Name: Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Leer lichtgeëvoceerde responsen opnemen van genetisch gelabelde ganglioncellen in de geïsoleerde muizenretina. Deze methode maakt gedetailleerde elektrofysiologische analyses en morfologische studies van specifieke celtypen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Wij danken Darwin Hang voor zijn technische bijstand.

Gebruik van dieren Verklaring: De dieren werden verzorgd in overeenstemming met de richtsnoeren zoals beschreven in voor de verzorging en gebruik van proefdieren, met behulp van protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Minnesota Institutionele Animal Care en gebruik Comite. 1) Bereiding van oplossingen <ol><li> Voor het uitvoeren van elektrofysiologische opname, intracellulaire, extracellulaire, en enzym oplossingen moeten worden voorbereid. </li><li> Extracellulaire oplossing: mix een fles (8.8g) van middelgrote poedervorm Ames '(Sigma) met 1 liter H 2 O en 1,9 g natriumbicarbonaat (23 mm). Op alle punten de extracellulaire oplossing is verzadigd met 95% O 2 / 5% CO 2-gas mengsel. Transfer 200 ml tot een beker voor netvlies opslag. Plaats de resterende oplossing in het perfusie-systeem container voor de zwaartekracht perfusie keer netvlies is gemonteerd. </li><li> Intracellulaire oplossing: Intracellulaire oplossing moet eerder hebben gemaakt en vervolgens in hoeveelheden verdeeld in 500-1000 pi porties en opgeslagen bij -20 ° C. Intracellulaire oplossing is afhankelijk van de benodigde experiment, voor de huidige klem opnames hier getoonde gebruiken we (in mm): 125 K-gluconaat, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH op 7,2 met KOH 5. Een TL-tracer, zoals 10 uM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) kunnen worden toegevoegd aan dendrieten tijdens het experiment, en neurobiotin (0,3%) te visualiseren kunnen ook opgenomen worden voor de analyse van cel-anatomie na opname. Als u klaar bent om op te nemen, ontdooien intracellulaire oplossing. </li><li> Enzymoplossing: Combineer 10.000 eenheden Collagenase (Worthington Chemicals) met 83 mg Hyaluronidase (Worthington Chemicals) in 4,150 ml van extracellulaire oplossing. Bewaar in 50 ul porties bij -20 ° C. Monsters kan worden gebruikt voor enkele weken. Als u klaar bent aan het netvlies te behandelen, verdun hoeveelheid in 500 pl van borrelen extracellulaire oplossing. </li><li> Fosfaat gebufferde oplossing (PBS): In 800 ml H 2 O toevoegen 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4. Breng de pH op 7,4 met NaOH. Zet het volume op een L. </li><li> 0,2 M fosfaatbuffer: In 800 ml H 2 O toevoegen 21,8 g Na 2 HPO 4 en 6,4 g van NaH 2 PO 4. Breng het volume op een L. </li><li> 4% Paraformaldehyde Oplossing: Verhit 50 ml H 2 O tot 60 ° C. Voeg 4g paraformaldehyde, roer enkele minuten. Voeg enkele druppels 1M NaOH (ongeveer 5 druppels), blijf roeren tot de oplossing helder is. Voeg 50 ml 0,2 M fosfaatbuffer in de beker. Controleer de pH met behulp van pH-strips (~ 7.4). Filter en laat afkoelen. </li><li> Het blokkeren van oplossing (10% geit serum, 0,5% TritonX100): toe te voegen in 1,8 ml PBS 0,2 ml van de geit serum en 10 pi Triton X-100. TritonX-100 dient om permeabilise het weefsel. </li><li> Streptavidine-oplossing (5% geit serum, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidine 594): toe te voegen in 1,9 ml PBS 0,1 ml van de geit serum, 10 pi Triton X-100 en 4 pi Streptavidine 594. </li></ol> 2) Isolatie van het netvlies van muis Nodig dissectie-instrumenten: 1 # 2 Tang, 2 # 5 Tang, oogheelkundig schaar <ol><li> Euthanaseren muis volgens erkende protocollen, in dit geval CO 2 stikken en ophelderen oogbol door voorzichtig het plaatsen van een schuine # 2 pincet achter het oog en het opheffen van de oogbol. </li><li> Plaats de oogbol in een 35 mm petrischaal met extracellulaire oplossing. Snijd de oogzenuw en alle aangesloten extraoculaire spieren of het bindweefsel met behulp van oogheelkundige schaar. Knip het hoornvlies met een oogheelkundige schaar en trek de lens met behulp van # 5 tang. Scheur de sclera met behulp van een paar van # 5 pincet en gebruik de tang aan de oogzenuw, waar het netvlies en sclera ontmoeten op de optische schijf te verbreken. Haal voorzichtig het netvlies weg van de oogschelp. Tip: Doe elke stap op beide netvliezen alvorens naar de volgende stap om tijd te minimaliseren. </li><li> Gebruik een tang om glasvocht aan het netvlies te verwijderen. Dit kan worden uitgevoerd door "grijpen" de transparante glasvocht boven het netvlies met een tang. Het glasvocht, indien deze met succes verwijderd, moet zichtbaar als een heldere, gelatineachtige stof op de tang. Tip: Fineersnijmachine netvlies in de helft na verwijdering van glasvocht zal het bedrag van bruikbare weefsel te maximaliseren en te monteren in de kamer te vergemakkelijken. </li><li> Houd de retina in zuurstofrijke extracellulaire oplossing bij kamertemperatuur in een donkere omgeving met een minimum aan omgevingslicht tot ze klaar om te worden verteerd. Netvliezen kunnen worden opgeslagen op deze manier voor ~ 6 uur. </li></ol> 3) Behandeling van het netvlies met enzym mengsel en montage in de opname kamer <ol><li> Verdun een aliquot van collagenase / hyaluronidase in 500 uL extracellulaire oplossing, plaats oplossing in een 35 mm petrischaal en overdracht van het netvlies. </li><li> Houd het netvlies, bevattenING Petri schotel, bedekt en in de duisternis, in een 95% O2 / 5% CO 2-omgeving gedurende 15 minuten onder zacht schudden. Deze stap helpt bij het verteren van de resterende glasvocht en zorgt voor gemakkelijker toegang tot de ganglion cel laag. Tip: voor de netvliezen van jongere dieren met minder glasachtig of als negatieve effecten worden waargenomen, tijd kan worden ingekort tot ~ 5 minuten. </li><li> Verwijderen netvlies van enzym-bevattend medium en was uitgebreid in het extracellulaire oplossing </li><li> Breng de retina in het opnemen van kamer 6 met de fotoreceptor laag naar beneden. Wick weg resterende vloeistof met ofwel een pipet of weefsel en roll-out zijkanten van het netvlies om weefsel voorzichtig om alleen de randen van het netvlies, met name het vermijden van contact met het ganglion cellaag raken plat. Plaats een platina ring met nylon mesh op het netvlies aan het weefsel verankeren en meteen de kamer te vullen met extracellulaire oplossing. </li><li> Monteer de opname kamer op de microscoop podium, hechten buis voor de zwaartekracht perfusie en vacuüm zuig-en bevestigen aarddraad. </li></ol> 4) Lokalisatie van EGFP uitdrukken ganglioncellen en licht stimulatie <ol><li> Perfuseren het netvlies door de zwaartekracht met de extracellulaire oplossing 1 ml / min of sneller tarieven. Tip: Als perfusie te laag is, het weefsel zal niet voldoende zuurstof en synaptische signalen kunnen worden verstoord. </li><li> Vul een opname pipet met intracellulaire oplossing en plaats deze in de pipet houder. Tip: Pipetten met weerstanden in het bereik van 3 tot 5MΩ geven de beste resultaten. </li><li> Visualiseer het netvlies onder infrarood differentieel interferentie contrast (DIC) optiek bij een lage vergroting (10x objectief, NA 0,3) te lokaliseren de opname pipet. Infrarood licht wordt gebruikt om het netvlies blootstelling aan zichtbaar licht te minimaliseren en lichte aanpassing te minimaliseren. Ga naar hogere vergroting (40X objectief, NA 0,8) en breng elektrode in het zicht net boven weefsel. </li><li> Bij hoge vergroting (40x objectief), verlichten het netvlies met epifluorescentie (480 nm voor EGFP) en selecteer een fluorescerende ganglion cel en teken op de computer monitor met behulp van tape (Figuur 1A). </li><li> Onder DIC en infrarood verlichting, de positie van de registratie-elektrode in de buurt van de beoogde ganglion cel (Figuur 1A). Schone gebied onmiddellijk voor cel door het toepassen van lichte positieve druk om de opname te elektrode via een 12 cc plastic spuit is aangesloten op de pipet houder met polyethyleen buizen. Op de versterker, nul eventuele spanning offsets. Plaats elektroden op geselecteerde ganglion cel totdat er een kuiltje verschijnt op het celoppervlak. </li><li> Met de versterker in spanning klem-modus, een proefvlak puls en toezicht op de stroom die door de pipet. Van toepassing zijn negatieve druk op afdichting tussen elektrode en cellen te creëren. Laat negatieve druk als de cel begint te verzegelen en te wachten tot de holding stroom is indicatief voor een GΩ elektrische afdichting tussen membraan van de cel en de pipet. Zachtjes pulsen van negatieve druk tot capacitieve transiënten verschijnen en laat vervolgens de eventuele toepassing van druk. Tip: als de toegang (serie) weerstand is hoog (&gt; 30MΩ), dit kan vaak worden verbeterd door extra, zeer zachte, pulsen van negatieve druk. </li><li> Zodra een stabiele afdichting is bereikt van toepassing een puls van negatieve druk. Na de hele cel modus is verkregen, laat cel tot donker aan te passen voor 5 minuten. Record, in de huidige klem mode, naar aanleiding van full-field, wit licht stimulatie (Figuur 1B). </li><li> Na de opname, zal Alexafluor-594 heeft verspreid naar de dendrieten. De tracer kan worden gevisualiseerd in epifluorescentie bij 594 nm en wordt gebruikt om te bepalen of een ganglion cel is On-, Uit-of Bi-gestratificeerd door te schakelen tussen epifluorescentie en DIC infrarood optiek 5. </li><li> Als neurobiotin is opgenomen in pipet en het netvlies zal worden verwerkt voor immunohistochemie, dan pipet moet voorzichtig worden teruggetrokken tot minimale verstoring van het membraan te bieden. </li></ol> 5) Analyse van de anatomie van de geregistreerde ganglioncellen Vullen met neurobiotin zorgt voor meer gedetailleerde morfologische analyse van de ganglioncellen volgende opname. Tip: Indien specifieke correlaties tussen een opgenomen ganglion cel en gedetailleerde morfologie gewenst is, kan het best op te nemen en vul slechts een RGC per voorbereiding. <ol><li> Als neurobiotin werd opgenomen in de intracellulaire oplossing dan plaats in het netvlies paraformaldehyde oplossing en vast overnacht bij 4 ° C. </li><li> Spoel in PBS, minimaal 2 uur, ten minste zes veranderingen. Overdracht van het netvlies op een bord met het blokkeren van oplossing. Laat in het blokkeren van oplossing voor 2 uur, kamertemperatuur op shaker. </li><li> Vervang de blokkering oplossing met de Streptavidine oplossing. Incubeer 2 dagen bij 4 ° C op shaker. Spoel het netvlies in PBS, 6 spoelt, 20 min elk. </li><li> Monteer het netvlies met Vectashield in een glasplaatje.Het netvlies moet worden geplaatst met het ganglion cellen omhoog. Voer confocale microscopie (figuur 1C). </li></ol> Representatieve resultaten Als het netvlies is gezond en de dissectie succesvol was, moet de individuele ganglioncellen zichtbaar zijn onder DIC hoge vergroting (Figuur 1A). Ongezonde netvliezen zal hebben grote, gegranuleerd kernen en moeten worden weggegooid. Als de synaptische reactie van een bepaald ganglion cel intact is, dan moet in de cel reageren op licht het ontstaan ​​van of te compenseren met actie potentialen en, in het geval van een intrinsiek-lichtgevoelige ganglion cel (Figuur 1B), een aanhoudende depolarisatie. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Lokalisatie, opnemen en kleuring van een fluorescent gelabelde retinale ganglion cel. (A) GFP positieve RGC zichtbaar onder epifluorescerende verlichting bij 40x vergroting (linker paneel) en onder DIC verlichting (rechter paneel). (B) Synaptic het licht reactie van een M2 intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglion cel opgenomen in whole-cell stroomtang modus van fluorescent gelabelde RGC. (C) M1 intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglion cel was die in het kader epifluorescentie, gericht op whole-cell-opname, gevuld met neurobiotin, en vervolgens verwerkt voor immunohistochemie.

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li>
<li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li>
<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

Deze techniek is toepasbaar op elk retinale ganglion cel opnamen uit een geïsoleerde netvlies. Hoewel in de muis lijn hierboven gebruikte intrinsiek lichtgevoelige, melanopsine expressie RGC zijn gelabeld met EGFP 2, 5, dit protocol is gemakkelijk overdraagbaar naar andere fluorescent gelabelde RGC lijnen of kan worden gegeneraliseerd naar opnemen van willekeurig geselecteerde RGC ook. Deze techniek is bijzonder waardevol omdat de dendritische prieel van elk RGC en haar respectieve inbreng neuronen worden gel...

<table><tbody><tr><td>Ames&amp;rsquo; medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Neurobiotine</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>Elektroden</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Oogheelkundige schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

een geïsoleerde retinale voorbereiding op light response opnemen van genetisch labeled retinale ganglioncellen

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

De eerste stappen in gewervelde visie plaats te vinden wanneer het licht stimuleert de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren van het netvlies 1. Deze informatie wordt vervolgens gescheiden in wat bekend staat als de ON en OFF paden. De fotoreceptoren signaal licht informatie naar de bipolaire cellen (BCS), die depolariseren in reactie op toe (On BCS) of afneemt (Uit BCS) in lichtintensiteit. Deze scheiding van het licht informatie wordt gehandhaafd op het niveau van de retinale ganglioncellen (RGC), die dendrieten stratificatie in ofwel de Off sublamina van de binnenste plexiform laag (IPL), waar ze direct excitatoire input van Off BC&#39;s hebben, of stratificatie in Op de sublamina van het IPL, waar ze direct excitatoire input van On BCS. Deze scheiding van informatie met betrekking tot stijgingen of dalingen in verlichting (de aan-en uitzetten pathways) is geconserveerd en gesignaleerd naar de hersenen in parallel. De RGC is de output cellen van het netvlies, en zijn dus een belangrijke cel te bestuderen om te begrijpen hoe licht informatie wordt gesignaleerd aan visuele kernen in de hersenen. Vooruitgang in de muis genetica afgelopen decennia hebben geleid tot een verscheidenheid van fluorescerende reporter muis lijnen waar specifieke RGC populaties zijn gelabeld met een fluorescerend eiwit, zodat voor de identificatie van RGC subtypes 2 3 4 en specifieke targeting voor elektrofysiologische opname. Hier presenteren we een methode voor het opnemen van lichte reacties van fluorescent gelabelde ganglion cellen in een intact, geïsoleerde netvlies voorbereiding. Deze geïsoleerde netvlies voorbereiding zorgt voor opnamen van RGC, waar de dendritische prieel is intact en de ingangen in de gehele RGC dendritische prieel worden bewaard. Deze methode is van toepassing in een verscheidenheid van ganglion cel subtypes en vatbaar is voor een breed scala van single-cell fysiologische technieken.

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

De eerste stappen van het gezichtsvermogen bij gewervelde dieren vinden plaats wanneer licht de staafjes- en kegeltjefotoreceptoren van het netvlies stimuleert 1. Deze informatie wordt vervolgens ...

Het algemene doel van deze procedure is om lichtopgewekte reacties te registreren van genetisch gelabelde ganglioncellen in de geïsoleerde muisretina. Dit wordt bereikt door eerst de retina uit het oog van de muis te dissekeren. De tweede stap van de procedure is het behandelen van de retina met een enzym om het resterende glasvocht te verwijderen.De derde stap van de procedure is om het netvlies met de zijde van de ganglioncellen naar boven in de registratiekamer te plaatsen, de kamer op de microscopentafel te monteren en de genetisch gelabelde ganglioncellen te identificeren. De laatste stap van de procedure is om een whole-cell registratie van de geïdentificeerde ganglioncel te verkrijgen en lichtgeëvoceerde responsen te registreren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de functionele eigenschappen van een gedefinieerd type ganglioncel in het netvlies van de muis tonen, en de signalen definiëren die deze naar de hersenen overbrengt via single-cell patchclamp-registraties.Hoi, mijn naam is Tiffany Schmidt en ik ben een promovendus neurowetenschappen in het laboratorium van Dr. Paulo Ka Fuji aan de University of Minnesota. Deze techniek maakt het mogelijk om een ged

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Deze video artikel illustreert de set-up, de procedures te cellichamen patchen en hoe u dynamische clamp opnames implementeren van ganglioncellen in zijn geheel-mount muis retinae. Deze techniek maakt het onderzoek de exacte rol prikkelende en remmende synaptische inputs, en hun relatieve omvang en timing neuronale spiking.

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Leer lichtgeëvoceerde responsen opnemen van genetisch gelabelde ganglioncellen in de geïsoleerde muizenretina. Deze methode maakt gedetailleerde elektrofysiologische analyses en morfologische studies van specifieke celtypen mogelijk.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

Meer video's verkennen