 seconden bij 1000 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Verzamel de flow-through (het gezuiverde sporozoiet schorsing) met behulp van een injectiespuit met een 22 tot 30 G naald. (Optioneel: druppel 10 tot 50 pi van de doorstroming op een microscopisch preparaat, plaats een deksel glijden en het live sporozoieten visualiseren onder een standaard lichtmicroscoop, 400X vergroting, zie ook Fig 3) </li><li> Injecteer ip 0.1-0.5 ml van de suspensie sporozoiet in muizen (tot maximaal 200.000 parasieten kunnen worden geoogst uit een enkele mug, zie ref 12). In een succesvolle case, zal het dier besmet raken 72 uur na een injectie. </li></ol> 6. Klonen Nakomelingen met behulp van beperkte verdunning <ol><li> Tweeënzeventig uur na de sporozoiet injecties, verzamel staart bloed van de donor twee muizen geïnfecteerd met de parasiet verschillende stammen voor microscopisch onderzoek na de Giemsa kleuring van dun bloed uitstrijkjes en voor het meten van de rode bloedcellen dichtheid (zie aanvullende materialen voor gedetailleerde procedures). </li><li> Kies een muis het weergeven van een 0,1 tot 1% parasitemie en waarvan de geïnfecteerde rode bloedcellen bevatten meestal enkele parasieten als donor voor het klonen procedure. Herhaal stap 6.1 komende dagen als de muizen zijn microscopisch negatief. Als de dieren niet besmet zijn binnen 14 dagen, herhaal stap 2 tot 5 en bepalen van de aanwezigheid van sporozoieten in stap 5.11). </li><li> Verdun de geoogste staart bloed in een koude 01:01 oplossing van de oplossing kalfsserum en zoogdieren Ringer's (2,7 mM kaliumchloride, 1,8 mM calciumchloride, 154 mM natriumchloride) om een ​​con te bereikencentratie van 0,6 tot 1 geïnfecteerde rode bloedcellen per 100 ul, en bewaar het inoculum op het ijs. Op deze manier moeten de meeste van individuele muis ontvangen, hetzij een of nul parasieten. </li><li> Spuit 100 pi van de verdunde besmet bloed in elk van 50 tot 100 muizen. </li><li> Vijf tot zeven dagen later, het scherm van de muizen voor de aanwezigheid van bloed fase parasieten door het onderzoeken van Giemsa-gekleurde dunne bloeduitstrijkjes. In een geslaagd experiment, wordt 20-50% van de muizen geïnfecteerd en zal parasitemie van 0.1-5.0% show op dag 8 na infectie. </li></ol> 7. Karakterisering van Nageslacht met behulp van genetische merkers <ol><li> Verzamel 20 tot 40 ul van de muis staart bloed in een 1.5-mL microcentrifugebuis dat 0,2 mL van gekoelde fysiologische zoutoplossing citraat, vortex kort en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 3000 rpm bij kamertemperatuur pellet de bloedcellen bevat. Onmiddellijk uittreksel DNA of houden de pellet bij -80 ° C. </li><li> Bereid parasiet DNA met behulp van een standaard DNA-extractie methoden. Voor een snelle isolatie van DNA, gebruik dan een High Pure PCR-template voorbereiding kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Recombinant nakomelingen worden geïdentificeerd na het genotypering met behulp van microsatelliet (MS) of single nucleotide polymorfisme (SNP) op verschillende chromosomen die kunnen onderscheiden van de twee ouders stammen van de genetische kruis. Een vereenvoudigde methode met behulp van een fluorescent gelabelde primers voor MS genotypering van P. yoelii kan worden gebruikt (zie ref 8,9). </li></ol> 8. Invriezen van bloed-stage malariaparasieten <ol><li> Verzamel 0,5-1 ml van besmet bloed door het hart doorboren van een verdoofd muis met parasitemie van 5-20% 5-10 ml gekoelde fysiologische zoutoplossing. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 rpm bij kamertemperatuur. Gooi supernatant. </li><li> Voeg druppelsgewijze 2x volume van Glycerolyte 57 oplossing (Fenwal Laboratories) op bloed pellets en meng goed. </li><li> Breng de suspensie cryotubes (+0.2-0,5 ml per buis). </li><li> Bewaar de gecryopreserveerde bloed bij -80 ° C (maximaal 1 maand) of in vloeibare stikstof. </li></ol> 9. Representatieve resultaten: In een geslaagd experiment, zal 5-10% van de gekloonde lijnen onafhankelijk zijn recombinant nageslacht. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een schematische weergave van de levenscyclus en genetische recombinatie gebeurtenissen tijdens een genetische kruis. Genetische recombinatie evenementen vinden plaats tijdens de vroege fase van de ontwikkeling in de mug. Na de bevruchting van de "haploïde" mannelijke en vrouwelijke gameten van verschillende genetische achtergronden in de middendarm van de mug, zijn "diploïde" zygoten gevormd. De zygote vormt de enige diploïde stadium van de parasiet levenscyclus; meiose volgt binnen de 12 uur van de bevruchting, en alle volgende fasen in de mug en zoogdieren blijven haploïde. De resulterende zygoten ontwikkelen tot ookinetes en oöcysten. Groei en mitotische deling van elke oocysten produceert duizenden sporozoieten, die vrijkomen in hemoceal muggen '. Die sporozoieten die migreren naar speekselklieren zijn in de positie om worden doorgegeven aan een zoogdier gastheer, waarbij de ontwikkeling van de lever en rode bloedcellen fasen plaatsvindt. In de loop van de rode bloedcellen cycli, kunnen sommige parasieten differentiëren tot volwassen mannelijke en vrouwelijke gametocyten. De parasiet levenscyclus is voltooid wanneer deze gametocyten worden overgenomen door een andere mug, bestendigen transmissie. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Erfenis van de nucleaire genen in malaria parasieten en productie van recombinante nageslacht. Genetische recombinatie kunnen worden gegenereerd door middel van chromosomale herschikking of door het cross-over gebeurtenissen. Homozygote nakomelingen geproduceerd door zelfbestuiving tussen gameten van dezelfde ouders kloon 1 of 2 (A en D), respectievelijk. B) heterozygote nakomelingen geproduceerd door kruisbestuiving tussen gameten van de twee verschillende ouders klonen, recombinant kernen (blauwe ovalen) wordt gevormd door chromosomale herschikking alleen. C) heterozygote nakomelingen geproduceerd uit kruisbestuiving tussen gameten van de twee verschillende ouder klonen, recombinant kernen (rode ovalen) wordt gevormd door cross-overs tussen de niet-zuster chromatiden van de homologe chromosomen. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Morfologie van het knaagdieren malariaparasiet Plasmodium yoelii. A) ring stadium, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoïeten, E) onvolwassen mannelijk gametocyt, F) volwassen mannetje gametocyt, G) onvolwassen vrouwelijke gametocyt, H) volwassen vrouwelijke gametocyt, I) middendarm met de oöcysten op dag 10 na voeding (rijpe oöcysten aangegeven met pijlen, 200x vergroting), J) mug speekselklieren (100x vergroting), K) sporozoieten (400x vergroting).

<ol><li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li>
<li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li>
<li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi%3A+are+chloroquine-resistance+transporter+%28crt%29+and+multi-drug+resistance+%28mdr1%29+orthologues+involved%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li>
<li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li>
<li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+polymorphisms+in+an+approximately+330+kDa+protein+are+linked+to+chloroquine-resistant+P.+falciparum+in+Southeast+Asia+and+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa.</a> Cell. 91, 593-603 (1997).</li>
<li>Hayton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+binding+protein+PfRH5+polymorphisms+determine+species-specific+pathways+of+Plasmodium+falciparum+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion.</a> Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).</li>
<li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li>
<li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li>
<li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li>
<li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+recombination+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li>
<li>Sinden, R. E., Hartley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+meiotic+division+of+malarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool%22%5BJournal%5D)">Identification of the meiotic division of malarial parasites.</a> J Protozool. 32, 742-744 (1985).</li>
<li>Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+centrifugation+method+for+rapid+separation+of+sporozoites+from+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes.</a> J Parasitol. 70, 831-833 (1984).</li>
<li>Yoeli, M., Most, H., Bone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+berghei%3A+cyclical+transmission+by+experimentally+infected+Anopheles+quadrimachulatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus.</a> Science. 144, 1580-1581 (1964).</li>
<li>Landau, I., Boulard, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandau%2C+I+%22Life+cycles+and+Morphology%22">Life cycles and Morphology</a>. , Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).</li>
<li>Vanderbergh, J. P. Y., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+sporogonic+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei.</a> J Parasitol. 52, 559-564 (1966).</li>
<li>Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+on+pathogenicity+and+mosquito+transmission+success+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi+adami%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami.</a> Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).</li>
<li>Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li>
<li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+group+selection%3A+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li>
<li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li>
</ol>

Omdat de auteurs zijn werknemers bij de overheid en dit is een werk voor de overheid, het werk is in het publieke domein in de Verenigde Staten. Niettegenstaande alle andere overeenkomsten, het NIH zich het recht om het werk te verstrekken aan PubMedCentral voor weergave en gebruik door het publiek, en kan PubMedCentral tag of wijzigen van het werk in overeenstemming met haar gebruikelijke praktijken. U kunt vaststellen rechten buiten de VS onderworpen aan een door de overheid te gebruiken licentie.

Tonen we de technieken voor de productie van een genetische kruis in het knaagdier malaria Plasmodium yoelii, die ook van toepassing op de productie van genetisch kruisen in andere knaagdieren malarias. Infecties van muizen met enkele ouders klonen worden doorgaans uitgevoerd om een ​​succesvolle overdracht van het ouderlijk parasieten te bepalen om ervoor te zorgen dat de ouders bevoegd zijn in het produceren van functionele gameten voor het uitvoeren van een kruis. Succesvolle tra...

Aanvullende materialen: <ul><li> Onderhoud van laboratoriummuizen </li><li> Onderhoud van het laboratorium muggen </li><li> Microscopisch onderzoek van dunne bloeduitstrijkjes gekleurd met Giemsa kleuring </li><li> Meting van rode bloedcellen dichtheid </li></ul> Onderhoud van laboratoriummuizen Vrouwtjes van inteelt laboratorium muizenstam BALB / c, van 5 tot 8 weken oud, worden gebruikt in de studie. Muizen zijn ondergebracht in een standaard vast-bottom polycarbonaat kooi met wire-bar deksel, uitgerust met feeder en een fles water. Muizen worden gehandhaafd op een constante temperatuur (25 ± 1 ° C) op 12:12 uur licht: donker cyclus. Muizen mogen voeden 2018S Harlan Teklad Global 19% eiwit geëxtrudeerde knaagdierendieet (steriliseerbaar, van Harlan-Teklad) en worden geleverd met aangezuurd drinkwater ad libitum. Experimenten op dieren zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Animal Care en gebruik Comite bij de Nationale Instituut voor Allergie en Infectieziekten onder protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) in te stellen. Onderhoud van het laboratorium muggen Muggen zijn afkomstig uit een laboratorium gekweekte kolonie van Anopheles stephensi. De volwassenen worden gehandhaafd in nylon kooien bewaard in een temperatuur-en vochtigheid-gecontroleerde ruimte (23 tot 25 ° C voor Plasmodium yoelii en Plasmodium chabaudi, en 19 tot 21 ° C voor Plasmodium berghei, 80 tot 95% luchtvochtigheid, op 12:12 uur licht: donker cyclus). Volwassen muggen worden gevoed met 10% glucose en 2,00% para-aminobenzoëzuur (PABA), aangevuld water oplossing. Voor het verkrijgen van hoge kwaliteit volwassenen, zijn 500 larven gekweekt in een lage dichtheid voorwaarde in een L gedestilleerd water in een 1000-cm 3 te openen schotel geleverd met ongeveer 1 mg natrium bicarbonaat. Na het uitkomen, worden de larven gegeven TetraMin poeder (PETCO) totdat ze zich ontwikkelen tot de pop podium en worden overgebracht naar de volwassen mug kooien voor opkomende. Microscopisch onderzoek van dunne bloeduitstrijkjes gekleurd met Giemsa kleuring Met een schone schaar knip uit de tip (1,0 mm) van de staart van de besmette muis. Plaats een druppel (0,5-1,0 pi) van de staart van het bloed op een schoon exemplaar dia. Muis stopt bloeden in 1-2 minuten. Leg een schone spreader slide op de top van de bloeddruppel, het onderhouden van het op een hoek van 45 ° ten opzichte van het monster glijden, en laat het bloed tot adsorptie aan de gehele breedte van de strooier. Houd het monster glijbaan en duw de strooier schuiven snel en soepel aan een dun uitstrijkje te produceren. Laat het bloed film droog is, en vervolgens onder te dompelen de dia&#39;s in absolute methanol. Laat de schuif aan de lucht drogen nog een keer voordat het te bedekken met Giemsa kleuring (10% Giemsa kleurstof in gedestilleerd water). Na het incuberen van de dunne bloed films voor 10-15 minuten op kamertemperatuur, spoel de glaasjes zorgvuldig met leidingwater en laat het drogen aan de lucht. Onderzoek van het aantal geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBC, zie figuur 3 voor de morfologie van de geïnfecteerde RBC) onder een lichtmicroscoop met immersie olie bij 1000x vergroting (met 100x objectief) en bereken parasitemie (het aantal iRBC per 100 RBC geteld). Verschillende stammen van malariaparasieten variëren in groei en pathogeniteit. Controle van het bloed stadium parasitaemias kan worden uitgevoerd 24 uur na de injecties, afhankelijk van de dosis van het bloed podium malariaparasieten. Zo zal muizen worden microscopisch positief 24 uur bij geïnjecteerd met 10 7 geïnfecteerde RBC intraperitoneaal of 10 6 geïnfecteerde RBC intraveneus. Meting van rode bloedcellen dichtheid Net als de niveaus van parasitaemias, rode bloedcellen (RBC) dichtheid in geïnfecteerde muizen varieert in de loop van de infectie. RBC dichtheid moet worden gemeten binnen 1-2 uur voor het begin van de single-en mixed-kloon infectie en het klonen experimenten. Er zijn twee methoden voor de meting van RBC dichtheid: een handmatige telling met behulp van Neubauer hemocytometer en een automatisch tellen met behulp van een Cellometer (Nexcelom Bioscience). In beide methoden achtereenvolgens hoeveelheden van 1 ul van de muis staart bloed met behulp van een glazen capillaire (VWR) en verdun met 10 ml PBS en meng goed. Voor het gebruik van een Neubauer hemocytometer, belasting 20 pi van de suspensie op de hemacytometer. Plaats de hemacytometer op een licht microscoop met 10x objectief. De hemacytometer bevat een raster verdeeld in 9 grote vierkanten, en vier grote pleinen in de hoek zijn verder verdeeld in 16 kleine vierkantjes. Tel het totaal aantal cellen in elk van de 16 kleine vierkantjes in de vier hoeken pleinen. Om te voorkomen dat het tellen van vertekening of het tellen van cellen die een raster lijn overlappen, telt een cel als &quot;in&quot; als het overlapt de bovenkant of rechts lijnen en &quot;out&quot; als het overlapt de bodem of naar links lijnen. Schatten het aantal cellen per een klein plein en de delen door 0,00625 (het volume van een kleine vierkante is 6,25 nL). Dit levert het aantal cellen per microliter (&amp;mu, L). Uit deze gegevens, het berekenen van de uiteindelijke rode bloedcellen dichtheid te vermenigvuldigen met 10.000 (een verdunningsfactor). Spoel de dekglas en telkamer met gedestilleerd water en 70% ethanol, de lucht drogen. Als alternatief, load 20 pi van de suspensie op een Cellometer telkamer dia. Plaats de dia in een Cellometer slide kamer (de lezer). Start de Cellometer software, kies de &quot;rode bloedcel&quot; optie, en voer een verdunningsfactor van 10.000. Noteer de RBC dichtheid.

protocol voor de productie van een genetische kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variatie in reactie op antimalariamiddelen en pathogeniteit van malariaparasieten is van biologische en medische belang. Koppeling in kaart brengen heeft geleid tot succesvolle identificatie van de genen of loci die ten grondslag liggen verschillende eigenschappen in malariaparasieten van knaagdieren 1-3 en mensen 4-6. De malariaparasiet Plasmodium yoelii is een van de vele soorten malaria geïsoleerd van wilde Afrikaanse knaagdieren en is aangepast om te groeien in laboratoria. Deze soort reproduceert veel van de biologische kenmerken van de menselijke malariaparasieten, genetische merkers zoals microsatellieten en versterkt fragment lengte polymorfisme (AFLP) markers zijn ook ontwikkeld voor de parasiet 7-9. Zo kunnen genetische studies in knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd om het onderzoek naar Plasmodium falciparum te vullen. Hier tonen we de technieken voor het produceren van een genetische kruis in P. yoelii die voor het eerst werden ontwikkeld door Drs. David Walliker, Richard Carter, en collega&#39;s aan de universiteit van Edinburgh 10. Genetische kruizen in P. yoelii en andere knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het infecteren van muizen Mus musculus met een inoculum met gametocyten van twee genetisch verschillende klonen die verschillen in fenotypen van belang en door muggen te voeden op de geïnfecteerde muizen 4 dagen na infectie. De aanwezigheid van mannelijke en vrouwelijke gametocyten in de muis bloed is microscopisch bevestigd voor het voeden. Binnen 48 uur na de voeding, in de middendarm van de mug, de haploïde gametocyten differentiëren in mannelijke en vrouwelijke gameten, bemesten, en vormen een diploïde zygote (afb. 1). Tijdens de ontwikkeling van een zygote in een ookinete, meiose lijkt voor te komen 11. Als de zygote is afgeleid door middel van kruisbestuiving tussen gameten van de twee genetisch verschillende parasieten, genetische uitwisseling van (chromosomale herschikking en cross-overs tussen de niet-zuster chromatiden van een paar homologe chromosomen;. Fig. 2) kan optreden, wat resulteert in recombinatie van genetisch materiaal op homologe loci. Elke zygote ondergaat twee opeenvolgende nucleaire divisies, wat leidt tot vier haploïde kernen. Een ookinete ontwikkelt zich verder in een oocysten. Zodra de oocysten rijpt, zijn duizenden sporozoieten (de nakomelingen van het kruis) gevormd en komen vrij in de mug hemoceal. Sporozoieten worden geoogst uit de speekselklieren en geïnjecteerd in een nieuwe muis host, waar de pre-erytrocytaire en erytrocytaire fase van ontwikkeling plaatsvindt. Erytrocytaire vormen zijn gekloond en geclassificeerd met betrekking tot de personages onderscheiden van de ouderlijnen voorafgaand aan de genetische linkage in kaart brengen. Controle infecties van de individuele ouders klonen worden uitgevoerd op dezelfde manier als de productie van een genetische kruis.

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen van<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; En is van toepassing op andere knaagdieren malariaparasieten.

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Variatie in de respons op antimalariamidelen en in de pathogeniciteit van malariaparasieten is van biologisch en medisch belang. Koppingsanalyse heeft geleid tot ...

Het algemene doel van deze procedure is om een genetische kruising van de knaagdier-malariaparasiet plasmodium yoi te produceren om recombinant nageslacht te genereren. Dit wordt bereikt door eerst een groep muizen te injecteren met een gemengd inoculum dat de twee ouderclonen van de parasieten die gekruist moeten worden bevat. De geïnfecteerde muizen worden vervolgens gebruikt om muggen te voeden; de gameten van elke ouderstam zullen fuseren tot een diploïde zygote. Meiotische deling in dit stadium kan leiden tot genetische recombinatie, waardoor recombinant nageslacht wordt geproduceerd.De resulterende sporozoïeten worden vervolgens geoogst uit de speekselklieren van de muggen en opnieuw geïnjecteerd in naïeve ontvangende muizen om bloedstadiumparasieten te verkrijgen, waaronder individuele recombinante klonen die door gelimiteerde verdunning geïsoleerd kunnen worden. In een succesvol experiment zal vijf tot 10% van de gekloonde lijnen recombinant zijn, wat gekarakteriseerd kan worden door genotypering op de juiste genetische markers. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het malaria-onderzoek, zoals wat de genetische determinanten zijn van drugresistente

protocol-for-production-genetic-cross-rodent-malaria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video illustreert de algemene technieken die worden gebruikt aan de achterzijde Anopheles gambiae in het laboratorium. De methoden voor het onderhoud van het laboratorium muggen worden gedemonstreerd in alle stadia van het leven van het organisme cyclus van larven tot poppen om bloed te geven volwassenen.

Protocol voor Mosquito Opfok (A. gambiae)

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

This video demonstrates the generation of an experimental mouse model of cerebral malaria. Sporozoites isolated from Plasmodium berghei-infected female mosquitoes are injected into a restrained mouse's tail veins, leading to blood-brain barrier disruption and brain inflammation, causing cerebral malaria. This infected mouse model offers a valuable tool to study in vivo microvascular pathology associated with cerebral malaria.

Generation of a Mouse Model of Experimental Cerebral Malaria Using Host Mosquito-Derived Sporozoites

Tuberculose en malaria zijn twee van de meest voorkomende infecties bij mensen en de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in arme bevolking in de tropen. Wij vestigden een experimenteel model systeem om resultaten van malaria-tuberculose co-infectie te bestuderen in muizen na challenge met beide ziekteverwekkers via hun natuurlijke route van infectie.

Een experimenteel model om te studeren Tuberculose-Malaria Coinfection op Natuurlijke Transmissie van Mycobacterium tuberculosis En Plasmodium berghei</i

Muggen die malaria overdragen, hebben een aantal epidemiologisch belangrijke kenmerken die alleen kunnen worden gedetecteerd met behulp van moleculaire technieken. Door gebruik te maken van een MALDI-TOF-gebaseerde SNP-genotyperingsplatform, hebben we een test ontwikkeld voor het gelijktijdig detecteren van meerdere belangrijke eigenschappen (soorten, insecticideresistentie, parasietinfectie en gastheukeuze) van malariavectoren.

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Beschrijven we een methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in Plasmodium falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken.

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Het bipartiete GAL4-UAS systeem is een veelzijdig instrument voor modificatie van genexpressie op een gecontroleerde spatiotemporale manier die functionele genetische analyse in Anopheles gambiae mogelijk maakt. De beschreven procedures voor het gebruik van dit systeem zijn een semi-gestandaardiseerde kloonstrategie, seksing en screening van poppen op fluorescerende eiwitmarkers en embryofixatie.

Gebruik van het GAL4-UAS-systeem voor functionele genetica in Anopheles gambiae

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

Leer genetische kruisingen produceren van de knaagdier malariaparasiet Plasmodium yoelii om recombinante nakomelingen te genereren. Deze methode helpt onderzoekers genetische determinanten van resistentie te bestuderen.

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Meer video's verkennen