Aptamer-Assisted Acoustophoresis for Microfluidic Separation of Gram-Negative Bacteria
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:35 min • August 29th, 2025
Take a microfluidic acoustophoretic chip, a sound-wave-based particle separator with two inlets and two outlets connected to plastic tubes.
Inject Gram-negative and Gram-positive bacteria, along with aptamer-coated microbeads, through the sample inlet.
Inject a buffer through the buffer inlet at high pressure to maintain side-by-side flow.
Inside the microchannel, the lipopolysaccharides on the Gram-negative bacterial membrane bind to the short single-stranded DNA aptamers on the microbeads.
Gram-positive bacteria, which lack lipopolysaccharides, do not bind.
As the flow continues, activate the piezoelectric transducer to generate acoustic waves that create pressure nodes across the channel.
These waves push large microbeads bound to Gram-negative bacteria toward the center, where they are collected at the target outlet.
Unbound small-sized Gram-positive bacteria remain unaffected and flow sideways to the waste outlet.
Microscopic imaging shows an increased signal from Gram-negative bacteria-bound beads at the target outlet, confirming their selective separation by aptamer-assisted acoustophoresis.
Connect PEEK tubes to the two inlets for injecting two samples and buffer, and the two outlets for collecting and discharging waste.
Using a 10 milliliter syringe, fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble free demineralized water. Prepare a precision pressure controller with two or more output channels to control the fluid flow. After preparing the device, inject the sample and buffer by applying a pressure of two kilopascals to the sample inlet and four kilopascals to the buffer inlet using the precision pressure control device.
Using a microscope, focus on a bead and move it to the center of the microfluidic channel using the PZT. Generate a resonance frequency of 3.66 megahertz using a single channel function generator and amplify a typical signal by 16 decibels using a power amplifier. Observe the separation and enrichment processes on the acoustofluidic chip with a fluorescence microscope and a high speed camera operating at 1, 200 frames per second.
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van een microfluïdische acoustoforetische chip voor de selectieve scheiding van Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën. De methode maakt gebruik van akoestische golven om de binding van specifieke bacteriën aan met aptameren gecoate microbeads te versterken, wat een effectieve scheiding en analyse mogelijk maakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microfluidica
- Acoustoforese
- Biotechnologie
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten maken een nauwkeurige manipulatie van vloeistoffen op microschaal mogelijk.
- Acoustophorese maakt gebruik van geluidsgolven om deeltjes binnen een vloeistof te verplaatsen.
- Aptameren zijn korte, enkelstrengse DNA- of RNA-moleculen die kunnen binden aan specifieke doelen.
- Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën hebben verschillende membraansamenstellingen die hun interacties met aptameren beïnvloeden.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor de selectieve scheiding van Gram-negatieve bacteriën van Gram-positieve bacteriën.
- Het aantonen van de effectiviteit van aptameer-ondersteunde acoustoporese in een microfluïdische setting.
- Het bieden van een gedetailleerd protocol voor de implementatie van deze scheidingstechniek.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een microfluïdische acoustoforetische chip met specifieke in- en uitlaten.
- Injectie van bacteriële monsters en buffer onder gecontroleerde drukcondities.
- Activering van een piëzo-elektrische transducer om akoestische golven te genereren.
- Microscopische beeldvorming om het scheidingsproces te observeren en de resultaten te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle binding van Gram-negatieve bacteriën aan met aptameren gecoate microbeads.
- Effectieve scheiding van Gram-positieve bacteriën, die niet aan de beads bonden.
- Verhoogde signaaldetectie van Gram-negatieve bacteriën bij de doeluitlaat.
- Bevestiging van selectieve scheiding via fluorescentiemicroscopie.
Conclusies
- De methode demonstreert een innovatieve benadering voor bacteriële scheiding met behulp van microfluidica.
- Aptameer-ondersteunde acoustophoresis is effectief voor het targeten van specifieke bacteriële typen.
- Deze techniek heeft potentiële toepassingen in de diagnostiek en het microbiologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt de selectieve isolatie van Gram-negatieve pathogenen uit complexe microbiële mengsels mogelijk, wat vroege targetvalidatie bij de ontdekking van antimicrobiële middelen ondersteunt. Door aptameerspecificiteit te combineren met acoustoforetische verrijking, wordt de achtergrondruis in downstream assays verminderd, wat het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van hits verhoogt. Deze aanpak pakt een cruciaal kantelpunt in het ontdekkingsproces aan, waarbij fenotypische screening pathogeenspecifieke readouts vereist om de risico's bij mechanistische follow-up te beperken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen specifiek voor Gram-negatieve bacteriën te onderzoeken door LPS-expresserende pathogenen uit gemengde culturen te isoleren.
- Operationele waarde: Vermindert de complexiteit van monsters voorafgaand aan target engagement-assays, waardoor fout-positieven door Gram-positieve contaminanten worden geminimaliseerd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de portfolio-triage door verrijkte pathogenenfracties te leveren voor screening van het werkingsmechanisme.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde, aptameer-verrijkte bacteriële inputs voor voor reproduceerbare compound-screening tegen virulentiedoelen.
- Operationele waarde: Genereert kwantitatieve fluorescentie- of imaging-readouts bij de doeluitlaat, wat assay-standaardisatie over verschillende locaties mogelijk maakt.
- Hergebruik van het platform: De microfluïdische acoustoforetische chip kan worden aangepast aan andere aptameer-doelwitparen voor gemultiplexte pathogeenprofilering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door Gram-negatieve pathogenen in een bijna-natuurlijke staat te bewaren voor de analyse van virulentiefactoren.
- Operationele waarde: Zorgt voor continuïteit van ontdekking naar preklinische modellen door consistente pathogenen-inputs te leveren voor werkzaamheidstesten.
- Risicobeperking: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door target-engagement te bevestigen in gezuiverde pathogenenpopulaties.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van de initiële screening van pathogenen tot de optimalisatie van leadverbindingen, specifiek wanneer selectiviteit voor Gram-negatieve bacteriën vereist is voor het verminderen van risico's bij het target.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door LPS-positieve Gram-negatieve bacteriën te isoleren voor padspecifieke analyse.
- Screening: Levert assay-klare, verrijkte monsters met een minimale achtergrond, wat de Z-factor en de bevestigingspercentages van hits verbetert.
- Analytics: Biedt kwantitatieve verrijkingsmetrieken via het fluorescentiesignaal bij de doelaftakking, wat een vergelijkende analyse van condities mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door gezuiverde pathogenen te leveren voor de validatie van infectiemodellen.
- Bedrijfsvoering en Hergebruik: De chip en het drukregelsysteem vormen een herbruikbaar platform voor meerdere aptameer-gebaseerde scheidingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door mechanische ambiguïteit door interferentie van gemengde soorten te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde stroomsnelheden, akoestische frequentie en functionalisatie van beads.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door schonere fenotypische gegevens te genereren, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van programma's gericht op Gram-negatieve bacteriën mogelijk door betrouwbare verrijking van pathogenen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de bediening van microfluïdische apparaten, aptameerselectie en kalibratie van akoestische golven.
- Vereist precisiedrukregelaars, piëzo-elektrische transducers en fluorescentie-beeldvormingssystemen voor optimale scheiding.
- Vereist standaardisatie van monsterbereiding, kraalconcentratie en buffercondities tussen verschillende gebruikers.
- Er moet rekening worden gehouden met variaties in LPS-expressie tussen Gram-negatieve stammen bij aanpassing aan nieuwe targets.
- Praktische beperkingen omvatten aggregatie van kralen bij hoge concentraties en potentiële aspecifieke binding in complexe matrices.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Een microfluïdische platform voor Precision Small-volume monster verwerking en het gebruik ervan te Grootte Aparte Biologische Deeltjes met een akoestische microdevice
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Scheiden van bacteriën per Capsule bedrag met behulp van een discontinue dichtheid verloop
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Fabricage en werking van Acoustofluidic Devices Ondersteunend Bulk Acoustic Staande golven voor Sheathless scherpstellen van Deeltjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij
Gerelateerde video's
0 Bekeken
High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Gerelateerde video's
0 Bekeken
MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Assemblage en werking van een Acoustofluidic-apparaat voor verbeterde levering van moleculaire verbindingen aan cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026