Visualization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles Using Transmission Electron Microscopy
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:01 min • August 29th, 2025
Place a polyvinyl formal resin-coated transmission electron microscopy or TEM grid on a clean plastic film.
Add a suspension of concentrated and purified extracellular vesicles or EVs, nanosized, membrane-bound particles, onto the grid.
These EVs are secreted by cyanobacteria and carry macromolecules within their membranes.
Incubate the grid to allow the EVs to adsorb onto its resin-coated surface.
Touch the grid edge with a clean filter paper to absorb the excess suspension.
Float the grid on uranyl acetate to stain the adhered vesicles.
Uranyl acetate surrounds the vesicles, creating a dark outline that enhances contrast during imaging.
Remove the grid and use filter paper to absorb the excess stain.
Wash the grid with ultrapure water to remove any residual stain. Repeat the wash and then allow it to air dry.
Finally, visualize the EVs using TEM to assess their morphology, size, and purity.
Carefully apply five microliters of vesicle and let it sit for five minutes. Remove the sample by touching the edge of a grid to a piece of clean filter paper.
Pipette out 20 to 50 microliters of 2%uranyl acetate onto a flat surface covered by plastic film. Then place the grid floating on top of it for two minutes. Remove uranyl acetate using filter paper and float briefly on a drop of ultrapure water to wash.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het visualiseren van extracellulaire vesikels (EV's) uitgescheiden door cyanobacteriën met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Het proces omvat het voorbereiden van een TEM-rooster, het aanbrengen van een suspensie van EV's en het kleuren ervan om het beeldcontrast te verbeteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Extracellulaire vesicles (EV's) zijn nanogestructureerde, membraangebonden partikels.
- Ze transporteren macromoleculen en worden uitgescheiden door diverse organismen, waaronder cyanobacteriën.
- Het visualiseren van EV's is cruciaal voor het begrijpen van hun rol in cellulaire communicatie.
- Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een krachtig instrument voor beeldvorming met een hoge resolutie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het visualiseren van EV's met behulp van TEM.
- Het beoordelen van de morfologie, grootte en zuiverheid van EV's.
- Het verbeteren van het contrast van EV's voor betere beelgetResultaten.
Gebruikte Methoden
- Voorbereiding van een met polyvinylformaalhars gecoat TEM-rooster.
- Aanbrengen van een geconcentreerde suspensie van EV's op het rooster.
- Kleuring van geadhereerde blaasjes met uranylacetaat.
- Visualisatie van EV's met TEM na droog- en wasstappen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle adsorptie van EV's op het TEM-rooster.
- Verhoogd contrast van EV's door kleuring met uranylacetaat.
- Duidelijke visualisatie van de morfologie en grootte van EV's met behulp van TEM.
- De methode bleek effectief voor het beoordelen van de zuiverheid van EV's.
Conclusies
- De ontwikkelde methode maakt een effectieve visualisatie van EV's mogelijk.
- Kleuring verbetert de beeldkwaliteit aanzienlijk.
- Deze techniek kan worden toegepast om EV's uit verschillende bronnen te bestuderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Visualisatie van extracellulaire blaasjes van cyanobacteriën via TEM maakt structurele karakterisering mogelijk van membraangebonden nanodeeltjes die relevant zijn voor microbiële communicatie en de ontdekking van biomarkers. Deze methode ondersteunt vroege targetvalidatie door hoogresolutie morfologische gegevens te leveren voor het testen van functionele hypothesen. Het draagt bij aan de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen waarin blaasjes-gemedieerde pathways worden onderzocht.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar vesikel-geassocieerde macromoleculen mogelijk voor doelwitidentificatie in prokaryotische systemen.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare monstervoorbereiding voor consistente beeldvorming over verschillende ontdekkingscampagnes.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de standaardisatie van vesikelisolaten voor gebruik in screeningsassays die cargo-gemedieerde activiteit evalueren.
- Operationele waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van analytische platforms op basis van vesikels die morfologische kwaliteitscontrole vereisen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt structurele vergelijking van cyanobacteriële vesikels met zoogdier-EV's mogelijk om de mechanistische conservering tussen verschillende rijken te beoordelen.
- Operationele waarde: Biedt een overdraagbare workflow voor de zuivering en beeldvorming van vesikels in studies met meerdere organismen.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot assay-gereedheid, en ondersteunt de structurele bevestiging van bioactieve nanodeeltjes voorafgaand aan functionele screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten met betrekking tot de rol van blaasjes in microbiële signaleringspaden.
- Screening: Maakt de productie van gestandaardiseerde blaasjespreparaten mogelijk voor consistentie van de assay-input.
- Analytics: Levert kwantitatieve morfometrische gegevens (grootte, vorm, zuiverheid) voor comparatieve analyse.
- Translational Research: Maakt structurele uitlijningsstudies mogelijk tussen prokaryotische en eukaryotische blaasjessystemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbaar imagingprotocol dat toepasbaar is in verschillende workflows voor het isoleren van blaasjes.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door direct structureel bewijs van de integriteit van blaasjes.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde negatieve kleuring en gridpreparatie.
- Strategische waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in de vroege ontdekkingsfase, waardoor de kwaliteit van go/no-go-beslissingen verbetert.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van interventies gericht op blaasjes op basis van structurele validatie.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in het hanteren van nanodeeltjes en het prepareren van TEM-roosters.
- Toegang tot transmissie-elektronenmicroscopie en mogelijkheden voor kleuring met uranylacetaat.
- Standaardisatie van de vesikelconcentratie en incubatietijden tussen verschillende gebruikers.
- Overwegingen voor aanpassing bij variërende vesikelgroottes en oppervlakte-eigenschappen.
- Beperkingen bij het resolveren van de interne ultrastructuur van vesikels zonder geavanceerde kleuring of cryo-EM.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026