Name: Gestroomlijnde Zuivering van Plasmide DNA Van Prokaryote culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer een gestroomlijnde methode voor plasmide-DNA-zuivering uit E. coli met hoge opbrengst en lagere kosten. Dit protocol gebruikt deep-well platen en DNA-bindende filters voor efficiënte moleculaire biologie-toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lysaat Clearance <ol><li> Grow E. coli culturen getransformeerd met de gewenste plasmide DNA in diepe borden goed (1 ml van de cultuur / putje) in Luria bouillon met een geschikte antibiotica 's nachts bij 37 ° C met schudden. </li><li> Pellet E. coli in de cultuur plaat bij 5.000 xg gedurende 10 minuten, daarna overgieten supernatant. </li><li> Resuspendeer elke pellet in 100 ui resuspensie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 ug / ml RNase A). </li><li> Voeg 100 ul / well Lysis Buffer (200 mM NaOH, 1% SDS) en schud met behulp van plaat shaker gedurende 2 minuten. </li><li> Voeg 100 ul / well neutralisatie buffer (3,0 M kaliumacetaat, pH 5.5) en schud gedurende 2 minuten. </li><li> Overdracht cellysaat om opheldering plaat lysaat. </li><li> Plaats DNA-bindend bord op de top van 350 pi collectie platen en plaats in de onderkant van vacuüm manifold. Monteer vacuum spruitstuk (zie figuur 1). </li><li> Plaats lysaat verduidelijking bord op de top van vacuüm apparatuur. </li><li> Van toepassing zijn vacuüm bij 10 inch Hg (0,34 bar) en verzamel het filtraat in DNA-binding plaat. Gebruik geen stofzuiger meer dan 12 inch Hg. (0,41 bar). </li><li> Demonteer vacuum spruitstuk. Plaats 2 mL inzameling van afval plaat in de bodem van apparaten. </li></ol> 2. DNA-Bindende <ol><li> Verplaats de DNA-binding plaat aan de bovenkant van het spruitstuk (zie figuur 2). </li><li> Voeg 300 ul / putje Binding Buffer (6 M Guanidine-HCl) en de pipet op en neer om te mengen. </li><li> Van toepassing zijn een vacuüm [~ 5 inch Hg (0,17 bar) voor langzaam vacuüm] en gooi filtraat. DNA is nu gebonden aan membraan. </li><li> Was met 400 pl / putje van Wash Buffer (80% ethanol). </li><li> Van toepassing zijn vacuüm, gooi het filtraat. Gooi niet nodig bij gebruik van 2 mL collectie bord of filtering direct naar afval. </li><li> Herhaal wassen een keer. </li><li> Blot onderkant van het filter plaat op absorberende handdoek om te drogen. </li><li> Van toepassing zijn vacuüm eens meer voor 5-10 minuten om de verwijdering van de resterende alcohol te verzekeren. </li><li> Blot onderkant om de verwijdering van ethanol druppels te verzekeren. </li></ol> 3. DNA Elutie <ol><li> Voeg 70 pl / putje elutiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Als hogere DNA-concentratie gewenst is, kan het volume worden teruggebracht tot 50 ul / putje, maar de gemiddelde totale opbrengst lager zal zijn. </li><li> Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende een minuut. </li><li> Gezuiverde DNA kan worden geëlueerd door een vacuüm of centrifugeren. </li><li> Vacuum methode: Plaats clean collectie plaat (DNase, RNase vrij) in vacuum spruitstuk. Plaats filter bord op de top van vacuüm-manifold, van toepassing vacuüm bij 15 inch Hg (0,5 bar) gedurende 1 minuut totdat alle elutiebuffer heeft doorgegeven via de DNA-binding plaat. Verzamel gezuiverde DNA (zie figuur 3). </li><li> Centrifugatie methode: Plaats zuivering filter bord op de top van schone collectie platen en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten. </li></ol> 4. Kwantitatieve en kwalitatieve analyses <ol><li> Meten OD 260/280, bereken de concentratie van het gezuiverde DNA. </li><li> Voer agarosegel analyse van het gezuiverde pDNA. </li></ol> 5. Representatieve resultaten E. coli lysaat verduidelijkt met behulp van traditionele centrifugeren en Pall AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filterplaten toonde aanzienlijke vermindering van puin van uitgangsmateriaal. (Figuur 4). Plasmide DNA bij drie concentraties werd spiked in TE-buffer en door de AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filter plaat. Een vergelijking van plasmide DNA-concentratie, pre-en post-filtratie, shows ~ 100% herstel (figuur 5) bij alle drie de concentraties. Het herstel van DNA van E. verduidelijkt aan te tonen coli lysaat, plasmide DNA werd spiked in ruwe lysaat en daarna door filtratie. Dezelfde plasmide DNA werd toegevoegd aan cellysaat na filtratie. Elektroforese werd uitgevoerd op aliquots van elk monster (Figuur 6). Een enkele, duidelijke band van vergelijkbare intensiteit van elk monster toont weinig of geen DNA verlies tijdens de filtratie-based verduidelijking stap. Culturen van E. coli met pCAT plasmide DNA werd gezuiverd van E. coli lysaten met behulp van Pall's 350 pi en 1 ml DNA-binding filterplaten, evenals twee andere merken van 350 pi DNA-binding platen. Alle zuiveringen werden uitgevoerd zoals aangegeven in aanbevolen protocol van de fabrikant. De hoogste DNA-concentratie en de totale opbrengst worden gezien van de Pall is een mL AcroPrep Advance DNA-zuivering filter plaat (figuur 7 en tabel 2). Hoewel Concurrent W toont ook een hoge DNA-concentratie (155 ng / pl), de totale DNA-opbrengst is het laagst (4,7 ng / putje) als gevolg van de geringe hoeveelheid volume, ~ 30 pi. Concurrent M gaf de laagste concentratie van het DNA bij 108 ng / ul met een totale opbrengst van 5,6 g / goed. Agar-agarose gel-analyse van gezuiverde pCAT DNA van de drie verschillende DNA-binding platen is weergegeven in Figuur 8. Elke verzamelde monstervolume werd aangepast om 65 ul om te corrigeren voor verschillen in herstelvolume voorafgaand aan de elektroforese. Alle monsters tonen supercoiled plasmide DNA, maar DNA-opbrengst van elk van de filterplaten varieert. Figuur 9 toont de bereide DNA is allemaal in helix vorm en heeft vergelijkbare concentratie. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vergadering van Vacuüm Manifold voor Lysate verduidelijking. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vergadering van Vacuüm Manifold voor DNA-binding. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vergadering van Vacuüm Manifold voor Vacuum Elutie. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Filtratie vereenvoudigt de sample verduidelijking. Drievoud monsters van 300 ul van ruwe lysaat verduidelijkt door vacuümfiltratie (350 pL AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filter plaat) of traditionele centrifugeren. OD 320 gemeten vóór en na de verduidelijking. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Volledig herstel van pDNA na het doorlopen van AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filter plaat. 300 pi TE-buffer verrijkt met pCAT bij 25, 50 en 100 ug / ml. DNA-concentratie en herstel berekend op basis van OD 260 voor en na filtratie, N = 2. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Herstel van pCAT DNA na verduidelijking. Gelijke hoeveelheden van pUC19 spiked in lysaat voor of na de verduidelijking, vervolgens worden verdund 1 tot 10 van TE-buffer. Geladen 2 pl / rijstrook op 1,2% agarose gel. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Hogere plasmide DNA opbrengst per goed met pall Acroprep Advance DNA-binding filterplaat dan concurrerende platen. PCAT plasmide DNA opbrengst (OD 260) met behulp van DNA-zuivering aangegeven platen met 1 ml (Pall en concurrent M) of 1,5 ml (Concurrent W) 's nachts de cultuur van DH5a. Zuivering met behulp van een constructieplaat aanbevolen protocol. Foutbalken geven standaardfout (n&gt; 6). <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Figuur 8. Agarosegel analyse van pCAT DNA gezuiverd op aangegeven DNA-binding plaat. 1,2% agarosegel elektroforese van het gezuiverde pDNA. Gepoolde monsters van drie verschillende zuiveringen, eluaat aangepast aan 65 uL na zuivering, 1:10 verdund. Geladen 2 pl per rijstrook. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="Figuur 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 9"> Figuur 9. Kwaliteit en het herstel van pure dna vergelijkbaar wanneer een centrifuge of vacuüm methodes worden gebruikt voor de uiteindelijke eluaat collectie agarosegelelektroforese van het gezuiverde pDNA. Door de fabrikant aanbevolen protocol voor AcroPrep Advance filterplaten werd gevolgd voor de pDNA zuivering. Elutie werd uitgevoerd door centrifuge bij 1000 xg gedurende 5 minuten of stofzuiger met 15 inch Hg (0,5 bar) gedurende 2 minuten.

De auteurs van deze video-artikel zijn medewerkers van Pall Life Sciences die produceren het instrument en de reagentia in de video en tekst.

Beschrijven we een gemakkelijke, gestroomlijnde protocol van AcroPrep Advance filterplaten dat verschillende voordelen biedt. Deze methode biedt maximale plasmide DNA opbrengst bij verwerking in de handmatige, semi-automatische, of volledig geautomatiseerde AcroPrep Advance formaten. Een geïntegreerde voorfilter op de lysaat klaring plaat biedt een consistente filtratie van de monsters, zelfs die met hoge niveaus van fijn stof. Het goed geometrie van de plaat resulteert in een snellere, meer uniforme filtratiesnelheid over de plaat met een minimale hold-up volume, en de uitlaat tip geometrie biedt directe doorstroming van de monsters in de ontvanger plaat zonder zorgen van kruisbesmetting. Belangrijk is dat de hoge bindingscapaciteit membraan in DNA-binding plaat van AcroPrep Advance filterplaten geoptimaliseerd voor een maximale recuperatie van hoge kwaliteit plasmide DNA.

<table><tbody><tr><td>AcroPrep Advance filterplaat</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8175 (1 mL) of PN 8075 (350 &amp;#181;l)</td><td>3 &amp;#x03BC;m glasvezel 0,2 &amp;#x03BC;m Supor&amp;#174; membraan voor klaring</td></tr><tr><td>AcroPrep Advance filterplaat</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8132</td><td>voor DNA-binding</td></tr><tr><td>Vacuümmanifold</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 5017</td><td></td></tr><tr><td>Vacuümpomp</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 13157</td><td></td></tr></tbody></table>

gestroomlijnde zuivering van plasmide dna van prokaryote culturen

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

Beschrijven we het volledige proces van AcroPrep Advance Filter Platen voor 96 plasmide bereidingen, vanaf prokaryotische cultuur en eindigend met een hoge zuiverheid DNA. Op basis van multi-en filtratie voor bacteriële lysaat opruiming en DNA-zuivering, deze methode zorgt voor een gestroomlijnd proces voor plasmide voorbereiding. Filter platen met silica-gebaseerde media kan gemakkelijk worden verwerkt door vacuüm filtratie of centrifuge om aanzienlijke hoeveelheden plasmide DNA opbrengst. Kwantitatieve analyses bepalen het gezuiverde plasmide DNA is constant van hoge kwaliteit met een gemiddelde OD 260/280 verhouding van 1,97. Over het algemeen levert plasmide bieden meer pure DNA voor downstream-toepassingen, zoals sequencing en klonen. Deze gestroomlijnde methode voor het gebruik van AcroPrep Advance filterplaten zorgt voor handmatig, semi-automatische of volledig geautomatiseerde verwerking.

Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor een efficiënte parallelle verduidelijking en plasmide DNA zuivering uit<em&gt; E. coli</em&gt; Culturen. De AcroPrep Advance proces start met een geoptimaliseerde lysaat verduidelijking filter plaat, gevolgd door zuivering op een hoge bindingscapaciteit DNA-binding filter plaat.

Gestroomlijnde Zuivering van Plasmide DNA Van Prokaryote culturen

We beschrijven het volledige proces van AcroPrep Advance Filter Plates voor 96 plasmidepreparaties, beginnend bij de prokaryote cultuur en eindigend met een hoge ...

<a class="grey_button" href="/video/2711"> Chinees </a>

streamlined-purification-of-plasmid-dna-from-prokaryotic-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zuiveren Plasmide DNA van bacteriële kolonies Met behulp van de Qiagen Miniprep Kit

We beschrijven een werkwijze voor de affiniteit-gemerkte zuivering van recombinante eiwitten met vloeistof handling robotica. Deze methode is algemeen toepasbaar op de kleinschalige zuivering van oplosbare His-gemerkte eiwitten in een high-throughput format.

High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

De lineaire covalent gesloten (LCC) DNA-minivector (DNA-ministring) is een niet-viraal genoverdrachtsvector dat een hoge transfectie-efficiëntie biedt en relevant is voor elke DNA-overdrachtstoepassing. Het productiesysteem is eenvoudig, snel en schaalbaar in vivo. Het volgende protocol biedt visuele stapsgewijze instructies voor de productie van DNA-ministrings.

Productie van Dubbelstrengs DNA Ministrings

Dit artikel presenteert een gevoelige methode genaamd Circle-Seq voor het zuiveren van extrachromosomale circulaire DNA (eccDNA). De methode omvat zuivering in een kolom, verwijdering van resterend lineair chromosomaal DNA, rolling-circle-amplificatie en high-throughput sequencing. Circle-Seq is toepasbaar voor het screenen op genoomschaal van eukaryotische eccDNA en het bestuderen van genoomonstabiliteit en copy-numbervariaties.

Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

In vivo assemblage is een ligatie-onafhankelijke kloneringsmethode die berust op intrinsieke DNA-reparatie-enzymen in bacteriën om DNA-fragmenten te assembleren door homologe recombinatie. Dit protocol is zowel tijd- als kosteneffectief, aangezien er weinig reagentia nodig zijn en de kloonefficiëntie kan oplopen tot 99%.

Gebruik van in vivo assemblage voor zeer efficiënte plasmideconstructie

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het tot overexpressie brengen van recombinant Nsp15, een toxische nuclease, in een C41(DE3) expressiesysteem, gevolgd door zuivering van het gelabelde eiwit met behulp van affiniteits- en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende giftige eiwitten.

Overexpressie en zuivering van een toxische nuclease van Escherichia coli

De huidige studie beschrijft een workflow voor nanoporesequencing van plasmiden wanneer de chromosomale sequentie al bekend is of niet van belang is. Een initiële plasmide-DNA-verrijkingsstap zorgt voor een optimale plasmidesequentiediepte en maximaliseert het aantal monsters dat per flowcel kan worden gesequenced.

Long-read plasmidvolgordebepaling en assemblage met behulp van op nanopore sequencing gebaseerde workflows

Transformatie van plasmide DNA in E. coli Met behulp van de heat shock-methode

Leer een gestroomlijnde methode voor plasmide-DNA-zuivering uit E. coli met hoge opbrengst en lagere kosten. Dit protocol gebruikt deep-well platen en DNA-bindende filters voor efficiënte moleculaire biologie-toepassingen.

Gestroomlijnde Zuivering van Plasmide DNA Van Prokaryote culturen

Meer video's verkennen