Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Het algemene doel van deze procedure is om een genetische kruising van de knaagdier-malariaparasiet plasmodium yoi te produceren om recombinant nageslacht te genereren. Dit wordt bereikt door eerst een groep muizen te injecteren met een gemengd inoculum dat de twee ouderclonen van de parasieten die gekruist moeten worden bevat. De geïnfecteerde muizen worden vervolgens gebruikt om muggen te voeden; de gameten van elke ouderstam zullen fuseren tot een diploïde zygote. Meiotische deling in dit stadium kan leiden tot genetische recombinatie, waardoor recombinant nageslacht wordt geproduceerd.

De resulterende sporozoïeten worden vervolgens geoogst uit de speekselklieren van de muggen en opnieuw geïnjecteerd in naïeve ontvangende muizen om bloedstadiumparasieten te verkrijgen, waaronder individuele recombinante klonen die door gelimiteerde verdunning geïsoleerd kunnen worden. In een succesvol experiment zal vijf tot 10% van de gekloonde lijnen recombinant zijn, wat gekarakteriseerd kan worden door genotypering op de juiste genetische markers. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het malaria-onderzoek, zoals wat de genetische determinanten zijn van drugresistente varianten en transmissie bij malaria?

Parasieten Bij kamertemperatuur voor twee vials die de bevroren bloedstadium-malariaparasieten bevatten die gekruist moeten worden. In dit voorbeeld zijn de twee gebruikte knaagdier-malariaparasietstammen plasmodium yoi, oi, en plasmodium. Yoi Nigerians Vul een spuit met een naald van 22 tot 30 gauge en trek 400 µL PBS pH 7.4 op met dezelfde spuit.

Zuig 100 µL van het Thor-geïnfecteerde bloed op en keer de spuit herhaaldelijk om tot de inhoud homogeen is gemengd. Tijdens deze demonstratie worden geanestheseerde dieren gebruikt om pijn en stress te minimaliseren. De anesthesie wordt uitgevoerd door 50 µL van een anesthetisch cocktailmengsel, bestaande uit 82,5 mg/kg ketamine en 7,5 mg/kg xylazine, in het peritoneum van een muis te injecteren.

Houd de muizen in de gaten wat betreft de diepte van de anesthesie om mortaliteit te voorkomen. Bij gebruik van deze procedure blijven de muizen 20 tot 30 minuten onder anesthesie. Injecteer vóór het herstel 200 µL van de parasietbevattende oplossing direct in het peritoneum van een muis.

Gooi de spuit na gebruik weg in een naaldencontainer. Gebruik deze methode om twee muizen te infecteren met elk van de twee parasietstammen die gekruist moeten worden, drie tot vijf dagen na de injecties. Parasieten in het bloedstadium zullen zich ontwikkelen in de geïnfecteerde muizen.

Knip met steriele scharen het puntje van de staart af bij de donor-muizen die zijn geïnfecteerd met de verschillende parasietstammen. Verzamel een druppel bloed uit de muisstaart op een objectglas en maak dunne uitstrijkjes. Kleur het dunne bloeduitstrijkje met guillem-kleuring.

Guillem SA-kleurstof zal niet-geïnfecteerde rode bloedcellen niet kleuren vanwege het ontbreken van een nucleus in deze niet-geïnfecteerde cellen. SAI zal de nucleus van de parasiet kleuren in de geïnfecteerde rode bloedcellen; parasieten en rode bloedcellen verschijnen in de vorm van ringstadia, trofozoïten, schizonten en rupturerende merozoïten. Zodra de parasitemie in beide muizen 1 tot 5% bereikt, kunnen bloedstadiumparasieten worden geoogst voor de mixed-clone infectie.

Knip het puntje van de staart van de donor-muizen die geïnfecteerd zijn met de verschillende parasieten. Gebruik hiervoor steriele scharen zoals eerder beschreven. Verzamel één microliter muizenstaartbloed met een glazen capillair in één milliliter steriele PBS. Gebruik 20 microliters van de bloedsuspensie om de dichtheid van de rode bloedcellen te analyseren met CellOMe.

Verdun de bloedmonsters, op basis van de metingen van de dichtheid en parasitemie van de rode bloedcellen, in een fysiologische citraat-zoutoplossing om een concentratie van 1 miljoen geïnfecteerde rode bloedcellen per 100 µL te verkrijgen. Combineer een monster geïnfecteerd bloed van de twee donoren in een verhouding van één-op-één om een gemengd kloon-inoculum te verkrijgen. Injecteer vervolgens 100 µL van het gemengde monster in het peritoneum van elke muis die geïnfecteerd moet worden.

Gebruik twee muizen voor infecties met een enkele kloon om de succesvolle transmissie van elke ouderstam te kunnen bevestigen. De seksuele stadia van de parasiet, genaamd mannelijke en vrouwelijke gametocyten, zouden rond vier dagen na de infectie in het bloed van de muizen moeten verschijnen. Begin de muizen dagelijks te monitoren op de aanwezigheid van gametocyten door staartbloed af te nemen zoals eerder beschreven en dunne bloeduitstrijkjes van de staart te maken.

Mannelijke en vrouwelijke cytes zijn herkenbaar aan de aanwezigheid van grote granula of pigmenten. Het cytoplasma van mannelijke gato sites is roze, terwijl het cytoplasma van vrouwelijke TER sites blauw is. Alleen volwassen gato sites vertonen een grote vacuole.

Zodra rijpe cytes van beide geslachten zijn gedetecteerd, kunnen de muizen worden gebruikt om muggen te voeden. Injecteer 50 µL van een ketamine-, xylazine- en anesthesie-oplossing in het peritoneum van elke geïnfecteerde muis. Zodra de muizen zijn verdoofd, plaatst u er één met de buik naar boven op de bovenkant van een kooi met 50 tot 100 vrouwelijke Anis defense enzyme-muggen die 24 uur geen suikervoorziening hebben gehad, en laat u de muggen 30 minuten lang ononderbroken voeden.

Euthanaseer de muizen op een humane wijze onmiddellijk na de voedingsperiode. Als de transmissie succesvol is, zullen de door de muggen opgenomen gametocyten negen dagen na de voeding gefuseerd zijn tot diploïde zygoten die uitrijpen tot oocysten, welke zichtbaar zijn in de middendarm van de insecten. Hoe meer oocysten worden gedetecteerd, hoe groter de kans is dat er recombinante parasieten zijn gegenereerd.

Gebruik een aspirator om vijf tot 10 geïnfecteerde muggen uit de kooi te verzamelen en breng de muggen over naar een klein bakje. Narcoseer de muggen met koolstofdioxidegas en breng ze over naar een glazen Petrischaal op ijs. De mannetjesmuggen, waarvan de antennes merkbaar voller zijn dan die van de vrouwtjes, kunnen worden weggegooid.

Vul twee spuiten met PBS en voorzie deze van naalden met een gauge van 26 en een lengte van een halve inch. Breng ongeveer 100 µL PBS vanuit een spuit aan op een objectglas. Verplaats vijf tot 10 geanestheseerde vrouwelijke muggen naar de druppel PBS en plaats het objectglas onder een dissectiescoop met behulp van de naalden.

Verwijder de vleugels en poten van elke mug en houd het insect vervolgens vast bij het thorax en het achterste deel van het abdomen. Trek het lichaam uit elkaar totdat de middendarm, een wit zakvormig lichaam, vrijkomt. Scheid de middendarm en werp de rest van het lichaam weg tijdens het uitvoeren van de dissecties.

Zorg ervoor dat de middendarmen vochtig blijven met behulp van de PBS uit de dissectienaalden. Plaats een dekglas over de middendarmen zodra de dissectie is voltooid. Onderzoek de middendarmen onder een lichtmicroscoop bij een 100-voudige vergroting.

OOS zijn herkenbaar als dikwandige cirkelvormige structuren die zich op het buitenste oppervlak van de middendarmen bevinden. Tel het aantal OOS in elke middendarm. 17 dagen na voeding zouden sporozoïten die uit de oöcysten zijn vrijgekomen, naar de speekselklieren van de muggen moeten zijn gemigreerd, sporozoïten van malariaparasieten.

Dunne spoelvormige cellen voor het oogsten van sporozoïten. Bereid eerst een opvangbuisje voor met een schone schaar. Knip de dop van een klein einor-buisje van 500 µL af.

Verhit de punt van een steriele naald van 19 gauge en doorboor de bodem van de buis. Vul een derde van de buis met glaswol om een filter te creëren. Plaats de filterbuis in een grotere eppendorfbuis van 1,5 milliliter.

Zodra het filterapparaat gereed is, worden de muggen verzameld en geanestheseerd zoals eerder beschreven. Monteer de insecten in de lucht voor dissectie zoals voorheen en verwijder de koppen, vleugels, poten en abdomina van de muggen. Alleen de thorax bevat de geïnfecteerde speekselklieren.

Breng de thorax met een fijne pincet over naar een homogenisator van 1,5 milliliter die 500 microliters PBS bevat. Homogeniseer de thorax op ijs om de sporozoïeten uit de speekselklieren vrij te maken en breng de homogenaten met een glazen pipet over naar het filtratieapparaat. Centrifugeer de filterbuis gedurende 10 tot 20 seconden bij 1000 omwentelingen per minuut.

Zodra de homogenaten zijn gecentrifugeerd, verzamel dan het filtraat met een spuit die is voorzien van een naald met maat 22 tot 30. Injecteer 100 tot 500 µL van de sporozoïetensuspensie in het peritoneum van een muis. Begin drie dagen na infectie met het monitoren van de parasitemie en de dichtheid van de rode bloedcellen van de muizen.

Kies een muis met een parasitemie van 0,1 tot 1% en waarvan de geïnfecteerde rode bloedcellen voornamelijk enkele parasieten bevatten als donor voor de kloningsprocedure. Neem een passende hoeveelheid bloed af in PBS; verdun het staartbloed van de muis in een koude één-op-één oplossing van kalfsserum en mammalian ringer-oplossing om een concentratie van 0,6 tot 1 geïnfecteerde rode bloedcel per 100 µL te bereiken en bewaar het inoculum op ijs. Reinig de injectieplaats op de staart intraveneus met ethanol.

Injecteer 100 microliters verdund geïnfecteerd bloed in elk van de 100 muizen. Op deze manier moet elke individuele muis één of nul parasieten ontvangen. In een succesvol experiment zal 20 tot 50% van de muizen op dag acht een parasitemie van 0,1 tot 0,5% vertonen.

Vijf tot zeven dagen later worden de muizen gescreend op de aanwezigheid van parasieten in het bloedstadium door middel van onderzoek van gegemmeerde dunne bloeduitstrijkjes. Nakomelingen, parasieten uit de kruising, kunnen vervolgens worden geg genotypeerd via PCR van DNA dat is geëxtraheerd uit staartbloedmonsters, met gebruik van genetische markers op verschillende chromosomen, zoals microsatellieten en single nucleotide polymorphisms. Parasieten waarvan de onafhankelijke genetische loci zijn afgeleid van de twee ouderclonen, zijn recombinante klonen.

Het bloed van de dieren die zijn geïnfecteerd met recombinante parasieten kan worden cryopreserveerd voor toekomstig gebruik. In een succesvol experiment zal vijf tot 10% van het totaal aantal muizen onafhankelijke recombinante nakomelingen hebben. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe genetische processen bij malaria worden geproduceerd.

Parasiet plus medium yoi. Deze methode is evenredig toepasbaar op andere parasietsoorten.