Assessing Transcytosis of E. coli Across Intestinal Epithelial Monolayers
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:28 min • September 26th, 2025
Begin with an E. coli culture isolated from newborns with bloodstream infections.
Centrifuge to pellet the bacteria, discard the supernatant, and resuspend the pellet in an antibiotic-free medium.
Take a plate with a transwell insert containing an intestinal epithelial cell monolayer.
Measure electrical resistance across the cell layer with a probe to confirm monolayer integrity.
Add the bacterial suspension into the insert and incubate.
Bacteria adhere to epithelial cells, are internalized within vesicles, and are transported across the cells to the lower well via a process called transcytosis.
Measure electrical resistance again; a stable value confirms an intact monolayer during transcytosis.
Transfer the insert to a fresh well and collect the medium from the previous lower well.
Plate the collected medium on an agar plate and Incubate to develop the bacterial colonies.
Count the colonies to determine the extent of E. coli transcytosis across the intestinal epithelial barrier.
Every 30 minutes following the inoculation, fill new wells with 500 microliters of TCM without antibiotics, and transfer the inserts to these new wells. Collect the media from the used collecting well for each insert into a separate labeled tube and place the tube on ice. Return the Transwell plate to the incubator between time points.
For each insert, combine the collected media from different time points and vortex briefly. Plate the collected media on LB auger plates using the track dilution method to quantify the number of bacteria transcytose in the first two hours of the experiment. Collect the media at four and six hours.
Additionally, at six hours, plate the media from the control wells. At six hours, measure and record the TEER. After overnight incubation, count the bacterial colonies manually on the track dilution LB plates.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de transcytose van E. coli door intestinale epitheelcellen. Door de elektrische weerstand te meten en bacteriële kolonies te tellen, beoordeelt het experiment de integriteit van de epitheliale barrière tijdens het bacteriële transport.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- E. coli kan bloedbaaninfecties veroorzaken, met name bij pasgeborenen.
- Inzicht in bacteriële transcytose is essentieel voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- De integriteit van de darmbarrière is van vitaal belang om infecties te voorkomen.
- Transcytose omvat het transport van stoffen door een cellaag.
Doel van de studie
- Om het transcytosemechanisme van E. coli in intestinale epitheelcellen te evalueren.
- Om de impact van bacteriële adhesie op de epitheliale integriteit te meten.
- Om de mate van bacteriële transport over de epitheliale barrière te kwantificeren.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie van E. coli-culturen om bacteriën te isoleren.
- Gebruik van transwell-inserts met monolagen van darmepitheelcellen.
- Meting van de elektrische weerstand om de integriteit van de monolaag te bevestigen.
- Kolonietelling op agarplaten om transcytose te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Een stabiele elektrische weerstand duidt op een intacte epitheliale monolaag tijdens de experimenten.
- Kwantificering van bacteriële kolonies onthult de omvang van de transcytose.
- De resultaten tonen een tijdsafhankelijke toename van het bacteriële transport.
- Controleputjes leveren basisgegevens voor vergelijking.
Conclusies
- De studie demonstreert succesvol de transcytose van E. coli door intestinale epitheelcellen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van bacteriële pathogenese bij bloedbaaninfecties.
- Toekomstig onderzoek kan therapeutische interventies verkennen om de barrièrefunctie te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het beoordelen van bacteriële transcytose over intestinale epitheliale monoculturen biedt een mechanistisch model voor het evalueren van pathogeen-gastheerinteracties die relevant zijn voor neonatale sepsis en de functie van de gastro-intestinale barrière. Deze assay maakt targetvalidatie in een vroeg stadium mogelijk door bacteriële translocatie te kwantificeren, wat bijdraagt aan het verminderen van risico's bij anti-infectieuze strategieën die gericht zijn op het behoud van de epitheliale integriteit. De methode levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten die aansluiten bij de behoeften in de ontdekkingsfase voor voorspellende betrouwbaarheid van therapeutica die op de gastheer zijn gericht.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over het passeren van epitheliale barrières door pathogenen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets die betrokken zijn bij barrièreregulatie of bacteriële internalisatie.
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door moleculaire mechanismen te koppelen aan fenotypische resultaten van transcytose.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde epitheliale monolagen voor consistente, reproduceerbare screening van verbindingen of antilichamen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt standaardisatie van transcytose-assays mogelijk door middel van TEER-monitoring en bemonstering op specifieke tijdstippen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt het gebruik van een schaalbaar platform voor het evalueren van barrière-modulerende agentia over meerdere tijdstippen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert ziekterelevante gastheer-pathogeen interacties bij neonatale E. coli bacteriëmie.
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische continuïteit door veranderingen in de permeabiliteit van de barrière te kwantificeren.
- Wetenschappelijke waarde: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van profielen van inhibitie of versterking van transcytose.
Pijplijn- & Workflowintegratie
Deze transcytose-assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van target engagement screening tot preklinische evaluatie van de effectiviteit, in het bijzonder voor pathogenen die gebruikmaken van cellulaire transportmechanismen van de gastheer.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van bacteriële adhesie, invasie en intracellulaire transportroutes.
- Screening: Levert kwantitatieve, tijdsopgeloste resultaten voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op bacterieel transport.
- Analytics: Genereert colony-forming unit (CFU) tellingen en TEER-trajecten als belangrijkste uitkomatmaten voor de vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de epitheliale barrièrefunctie met preklinische modellen van neonatale sepsis.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van barrièrebeschermende of anti-virulentieverbindingen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanische risicoreductie voor targets die betrokken zijn bij de modulatie van de epitheliale barrière.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door monitoring van de elektrische weerstand en gestandaardiseerde bemonstering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door targetmodulatie te koppelen aan functionele barrière-uitkomsten.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van de effectiviteit van de remming van transcytose.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, steriele techniek en het gebruik van transwells.
- Afhankelijk van TEER-meetapparatuur en anaerobe of gecontroleerde incubatiesystemen.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams wat betreft het tijdstip van inoculatie, bemonsteringsintervallen en CFU-kwantificering.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten de bron van de epitheelcellen, variabiliteit in pathogene stammen en remmers van vesikeltransport.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in monolaagvorming en potentiële storende effecten van bacteriële cytotoxiciteit op de TEER.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Injecties van Lipopolysaccharide in muizen om na te bootsen ingang van microbiële afkomstige producten na de schending van de intestinale barrière
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Methoden om te studeren epitheliale Transport Protein functie en de expressie in Inheemse darm en Caco-2-cellen gekweekt in 3D
Gerelateerde video's
0 Bekeken
In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Functionele beoordeling van intestinale tight junction barrier en ionendoorlaatbaarheid in inheems weefsel door Ussing Chamber Technique
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026