Name: Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Leer micro-injectie en fluorescentie-in-situ-hybridisatie om mRNA-nucleaire exportkinetiek in zoogdiercellen te meten. Deze methode kwantificeert precies het transport van mRNA van kern naar cytoplasma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag E. Gomes bedanken voor nuttige adviezen en A. Wilde voor het toestaan ​​van ons om diverse apparatuur te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​aan AFP van het Canadese Institute for Health Research (FRN 102.725).

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
<li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li>
<li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li>
<li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li>
<li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li>
<li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li>
<li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+alignment+of+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li>
<li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li>
<li>Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li>
<li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cotranscriptionality%22%3A+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li>
<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
</ol>

Micro-injectie is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om een ​​aantal verschillende cellulaire processen te bestuderen. In tegenstelling tot conventionele celtransfectie, micro-injectie kan de onderzoeker om effectief nucleïnezuren te introduceren in de cellulaire kernen binnen een zeer korte periode aan. Als gevolg daarvan kan men uitvoeren kinetische analyses zoals het bepalen van de tarieven van mRNA export, mRNA lokalisatie en de eiwitsynthese. Aangezien de looptijd van het experiment is relatief kort, kan men blootstellen cellen toxische stoffen binnen korte tijd overspanning zonder dat pleiotrope effecten. Bovendien kan remmende of stimulerende verbindingen zoals dominant negatief eiwitten, worden co-geïnjecteerd met de nucleïnezuren. Tot slot, micro-injecties voorkomen dat de eis voor transfectiereagentia, die vaak giftig voor cellen en kunnen verstoren verschillende cellulaire functies. mRNA vs plasmide DNA injecties De keuze van de nucleïnezuur te injecteren zal afhangen van een aantal overwegingen. Naar aanleiding van plasmide DNA injectie, RNA polymerase II niet alleen synthetiseert mRNA, maar ook rekruten eiwit factoren om de ontluikende transcript 12,13. Aangezien deze factoren bepalen evenementen zoals mRNA verwerking, de nucleaire export-en cytoplasmatische lokalisatie, kan plasmide DNA injecties worden gebruikt om te beoordelen hoe transcriptie is gekoppeld aan downstream-processen. Hoewel de transcriptie kan worden gekoppeld aan de nucleaire export 14, hebben we gemerkt dat ingespoten mRNA is iets sneller dan in vivo getranscribeerd mRNA 6 geëxporteerd. De redenen hiervoor zijn niet duidelijk op dit moment, maar dit resultaat kan erop wijzen dat als nieuw gesynthetiseerde mRNA blijkt uit RNA polymerase II, kan het vast in complexen die vertragen de nucleaire export. Er zijn een aantal voordelen met mRNA injecties. Ten eerste heeft de onderzoeker niet te RNA polymerase-remmers gebruiken, dat kan invloed hebben op hoe de cellen van het totale metabolisme van RNA te reguleren. Ten tweede kan het RNA worden gewijzigd in vitro voorafgaand aan de injectie. Zo kan mRNA&#39;s worden gesynthetiseerd met verschillende 5 &#39;cap-analogen of poly (A) staart lengte om te kunnen beoordelen hoe deze functies nucleaire export 6 beïnvloeden. Ten derde kan het exacte bedrag van RNA die wordt ingespoten ruwweg worden geschat. Naar aanleiding van het protocol hierboven omschreven, we schatten dat ongeveer 20.000 tot 50.000 moleculen worden geïnjecteerd in elke kernen, dat is relatief klein in vergelijking met het totaal aantal transcripten in een typische zoogdiercellen (400.000 tot 850.000 moleculen) 15. Het grote nadeel van mRNA injecties is dat tijdens micro-injectie, een aantal lekken van injectievloeistof in het cytoplasma onvermijdelijk is. Sinds mRNA direct geïnjecteerd in het cytoplasma is stabiel over lange periodes (A. Palazzo, ongepubliceerde waarnemingen), moet extra zorg worden genomen om te selecteren welke cellen worden gekwantificeerd. Over het algemeen analyseren we cellen die&gt; 90% van de injectievloeistof ontvangen in de kern, zoals beoordeeld door de verdeling van OG-dextran.

<table><tbody><tr><td>Injectiebuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl en 10 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>Oregon Green 488-70kD dextraan</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>Een voorraadoplossing van 10mg/ml in injectiebuffer kan gedurende lange perioden worden bewaard bij -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Borosilicaat capillaire buizen</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Gel-laadpipetpunten voor het vullen van injectienaalden</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Injectiespuit</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>PBS-buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7,4</td></tr><tr><td>SSC-buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM natriumcitraat, pH 7,4</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>Voorraadoplossing van 37% paraformaldehyde is verdund in PBS</td></tr><tr><td>0,1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>Voorraadoplossing van 10% Triton X-100 is verdund in PBS</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Dextraansulfaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Vanadylribosidecomplex (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filterpapier</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Trillingsvrije tafel</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanitine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipet-trekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vacuümvet</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA-polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)-polymerase</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatiebuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100mg/ml dextraansulfaat, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM natriumcitraat, 0,5mg/ml &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA, 60% formamide</td></tr></tbody></table>

analyse van de mrna nuclear export kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryoten, is messenger RNA (mRNA) getranscribeerd in de kern en moet worden geëxporteerd naar het cytoplasma naar de vertaling toegang machines. Hoewel de nucleaire export van mRNA is uitgebreid bestudeerd in Xenopus oöcyten 1 en genetisch handelbaar organismen zoals gist 2 en de Drosophila afgeleid S2 cellijn 3, hadden weinig studies zijn uitgevoerd in zoogdiercellen. Verder is de kinetiek van mRNA export in somatische cellen van zoogdieren kan alleen worden afgeleid indirect 4,5. Met het oog op de nucleaire export kinetiek van mRNA in zoogdieren weefselkweek cellen te meten, hebben we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescente in situ hybridisatie (FISH) in dienst heeft. Deze testen zijn gebruikt om aan te tonen dat in zoogdiercellen, het merendeel van de mRNA&#39;s worden uitgevoerd in een splicing afhankelijke manier 6,7, of op een wijze die specifieke RNA-sequenties, zoals de signaalsequentie coderende gebied (SSCR) 6 vereist. In deze test worden cellen gemicroinjecteerd met ofwel in vitro gesynthetiseerd mRNA of plasmide DNA dat het gen van belang. De gemicroinjecteerd cellen worden geïncubeerd gedurende verschillende tijdstippen dan de vaste en de sub-cellulaire lokalisatie van RNA wordt beoordeeld op basis FISH. In tegenstelling tot transfectie, waar transcriptie enkele uren ontstaat na de toevoeging van nucleïnezuren, micro-injectie van DNA of mRNA zorgt voor een snelle expressie en zorgt voor het genereren van nauwkeurige kinetische gegevens.

Hier beschrijven we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescerende werken<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie om nauwkeurig de nucleaire export kinetiek van mRNA te meten in somatische cellen van zoogdieren.

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

Bij eukaryoten wordt boodschapper-RNA (mRNA) getranscribeerd in de kern en moet het naar het cytoplasma worden geëxporteerd om toegang te krijgen tot het translatieapparaat. Hoewel ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de kinetiek van de nucleaire export van mRNA in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door eerst mRNA of DNA in de kernen van weefselkweekcellen van zoogdieren te micro-injecteren. Na de micro-injectie worden de monsters gefixeerd na verschillende incubatieperioden.Het mRNA wordt vervolgens gekleurd via fluorescentie in situ hybridisatie of FISH. De laatste stap van de procedure is het afbeelden van de cellen en het kwantificeren van de hoeveelheid fluorescentie in het cytoplasma en de nucleus. Uiteindelijk kan de snelheid van mRNA-export worden gemeten door middel van een combinatie van microinjectie en fluorescentiemicroscopie.Hoi, ik ben SRG AV van het laboratorium van Alex Palazzo van de afdeling Biochemie aan de Universiteit van Toronto. Ik ben Stefan Toski, ook van het Palazzo Lab. Ik ben Amy van het Palazzo lab en ik ben Khi Maha David van het Palazzo lab.Vandaag tonen we u een procedure voor het introduceren van mRNA in de kernen van mammale weefselkulturcellen door middel van micro-injectie. We zullen ook demonstreren hoe het mRNA kan worden gekleurd met fluorescentie in situ hybridisatie. We gebruiken deze procedures in ons laboratorium om de kinetiek van de nucleaire export van mRNA in mammale cellen te bestuderen.Laten we beginnen. Dilueer vóór de micro-injectie vooraf geprepareerd plasma-DNA tot een concentratie tussen de 50 en 200 µg/mL in injectiebuffer. Voeg vervolgens Oregon Green 488 (OG) geconjugeerd aan 70 kDa dextran toe aan het mengsel om de geïnjecteerde cellen te kunnen identificeren.Het OG-geconjugeerde dextraan helpt bepalen hoeveel van de vloeistof in de nucleus is geïnjecteerd en hoeveel er is gelekt naar het cytoplasma. Centrifugeer de monsters bij 13.000 G en vier graden Celsius gedurende ten minste 20 minuten om eventuele vaste bestanddelen die de naaldpunt kunnen blokkeren te pelletteren. Kies de zoogdiercellijn voor micro-injectie op basis van de criteria die in het geschreven protocol worden beschreven.Zeven cellen worden gebruikt voor dit demonstratie-zaadje. De cellen worden op zuurgewassen dekglasjes in Petri-schalen van 30 millimeter geplaatst, ten minste 24 uur vóór de microinjectie. Idealiter moet de cellaag op het moment van injectie ongeveer 70 tot 90% confluent zijn om een eenvoudige identificatie van de geïnjecteerde cellen mogelijk te maken; de cellaag wordt vóór de injectie gewond met behulp van een plastic pipetpunt van 200 microliter.Ets een kruisvormige wond in het dekglas en laat de cellen minimaal 15 minuten herstellen in de weefselkweekincubator vóór de injectie. Gebruik voor micro-injectie een omgekeerde microscoop die op een luchttafel is geïsoleerd om trillingen te minimaliseren die het micro-injectieproces kunnen verstoren. Verwijder met een einor gel-laadpunt ongeveer één microliter van de bovenkant van het centrifugemonster om te voorkomen dat het pellet wordt verstoord.Plaats de punt van de pipet in het uiteinde van een geprefabriceerde micro-injectienaald en breng de vloeistof over. De vloeistof zal door capillaire werking in de naaldpunt worden getrokken. Binnen vijf tot 30 seconden moet een meniscus nabij de punt zichtbaar worden.Plaats de met vloeistof gevulde naald in de houder en klem deze vast aan de micromanipulator. Visualiseer de naald onder een hoek van 45 graden met behulp van het 10 x objectief en positioneer deze in het midden van het gezichtsveld nabij het brandvlak. De houder is via een slang verbonden met een glazen spuit, die wordt gebruikt om de druk te genereren die nodig is om de vloeistof uit de naaldpunt te stoten, waarbij de grove knoppen van de micromanipulator worden gebruikt.Om een constante druk te handhaven, wordt de spuit op een buisklem gemonteerd. Gebruik twee rubberen stoppers en twee metalen klemmen om de naald een paar millimeter op te tillen, zodat deze in latere stappen niet beschadigd raakt, en schuif vervolgens de microscoopsteun terug. Verhoog de druk door de zuiger van de spuit in te drukken.0,5 tot twee kubieke centimeter. Plaats een petrischaal met een dekglas met een gewonde monolaag. Trek de microscoop op de objecttafel naar achteren.Beweeg de pilaar naar voren naar een rechtopstaande positie, zodat de condensor is uitgelijnd waardoor de naald de vloeistof kan binnendringen. Dit moet voorzichtig gebeuren om te voorkomen dat de naald breekt op het dekglas. Identificeer met het 10 x objectief het centrum van de kruiswond en positioneer de naald boven de te injecteren cellen.Verhoog de vergroting door over te schakelen naar het 40 x objectief. Breng de naald vervolgens naar beneden en centreer deze met behulp van de fijninstelknoppen op de joystick. Begin de injectie in één hoek van het wondkruis door de naald te laten zakken tot deze contact maakt met de nucleus.Zodra een cel is geïnjecteerd, vertoont deze een opvallende verandering in fasehelderheid. Ga verder langs één rand van het wondkruis. Voor een gemakkelijke identificatie van geïnjecteerde cellen tijdens de visualisatie is het essentieel dat de injectiedruk correct wordt ingesteld voor elke naald.De druk moet hoog genoeg zijn om het plasmamembraan en het kernmembraan te doorboren, maar niet zo hoog dat de cellen afsterven. Micro-injecteer cellen langs de wondrand gedurende een vaste periode. Met oefening kunnen er tijdens dit interval honderden cellen worden geïnjecteerd.Indien er plasmisch DNA wordt geïnjecteerd, incubeer de micro-geïnjecteerde cellen dan gedurende 20 minuten bij 37 °C in een weefselkweekincubator vóór de fixatie, en beëindig vervolgens de transcriptie. Behandel de cellen hiervoor met 1 µg/mL α-amanitine opgelost in groeimedium. Deze concentratie remt de transcriptie vanuit de micro-geïnjecteerde plasmiden effectief.Plaats de cellen terug in de incubator en laat de cellen het nieuw gesynthetiseerde mRNA exporteren. Eén enkele naald kan opnieuw worden gebruikt om meerdere dekglasjes te injecteren. De naald moet echter worden vervangen wanneer het type DNA of RNA dat wordt gemicro-injecteerd is gewijzigd.Bovendien moet de naald, zodra deze uit de wand is verwijderd, worden weggegooid om een nauwkeurige meting van de mRNA-nucleaire exportkinetiek te verkrijgen. Aparte monsters moeten worden gefixeerd op nul minuten, 15 minuten, 30 minuten, 60 minuten en 120 minuten. Na de behandeling met alpha manine op het juiste tijdstip, wordt het groeimedium weggezogen en worden de cellen twee keer gewassen in twee milliliters PBS-oplossing.Het is belangrijk om de dekglasjes vochtig te houden door de tijd dat ze niet in vloeistof zijn ondergedompeld te minimaliseren. Fixeer de cellen door twee milliliters 4% Aldehyde in PBS toe te voegen en incubeer de cellen gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het nog twee keer wassen van de gefixeerde monsters, maak de cellen permeabel met twee milliliters 0,1% Triton X 100 in PBS en incubeer de cellen opnieuw gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur.Was de monsters ten slotte nog twee keer om ze voor te bereiden op hybridisatie. Was de cellen twee keer met een wasbuffer van een 1X SSC-oplossing die 25 tot 60% formamide bevat. Bereid vervolgens de kleurkamer voor op hybridisatie door de bodem van een Petri-schaal van 150 millimeter te bedekken met water en er een stuk parafilm bovenop te laten drijven.Verwijder het water door de schaal om te keren, zodat de paraform aan de bodem van de schaal hecht. Verwijder handmatig eventuele luchtbellen van elk dekglas dat gekleurd moet worden. Pipetteer druppels van 100 µL van de hybridisatielosie op de paraform.Let op dat de hoeveelheid formage met behulp van een pincet moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke gebruikte vissoort. Verwijder een dekglas met de gefixeerde cellen uit de Petri-schaal van 30 millimeter. Droog de achterzijde van het dekglas met Whatman-filterpapier en absorbeer overtollige buffer van de voorzijde zonder de cellen uit te drogen.Plaats vervolgens het dekglas met de zijde die naar beneden wijst op de visoplossing. Herhaal dit proces voor elk dekglas. Nadat het deksel van de kleurkamers is teruggeplaatst, worden de monsters vijf tot 18 uur geïncubeerd bij 37 °C.Bereid verschillende waskamers op dezelfde manier voor als de kleurkamer werd voorbereid. Pipetteer voor elk dekglas één milliliter wasbuffer op het parafilm van de waskamer. Verwijder na incubatie de dekglazen uit de kleurkamer door één milliliter wasbuffer te pipetteren. Naast het dekglas moet de vloeistof door capillaire werking onder elk monster worden getrokken.Verwijder vervolgens de dekglasjes met een pincet en plaats elk dekglasje op een druppel wasbuffer die vijf minuten op kamertemperatuur is geïncubeerd. Was elk dekglasje nog twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten per dekglasje. Pipetteer 10 tot 30 µL monteermiddel met DAPI op een eerder gewassen objectglas. Elk objectglas kan twee dekglasjes accommoderen met behulp van een pincet en Watman-filterpapier.Droog de achterkant van de dekglasjes en absorbeer overtollige vloeistof van de voorkant van het dekglasje zonder de monsters uit te drogen. Plaats elk dekglasje met de voorkant naar beneden op een druppel monteervloeistof. Gemonteerde monsters kunnen worden bewaard bij vier graden Celsius.Hier zijn de effecten van alfa-mantine op de transcriptie van geïnjecteerd plasmide-DNA getoond in NIH 3T3-fibroblastcellen, die waren voorbehandeld met verschillende concentraties alfa-mantine. Deze werden geïnjecteerd met TFL s delta i plasmide-DNA en OG-geconjugeerd 70 kDa dextraan. Elke rij komt overeen met één beeldveld dat is gefotografeerd voor OG 70 kilodalton dextraan en T uts delta I mRNA.Het is duidelijk dat hoge concentraties van het geneesmiddel de productie van het T UTS delta I-transcript volledig remden, terwijl dit bij lagere concentraties niet werd waargenomen. Hier wordt een tijdlijn van de kosten van nucleair mRNA-transport getoond. Zeven cellen werden geïnjecteerd met T UTS delta i plasma-DNA en OG-geconjugeerd 70 kilodalton dextran.30 minuten na de injectie van de cellen werden deze behandeld met alfa-mantine en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 0 minuten, 60 minuten en 120 minuten. De cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met een probe tegen T UTS delta I mRNA en met antilichamen tegen de ER-marker trap alfa; elke rij komt overeen met een enkel cellenveld.Raadpleeg de online tekst hier voor informatie over het kwantificeren van mRNA-export. Het tijdstip van 120 minuten is vergroot. Om de colocalisatie van TFS delta I mRNA in het ER aan te tonen, wordt een overlay getoond van het T UTS delta I mRNA in het groen en trap alfa in het rood. Informatie over het co-kleuren van mRNA met eiwitten is te vinden in de online tekst.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de nucleaire exportkinetiek van mRNA kan worden gemeten via micro-injectie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een succesvolle micro-injectie een zorgvuldige voorbereiding vereist. Cruciale stappen zoals de monsterbereiding van DNA en RNA, het trekken van naalden, het uitlijnen van de optische apparatuur en het oplossen van problemen bij micro-injectie worden beschreven in ons geschreven protocol.Bij het afbeelden en analyseren van micro-geïnjecteerd mRNA is het belangrijk dat de kwantificering beperkt blijft tot cellen waarin meer dan 90% van het geïnjecteerde vloeistof in de nucleus is terechtgekomen. Een succesvolle nucleaire injectie kan worden beoordeeld door de distributie van organ green dextran in de nucleus en het cytoplasma te visualiseren. Raadpleeg ons online protocol voor meer informatie over het ontwerpen van vis-probes en het gebruik van beeldanalyse-software voor het analyseren van de distributie van mRNA in het cytoplasma en de nucleus.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

analysis-mrna-nuclear-export-kinetics-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Directe intranucleaire injectie van cDNA is een effectieve techniek voor transfectie post-mitotische cellen. Deze methode biedt een hoge mate van heterologe eiwitexpressie van een of meerdere cDNA constructen en maakt het mogelijk eiwit functie die moet worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving met een verscheidenheid van enkele cel assays.

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Een protocol voor de voorbereiding van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten wordt beschreven. Dit protocol is waardevol voor testen die het gebruik van kleine populaties van cellen, zoals cellen behandeld met medicijnen of RNAi vereisen. De methode moet voor diverse genexpressie assays en andere celtypes, die onder andere cellen.

Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines

Vanwege hun grote omvang en relatief eenvoudige organisatie zijn drosophila-verpleegkundige cellen bij uitstek geschikt voor live celbeeldvormingsstudies. Deze video beschrijft een micro-injectiemethode voor de levering van exogene verbindingen in de cellen, en het aanbevolen protocol demonstreert de procedure met fluorescerende oligonucleotide-sondes genaamd moleculaire bakens (MB's) die worden gebruikt om endogene mRNA-transcripties te visualiseren.

Micro-injection van Drosophila Verpleegkundige Cellen: Een Methode van Intracellulaire Levering

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door...

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna's gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.

Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

Leer micro-injectie en fluorescentie-in-situ-hybridisatie om mRNA-nucleaire exportkinetiek in zoogdiercellen te meten. Deze methode kwantificeert precies het transport van mRNA van kern naar cytoplasma.

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

Meer video's verkennen