Quantifying Bacterial Infection-Induced Amyloids Using Thioflavin T Fluorescence
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:48 min • September 26th, 2025
Loading...
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het detecteren van amyloïde aggregaten in cultuursupernatanten met behulp van thioflavine T-fluorescentie. Het protocol omvat het meten van fluorescentiesignalen vóór en na de toevoeging van supernatant van geïnfecteerde pulmonale endotheelcellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Amyloïde aggregaten zijn verkeerd gevouwen eiwitten die geassocieerd worden met diverse ziekten.
- Thioflavine T is een fluorescente kleurstof die specifiek bindt aan amyloïden die rijk zijn aan bèta-sheets.
- Inzicht in de aanwezigheid van amyloïden kan informatie verschaft over ziektemechanismen.
- Fluorescentiemetingen kunnen de amyloïdeniveaus in biologische monsters kwantificeren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het detecteren van amyloïde-aggregaten in supernatanten van celculturen.
- Het beoordelen van de impact van een Pseudomonas-infectie op de amyloïde-productie in pulmonale endotheelcellen.
- Het gebruik van fluorescentie als een kwantitatieve maat voor de aanwezigheid van amyloïde.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een thioflavine T-oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing.
- Baseline-fluorescentiemeting met behulp van een spectrofluorometer.
- Toevoeging van gefilterde, gesteriliseerde cultuursupernatans van geïnfecteerde cellen.
- Tijdsafhankelijke fluorescentiescan om amyloidniveaus te monitoren.
Belangrijkste resultaten
- Een toename van de fluorescentie werd waargenomen na toevoeging van geïnfecteerd supernatant.
- De methode kwantificeerde succesvol amyloïde aggregaten in de monsters.
- Fluorescentiewijzigingen correleerden met de aanwezigheid van door infectie geïnduceerde amyloïden.
- De studie biedt een kader voor toekomstige onderzoeken naar amyloïde-gerelateerde ziekten.
Conclusies
- De thioflavine T-fluorescentiemethode is effectief voor het detecteren van amyloïden.
- Deze benadering kan worden toegepast om de dynamiek van amyloïden in verschillende biologische contexten te bestuderen.
- Verder onderzoek kan de implicaties van de aanwezigheid van amyloïden voor de progressie van ziekten verkennen.
Veelgestelde vragen
Wat is thioflavine T?
Thioflavine T is een fluorescerende kleurstof die specifiek bindt aan amyloïde structuren die rijk zijn aan bèta-sheets, waardoor het geschikt is voor het detecteren van amyloïden in biologische monsters.
Hoe kwantificeert de methode amyloïden?
De methode kwantificeert amyloïden door de toename in fluorescentie-intensiteit te meten na toevoeging van het cultuursupernatans dat amyloïde-aggregaten bevat.
Welk type cellen is in deze studie gebruikt?
Pulmonale endotheelcellen die waren geïnfecteerd met virulente Pseudomonas-bacteriën werden gebruikt om het cultuursupranataat in te zamelen voor analyse.
Wat is het belang van het detecteren van amyloïden?
Het detecteren van amyloïden kan inzicht verschaffen in de mechanismen van diverse ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen.
Welke excitatie- en emissiegolflengten worden gebruikt?
De gebruikte excitatiegolflengte is 425 nanometers en de emissie wordt gescand van 450 tot 575 nanometers.
Kan deze methode worden toegepast op andere soorten monsters?
Ja, deze methode kan potentieel worden aangepast om amyloïden in diverse biologische monsters buiten pulmonale endotheelcellen te bestuderen.
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt kwantitatieve detectie van infectie-geïnduceerde amyloïde aggregaten mogelijk, wat doelwitvalidatie ondersteunt in onderzoek naar infectieziekten en neurodegeneratie. Door veranderingen in thioflavine T-fluorescentie te meten, biedt het een mechanistische readout voor door pathogenen getriggerde eiwitmisfolding. De assay ondersteunt het vroegtijdig verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen die bacteriële infecties koppelen aan amyloïde pathologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de hypothese dat bacteriële infectie cytotoxische amyloïdevorming in gastheercellen induceert.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van amyloïdogene routes die worden getriggerd door Pseudomonas aeruginosa-infectie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het vertrouwen in het target door blootstelling aan pathogenen te koppelen aan meetbare accumulatie van amyloïd-bèta-sheets.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt een gestandaardiseerde, op fluorescentie gebaseerde uitlezing voor voor de detectie van amyloïde in complexe biologische supernatten.
- Kwantitatieve output: Genereert tijdopgeloste fluorescentiegegevens die dosis-respons- en kinetische analyse van amyloïde-inductie mogelijk maken.
- Hergebruik van het platform: Vestigt een herbruikbaar fluorescentieprotocol dat aanpasbaar is aan andere infectieuze agentia of celtypen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Verbindt modellen van pulmonale infecties met amyloïdogene processen die relevant zijn voor neurodegeneratieve comorbiditeiten.
- Mechanische risicoreductie: Levert vroegtijdig bewijs voor infectie-gedreven proteostatische stress als translationele biomarker.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen over targets die amyloïde-interacties tussen gastheer en pathogeen moduleren.
Integratie van pipeline en workflow
De assay past binnen vroege discovery-workflows waarbij infectiemodellen worden gebruikt om pathogene mechanismen te onderzoeken die leiden tot eiwitmisfolding.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over de vraag of virulentiefactoren amyloïde-cascades triggeren in endotheelcellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentiesignalen voor het vergelijken van geïnfecteerde versus controlecondities.
- Analytics: Maakt kinetische en endpoint-fluorescentiemetingen mogelijk om de inductie van amyloïde in de loop van de tijd te kwantificeren.
- Translational Research: Verbindt cellulaire infectiefenotypes met amyloïde-gerelateerde pathways met potentiële relevantie voor biomarkers.
- Enterprise Reuse: Kan worden gestandaardiseerd over laboratoria die de interactie tussen infectie en proteostase bestuderen in diverse ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij het koppelen van infectie aan amyloïde pathologie via directe, kwantitatieve detectie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare fluorescentie-read-outs die geschikt zijn voor aanpassing naar high-throughput screening.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in de selectie van targets door mechanistische verbanden tussen infectie en amyloïde vroeg in het ontdekkingsproces te valideren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van verbindingen of genetische modifiers die door infectie geïnduceerde amyloïden onderdrukken.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiespectroscopie en amyloïd-biochemie.
- Afhankelijk van toegang tot een gekalibreerde spectrofluorometer met kinetische scanmogelijkheden.
- Vereist gestandaardiseerde verzameling en filtratie van het supernatant om interferentie door celresten te voorkomen.
- Vereist optimalisatie van de thioflavine T-concentratie en incubatietijden voor verschillende monstermatrices.
- Beperkt tot het detecteren van amyloïden rijk aan beta-sheets; mogelijk worden niet-amyloïde aggregaten of oligomeren niet gedetecteerd.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Waarom neemt de fluorescentie toe na toevoeging van geïnfecteerd supernatant?
De fluorescentie neemt toe omdat thioflavine T bindt aan bèta-sheet-rijke amyloïde aggregaten in het cultuursupernatans van Pseudomonas-geïnfecteerde pulmonale endotheelcellen, wat leidt tot een verhoogde signaalemissie.
Hoe draagt het isoleren van het supernatant als onafhankelijke variabele bij aan de validatie van het doelwit?
Door gebruik te maken van filtergesteriliseerd supernatant wordt de uitgescheiden amyloïdogene factor geïsoleerd als de onafhankelijke variabele, waardoor de amyloïd-inducerende activiteit direct kan worden beoordeeld zonder storende cellulaire componenten.
Welke kwantitatieve fluorescentiemetingen maken de detectie van amyloïd mogelijk?
Tijdsafhankelijke fluorescentiescans bij 425 nm excitatie en 482 nm emissie, samen met emissiespectra van 450–575 nm, leveren kwantitatieve resultaten op van door amyloïde geïnduceerde signaalstijgingen ten opzichte van de baseline.
Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor cross-functionele samenwerking?
Replicatie zorgt voor consistente fluorescentieresponsen over verschillende experimenten, waardoor toxicologie-, farmacologie- en discovery-teams amyloid-inductiegegevens betrouwbaar kunnen vergelijken.
Welke statistische analyse is vereist voordat deze assay wordt geïmplementeerd?
Baseline-correctie, berekening van de signaal-ruisverhouding en vergelijking van de oppervlakte onder de curve of piekfluorescentiewaarden zijn vereist om significante amyloïde-inductie boven de controleniveaus vast te stellen.
10:04
Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging
Gerelateerde video's
0 Bekeken
06:27
Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
09:49
In Vitro Assay voor het bestuderen van de aggregatie van eiwitten Tau en Drug Screening
Gerelateerde video's
0 Bekeken
06:02
Detectie van neuritische plaques in de ziekte van Alzheimer Mouse Model
Gerelateerde video's
0 Bekeken
01:21
Thioflavin-S Staining of Amyloid-Beta Aggregation in Cerebral Hypoperfused Mouse Brain Tissue
Gerelateerde video's
0 Bekeken
03:38
hFTAA Staining of Amyloid Deposits: A Technique to Visualize Amyloid Fibrils Using Oligothiophene-Based Dye for Fluorescence Imaging in Tissue Sections
Gerelateerde video's
0 Bekeken
03:26
Analyzing Amyloid Structures in a Tissue Section Using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
09:22
In vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd Tau proteïne
Gerelateerde video's
0 Bekeken
07:27
Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa
Gerelateerde video's
0 Bekeken
05:51
Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 1 augustus 2026