Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

Het algemene doel van deze procedure is om lichtopgewekte reacties te registreren van genetisch gelabelde ganglioncellen in de geïsoleerde muisretina. Dit wordt bereikt door eerst de retina uit het oog van de muis te dissekeren. De tweede stap van de procedure is het behandelen van de retina met een enzym om het resterende glasvocht te verwijderen.

De derde stap van de procedure is om het netvlies met de zijde van de ganglioncellen naar boven in de registratiekamer te plaatsen, de kamer op de microscopentafel te monteren en de genetisch gelabelde ganglioncellen te identificeren. De laatste stap van de procedure is om een whole-cell registratie van de geïdentificeerde ganglioncel te verkrijgen en lichtgeëvoceerde responsen te registreren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de functionele eigenschappen van een gedefinieerd type ganglioncel in het netvlies van de muis tonen, en de signalen definiëren die deze naar de hersenen overbrengt via single-cell patchclamp-registraties.

Hoi, mijn naam is Tiffany Schmidt en ik ben een promovendus neurowetenschappen in het laboratorium van Dr. Paulo Ka Fuji aan de University of Minnesota. Deze techniek maakt het mogelijk om een gedefinieerde, genetisch gelabelde populatie ganglioncellen te identificeren en hiervan registraties te maken, gevolgd door een morfologische analyse. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het visuele veld, zoals de manier waarop verschillende subtypes ganglioncellen belangrijke kenmerken van visuele stimuli verwerken, voorafgaand aan het uitvoeren van de operatie.

Om het netvlies te verwijderen, is de eerste taak het mengen van de acht oplossingen die nodig zijn voor het experiment. De ingrediënten voor alle oplossingen die in dit experiment worden gebruikt, staan in de bijbehorende tekst. Overbreng 200 milliliters van de extracellulaire oplossing naar een bekerglas van 250 milliliters voor de opslag van het netvlies.

Plaats de resterende extracellulaire oplossing in een scheidtrechter voor zwaartekrachtprofusie tijdens de registratie. Beide oplossingen moeten te allen tijde verzadigd blijven met 95% oxygen, 5% carbon dioxide. Om de dendrieten tijdens het experiment te visualiseren, wordt een fluorescente tracer zoals LOR 5 94 aan de intracellulaire oplossing toegevoegd.

Als u van plan bent om immunohistochemie uit te voeren na de whole-cell registratie, voeg dan 0,3% neurobiotine toe aan de intracellulaire oplossing. Zodra de benodigde oplossingen zijn bereid, wordt een muis geëuthanaseerd door koolstofdioxide-asfyxie; verwijder de oogbol door voorzichtig een gebogen pincet nummer twee achter het oog in te brengen en de oogbol op te tillen. Gebruik oogheelkundige scharen om de extraoculaire spieren te verwijderen en de oogzenuw door te snijden.

Plaats de oogbol in een Petri-schaal van 35 millimeter gevuld met extracellulaire oplossing. Verwijder het hoornvlies met een oogheelkundige schaar en trek de lens eruit met een nummer vijf pincet. Gebruik een nummer vijf pincet om de sclera open te scheuren en de resterende oogzenuw door te snijden op het punt waar het netvlies en de sclera samenkomen.

Trek de retina voorzichtig weg van de oogbeker door met de pincet in de ruimte tussen de retina en de sclera te bewegen. Om tijd te besparen, voert u elke stap op beide retina's uit voordat u doorgaat naar de volgende stap. Een cruciale stap is het verwijderen van het glazuim dat aan de retina vastzit. Begin met het vastpakken van het transparante glazuim boven de retina met behulp van een pincet.

Als het glasachtig lichaam succesvol is verwijderd, ziet u een kleine, heldere geleiachtige substantie op de punt van de pincet. Snijd elke retina doormidden om de hoeveelheid bruikbaar weefsel te maximaliseren en om het gemakkelijker te maken de retina in de registratiekamer te monteren. Plaats de retina's in de gezuurstofde volgende extracellulaire oplossing bij kamertemperatuur; door de blootstelling aan licht te beperken tot een minimum, zoals enkel het minimale omgevingslicht van computerschermen, blijven de retina's ongeveer zes uur levensvatbaar.

Neem na de dissectie 500 microliter van de extracellulaire oplossing uit de oplossing waarin de extra retina's worden geborreld. Verdun dit met een aliquot van de collagenase-hyaluronidase-enzymoplossing.

Doe de enzymoplossing in een Petrischaal van 35 millimeter en breng een van de gedissekeerde retinae over naar de schaal. Roteer de Petrischaal gedurende 15 minuten, waarbij constant voorzichtig 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide in de oplossing wordt gespoeld. De enzymoplossing verwijdert eventueel resterend glasachtig lichaam en maakt de toegang tot de ganglioncellaag eenvoudiger. Voor retinae van jongere dieren met minder glasachtig lichaam, of indien er bijwerkingen worden waargenomen, kan de digestie worden verkort tot vijf minuten.

Gebruik een plastic transferpipet waarvan de punt is afgesneden. Verwijder het netvlies uit het enzymhoudende medium. Was het netvlies uitgebreid in extracellulaire oplossing.

Plaats het netvlies in de registratiekamer. Met de fotoreceptorlaag naar beneden gericht, wordt eventuele resterende vloeistof weggezogen met een pipet of weggeveegd met een tissue, waarna de zijkanten van het netvlies worden uitgerold om het weefsel vlak te maken. Wees voorzichtig om alleen de randen van het netvlies aan te raken en niet de ganglioncellaag.

Om het netvlies te verankeren, plaatst u een platina ring met nylon gaas over het netvlies en vult u vervolgens onmiddellijk de kamer met extracellulaire oplossing. Monteer de registratiekamer op de microscooptafel en sluit vervolgens de slang voor zwaartekrachtperfusie van de extracellulaire oplossing, de vacuümslang en de aarding aan. Stel de zwaartekracht zo in dat het vloeistof debiteert met een snelheid van 1 milliliter per minuut of sneller.

Als de perfusiesnelheid te laag is, zal het weefsel onvoldoende worden oxygeneerd en kan de synaptische signalering worden verstoord. De volgende stap is het klaarmaken van de elektrode voor whole cell patch recording. Selecteer een pipet met een weerstand in het bereik van drie tot vijf megaohm.

Vul de opnamepipet met een ontdooide aliquot van de intracellulaire oplossing en plaats deze in de pipethouder met behulp van infrarode verlichting en differentieel interferentiecontrast of DIC-optiek onder een 10 x objectief. Visualiseer het netvlies en de opnamepipet. Het infrarode licht wordt gebruikt om de blootstelling van het netvlies aan zichtbaar licht en de lichtadaptatie te minimaliseren; schakel over naar een 40 x objectief en breng de elektrode in beeld vlak boven het weefsel.

De muislijn die in deze studie is gebruikt, tot expressie brengt EGFP in de ganglioncellen, waardoor de ganglioncellen zichtbaar zijn onder epiflorescentie. De microscopie verlicht het netvlies met epiflorescentie bij 480 nanometers. Als het netvlies gezond is, zouden individuele ganglioncellen zichtbaar moeten zijn.

Ongezonde retina's vertonen grote gegranuleerde kernen en moeten worden weggegooid. Selecteer een van de fluorescerende ganglioncellen voor registratie en gebruik laboratoriumtape om de geselecteerde cel op het computermonitor te markeren. Schakel over naar infrarode optiek zodat het lichaam van de geselecteerde ganglioncel zichtbaar is.

Positioneer de registratie-elektrode nabij de doelgangliecel. Reinig het gebied dat de cel direct bedekt door een zachte positieve druk uit te oefenen op de registratie-elektrode. De elektrodedruk wordt aangebracht via een plastic spuit van 12 cc die met polyethyleenslangen is verbonden met de pipethouder op de amplifier zero.

Eventuele spanningsoffsets. Plaats de elektrode op de geselecteerde ganglioncel totdat er een kuiltje op het celoppervlak verschijnt. Pas een testpuls toe terwijl de versterker in voltage-clamp-modus staat en monitor de stroom die door de pipet loopt.

Breng onderdruk aan om een afsluiting tussen de elektrode en de cel te creëren. Laat de onderdruk los zodra de afsluiting zich begint te vormen en wacht tot de houdstroom wijst op een giga-elektrische afsluiting tussen het celmembraan en de pipet. Breng voorzichtig pulsen van onderdruk aan totdat er capacitieve transiënten verschijnen die aangeven dat de whole-cell registratiemodus is bereikt, en laat vervolgens alle druk los.

Als de toegangsweerstand groter is dan 30 mega ohm, kan dit vaak worden verbeterd door aanvullende, zeer zachte pulsen van negatieve druk. Nadat de whole-cell modus is bereikt, schakelt u het infraroodlicht uit en bedekt u de microscoop met een zwarte doek. Laat de cel vijf minuten lang aan het donker adapteren.

Na vijf minuten is de preparatie klaar voor opname. Schakel in de current clamp-modus de full-field witte lichtstimulatie in en registreer de respons van de ganglioncel. Indien de ganglioncel meerdere keren gestimuleerd moet worden, dient het netvlies tussen de stimulaties naar behoefte aan het donker te kunnen adapteren.

De lichtstimulus kan op dit punt ook worden aangepast om gepatroneerde of chromatische stimuli op te nemen om de responseigenschappen van de ganglioncellen te beoordelen na de opname; de fluorescerende tracer in de intracellulaire oplossing zal inmiddels naar de dendrieten zijn gediffundeerd door te schakelen tussen epi-fluorescentie en DIC-infraroodoptiek. De tracer kan worden gevisualiseerd onder epi-fluorescentie bij 594 nanometers, waarna de dendrieten kunnen worden onderzocht om te bepalen of de ganglioncel on-off of bistratified is. De neurobiotine die aan de intracellulaire oplossing was toegevoegd, is in de ganglioncel gediffundeerd, dus de volgende stap is het voorbereiden van het netvlies voor immunohistochemie.

Trek de pipet voorzichtig terug om verstoring van het celmembraan te minimaliseren. Let op dat als u slechts één retinale ganglioncel per preparaat registreert en vult, u specifieke correlaties kunt leggen tussen de geregistreerde ganglioncel en de gedetailleerde morfologie ervan. Plaats de retina vervolgens in de paraformaldehyde-oplossing en fixeer deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius.

Spoel het gefixeerde retina in PBS door de PBS-oplossing minstens zes keer te verversen gedurende twee of meer uur. Breng het retina na het spoelen over naar een plaat met blokkeringsoplossing, plaats de plaat op een schudmachine en laat deze twee uur staan. Vervang bij kamertemperatuur de blokkeringsoplossing door de strep-detectieoplossing, plaats het retina terug op de schudmachine en laat het twee dagen incuberen bij vier graden Celsius.

Spoel na twee dagen het netvlies in PBS door zes spoelingen van 20 minuten elk uit te voeren om het netvlies te kunnen monteren. Plaats het met de ganglioncelzijde naar boven op een objectglas met behulp van Vector Shield. Bedek het montagemedium met een dekglas en verzegel dit met nagellak; de gelabelde ganglioncel kan nu onder een confocale microscoop worden bekeken.

Deze figuur toont GFP-positieve retinale ganglioncellen gevisualiseerd onder epi-fluorescentie-verlichting bij een 40-voudige vergroting links, en onder DIC-verlichting rechts. Als het netvlies gezond is en de dissectie succesvol was, zijn individuele ganglioncellen zichtbaar onder DIC bij een hoge vergroting. Ongezonde netvliezen vertonen grote gegranuleerde kernen en dienen te worden weggegooid.

Deze figuur toont het type lichtrespons dat typisch is voor een M-type stratificerende intrinsiek fotosensitieve retinale ganglioncel. Afhankelijk van het type retinale ganglioncel dat genetisch is gelabeld in een specifieke preparatie, zullen de responseigenschappen verschillen. Indien de synaptische respons van een bepaalde ganglioncel intact is, moet de cel bij het begin of het einde van de lichtstimulatie reageren met actiepotentialen.

En in het geval van een intrinsiek fotosensitieve ganglioncel, een aanhoudende depolarisatie; deze afbeelding van een met neurobiotine gevulde ganglioncel toont de morfologie van een typische M1-off stratificerende, intrinsiek fotosensitieve retinale ganglioncel. Na whole-cell registratie maakt immunohistochemie een correlatie mogelijk tussen de dendritische morfologie en de elektrofysiologische respons van de retinale ganglioncel. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de retinale put te oxygeneren en het weefsel snel te perfunderen om synaptische responsen te behouden.

Bedankt voor het bekijken van deze demonstratie.