Cryopreservatie van Corticale Tissue Blocks voor de generatie van hoogverrijkt Neuronale culturen

Hallo, mijn naam is Alan en ik werk in het Dr. Horney Lu's lab aan de University of California Irvine in het Department of Neurobiology and Behavior. En ik ben Bob. Vandaag zal Dr. Haro je een snel, efficiënt en betrouwbaar protocol laten zien voor de routinematige cryo-conservering van corticale weefselblokken voor de daaropvolgende degeneratie van hoogwaardige primaire neuronale culturen.

Dus laten we beginnen. Gereinigd en gehakt weefsel wordt geladen in cryo-buisjes die 10% TMSO-bevriezingsmedium bevatten.

Cryo-buisjes worden geladen in een vriescontainer en gedurende minimaal vier uur op minus 80 graden Celsius geplaatst. Ingevroren cryo-buisjes worden vervolgens in vloeibare stikstof geplaatst voor langdurige opslag. Voor het kweken wordt een AC cryo-buisje gesmolten in een warm waterbad en gespoeld met warm HBSS om de resterende DMSO te verwijderen.

Frisse HBSS wordt toegevoegd samen met tryin d ns voor dissociatie, waarna DMM met 10% EBS wordt toegevoegd. Om de dissociatieve enzymatische activiteit te stoppen, worden de cellen naar beneden gesponnen en het pellet opnieuw gesuspendeerd in fris DMM plus 10% EBS en op voorgecoate polylysine schotels geplaatst. Na 24 uur is DMM veranderd in een gesupplementeerd neuro basaal medium en gedurende 10 dagen gekweekt.

Dit protocol gebruikt een stalen scheermes voor het hakken van corticaal weefsel voor gebruik. Het mes moet worden gesteriliseerd in 70% ethanol gedurende minimaal twee uur. Een x Hank's buffered salt solution HBSS wordt gemaakt door een 10 x stockoplossing te verdunnen in gesteriliseerd water, de een X-H-B-S-S wordt vervolgens op ijs of op vier graden Celsius gehouden tot de weefselverwerking.

Dimethylsulfoxide of DMSO wordt gebruikt als cryo-bescherming in het vriesmedium. Dit protocol gebruikt een 10% volume en volumeverdunning van DMSO in een X-H-B-S-S-D-M-S-O die volledig moet worden gemengd voordat het op vier graden Celsius wordt opgeslagen. Nalgene en vriescontainer wordt gebruikt om de snelheid van bevriezing voor de monsters te regelen.

De vriescontainer wordt geladen met 2,5 milliliter cryo-buisjes die vooraf zijn gelabeld. Het is ook een goed idee om de vriescontainers zelf te labelen als je er meer dan één hebt en de bijbehorende container op de label te noteren. De eerder gekoelde 10% DMSO, vriesmedium, evenals de vriescontainer worden in een steriele biologische veiligheidskast gebracht.

Hier wordt een milliliter vriesmedium langzaam toegevoegd aan elk van de cryo-buisjes Na het controleren of de doppen goed vastzitten, plaats de vriescontainer met de buisjes op vier graden Celsius gedurende minimaal twee uur net voor de weefselverwerking. Het eerder gesteriliseerde scheermes moet grondig worden gespoeld. Drie, drie minuut wasbeurten.

Gebruik van gesteriliseerde water zou voldoende moeten zijn om eventueel overgebleven ethanol te verwijderen. Deze wasprocedure moet snel zijn omdat het mes vatbaar is voor oxidatie door langdurige onderdompeling en steriele water. Voor het reinigen moet weefsel op een ijspakketje worden geplaatst.

Spoel lichtjes met koud een X-H-B-S-S om eventueel drijvend puin te verwijderen. Gesteriliseerde naalden worden gebruikt om de weefselstukken te reinigen van eventuele overgebleven membranen en bloedvaten. Er moet voorzichtig worden omgegaan met de structurele integriteit van het weefsel tijdens het schoonmaken.

Aangezien dit de efficiëntie van het hakken zal verhogen, zal schoon weefsel visueel anders zijn dan rauw weefsel en moet het grootste deel van de membranen of bloedvaten zijn verwijderd. Zodra een weefsel is schoongemaakt en gespoeld, kan het hakken beginnen. Het is belangrijk om schone sneden van het weefsel te maken en blokken van ongeveer één millimeter kubiek te creëren.

Blokken die te groot zijn, leveren een lagere celopbrengst op bij het ontdooien. De kleinere blokken moeten echter ook worden vermeden omdat oververwerking kan optreden. Gehakt weefsel kan worden verzameld met behulp van een automatische pipet en wat koel een X-H-B-S-S.

Zorg ervoor dat je de schotel met HBSS spoelt om al het verzamelde weefsel te recupereren. Het weefsel wordt vervolgens toegevoegd aan een groot volume van een X-H-B-S-S en toegelaten om naar de bodem te vallen, waardoor een losjes verpakte pellet ontstaat. Dit reinigt eventueel overgebleven puin dat aanwezig kan zijn terwijl het weefsel zich in de HBSS nestelt. Haal het eerder gekoelde vriescontainer en cryo-buisjes op voordat het weefsel wordt toegewezen.

Zorg ervoor dat je alle doppen verwijdert om het proces van het vullen van weefsel te versnellen. De blootstelling aan DMSO bij kamertemperatuur moet worden beperkt tot maximaal 10 minuten. Het is een goed idee om met één vriescontainer tegelijk te werken totdat al het weefsel is gebruikt.

Begin met het aspireren van de supernaat van een losse weefselpellet zo dicht mogelijk bij de pellet zonder deze te verstoren. Pas vervolgens een 200 microliter brede orificial tip toe op een pipet. Gebruik geen kleinere tipopening, omdat dit de structuur van de blokken die naar de bodem van de weefselblokpellet gaan, zal aantasten.

Verzamel langzaam 200 microliter weefsel. Voeg dit weefsel toe aan een cryo-buisje en ga verder tot alle buisjes zijn gevuld. Er kan een regel van 10 minuten nodig zijn.

Plaats de vriescontainer snel in cryo-buisjes in een vriezer van negatief 80 graden Celsius gedurende minimaal vier uur of overnacht als de tijd beperkt is. Nadat voldoende tijd is verstreken, haalt u de vriescontainer uit de vriezer en kent u de cryo-buisjes zo snel mogelijk toe aan een cryobox. Plaats de cryobox in een vloeibare stikstofbox voor langdurige opslag.

Haal een cryo-buis zo snel mogelijk uit de vloeibare stikstof, waardoor de blootstelling aan de cryoboxen aan kamertemperatuur beperkt blijft. Smelt het monster snel door onderdompeling in een waterbad van 37 graden Celsius. Houd altijd de dop boven het water. Controleer regelmatig en blijf ontdoo