Name: Labeling F-actine Prikkeldraad Eindigt op Rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei Cones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer F-actine barbed ends visualiseren in neuronale groeikegels met rhodamine-actine en saponine-permeabilisatie. Deze methode kwantificeert actine-polymerisatie onder invloed van axonale geleidingsignalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken dr. James Bamburg en leden van zijn laboratorium voor samenwerking in deze studies. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​HD19950, EY07133 en door subsidies van de Minnesota Medical Foundation.

Voor rhodamine-actine labeling, zijn neuronen gekweekt op glas dekglaasjes geplaatst in de bodem van 35 mm plastic borden, of op dekglaasjes gelijmd in "video" gerechten. 1. Voorbereiding van Dekglaasjes of "Video" Dishes <ol><li> Veel soorten neuronale slecht lijm aan in vitro substraten. Dekglaasjes, die nodig zijn voor deze procedure, kan niet toestaan ​​dat voldoende neuron-substraat adhesie, tenzij ze voldoende wordt gereinigd en voorbereid. Een gedetailleerde procedure voor zure wassen en reinigen van glas dekglaasjes wordt beschreven in het boek Het kweken van zenuwcellen, onder redactie van Banker en Goslin. Als alternatief is een nitrocellulose coating voor dekglaasjes, die gretig bindt substraat moleculen, beschreven in stap 1.7 en 1.8 hieronder. </li><li> Glas dekglaasjes (bijv. 18 mm vierkanten of cirkels 24 mm) zijn gespoeld in dH 2 O en gebakken in droge warmte (≥ 225 ° C) zo lang mogelijk (minimaal enkele dagen tot drie maanden of langer) om sporen van organisch te verwijderen verbindingen. Ga naar de 1.6 of voor video-gerechten gaat u verder met stap 1.3. </li><li> Voor het maken van een dunne heldere glazen substraat voor hoge resolutie videomicroscopy, zijn ronde gaten van de juiste diameter geboord in de bodem van 35 of 50 mm plastic Petri of weefselkweek gerechten met een elektrische kurkboor (of vergelijkbaar instrument). Boren is langzaam gedaan met lichte druk om te voorkomen dat het kraken van de kunststof. Randen van het boorgat worden afgeschraapt met een schaar tot een glad oppervlak aan beide zijden te creëren. </li><li> Dekglaasjes worden gereinigd voor weefselkweek te gebruiken, zoals beschreven in 1.1 of 1.2. Coverslips worden gelijmd in plaats over de gaten, met behulp van niet-giftige siliconen aquarium cement (voor 18x18mm dekglaasjes, een 12mm diameter bit wordt gebruikt). Het cement is uitgehard gedurende 24 uur. </li><li> (De volgende stappen zijn gedaan met behulp van steriele omstandigheden) De video gerechten worden gespoeld drie keer met steriel dH 2 O en liet aan de lucht drogen. </li><li> Coverslips zijn gecoat met substraat moleculen voor neuronale cultuur. Eerst wordt het dekglaasje oppervlak bedekt met (250 il voor 18x18 dekglaasje) een oplossing van 100 ug / ml poly-D-lysine in PBS voor 4-8 uur (of 's nachts) in een vochtige 38 ° C incubator. Coverslips worden vervolgens gespoeld drie keer met steriel dH 2 O om ongebonden te verwijderen poly-D-lysine en liet aan de lucht drogen. Veel neuronale soorten zijn gekweekt op dekglaasjes bekleed met poly-D-lysine alleen, als serum-eiwitten zijn opgenomen in het kweekmedium. Echter, de resultaten meer relevant zijn voor in vivo omstandigheden worden verkregen door het gebruik van natuurlijke substraat moleculen. Oplossingen van deze moleculen, zoals laminine, fibronectine of L1 CAM (1-20 ug / ml in PBS), direct kunnen worden toegepast op poly-D-lysine beklede dekglaasjes voor 4-8 uur of 's nachts, maar in ons lab hebben we regelmatig de vacht van de voorbereide dekglaasjes met een dunne film van nitrocellulose voordat celadhesiemoleculen naar eiwit-substraat binding te vergroten. </li><li> Maak een 1% nitrocellulose-oplossing door het oplossen van 5 g nitrocellulose in 5 ml 100% amylacetaat. Van toepassing zijn 10 pi van deze oplossing voor het dekglaasje en voorzichtig spreid het over het oppervlak. Drogen aan de lucht 10 minuten. </li><li> Breng 250 pi van een oplossing van 25 ug / ml laminine of 4 ng / mL L1 CAM in PBS en verspreid over de nitrocellulose oppervlak. Incubeer 4 uur (of nacht) in een vochtige 38 ° C incubator, aspireren substraat en voeg onmiddellijk kweekmedium, zodat de ondergrond niet droog. </li></ol> 2. De voorbereiding van neuronale culturen <ol><li> Embryonale dag 7 kippenembryo's worden verwijderd uit eieren, en geplaatst in 100 mm platen met kweekmedium met 10% serum voor dissectie om de interne organen van de thorax en de buik te verwijderen, met behulp van een stereomicroscoop. </li><li> De embryo's worden vervolgens gespoeld met medium en verhuisde naar een 60 mm schotel met vloeibaar medium en verder ontleed te verwijderen en voor te bereiden explantaten van achterwortelganglia (DRG) of neurale netvlies weefsels. Een gedetailleerde dissectie beschrijving is te vinden in Methods in Cell Biology, volume 71, Neuronen: methoden en toepassingen voor de Celbiologe, bewerkt door Hollenbeck en Bamburg. DRG explantaten zijn 1/2-whole ganglia en neurale netvlies explantaten zijn 1 mm of minder in diameter. </li><li> Na het reinigen van de explantaten van vreemde weefsels, zijn individuele explantaten verhuisde met horlogemakers pincet om de dekglaasjes, die reeds in de cultuur gerechten met het kweekmedium. Onder een microscoop ontleden, is het explantatie voorzichtig ingedrukt om het centrum van het dekglaasje met een tang om beweging te voorkomen, terwijl het transport naar de incubator. Explantaten worden gekweekt in F12 medium met B27 additieven, gebufferd met 10 mM HEPES tot pH 7,4 en overnachting in een vochtige 38 ° C incubator. Groeifactoren kunnen worden toegevoegd, indien nodig, aan het kweekmedium. Neurotrofinen worden vaak toegevoegd aan DRG culturen uit oude embryo's, hoewel E7 DRG neuronen zal axonen strekken zich uit explantaten zonder toegevoegde neurotrofinen. Explantaten van neurale netvlies te breiden axonen in deze cultuur medium zonder eendding groeifactoren. </li><li> Culturen zijn geïncubeerd gedurende tenminste 18 uren om voldoende axonale uitgroei mogelijk te maken vóór het begin van de onderstaande procedure. </li></ol> 3. Voorbereiding van Rhodamine-actine permeabilisatie Buffer <ol><li> Een voorraad oplossing van permeabilisatie buffer die 138 mM KCl, 10 mm buizen, 3 mM EGTA, 4mm MgCl 2, en 1% BSA (pH = 6,9) gehouden kan worden tot 2 weken bij 4 ° C11. Net voor gebruik, worden de volgende componenten toegevoegd voor een uiteindelijke concentratie van: 0,025% saponine, 0,1 mM ATP, en 100 nM Alexa-fluor 350 phalloidin. </li><li> Een aparte oplossing is ook vers bereid vlak voor gebruik met dezelfde componenten plus 0.45μM rhodamine non-muscle actine De oplossing is afwisselend gevortext en tritrated gedurende 5 min tot rhodamine-actine klonten te ontbinden, en is gevortexed gedurende 1 minuut in de eerste permeabilisatie stap om te voorkomen dat polymerisatie in de buis. Mochten er ondanks deze, filament montage in de buis blijft een probleem, kan de oplossing worden vóór gecentrifugeerd om te gebruiken. </li></ol> 4. Permeabilisatie van neuronale culturen en Integratie van Rhodamine-actine op F-actine Barbed Ends <ol><li> Een cultuur schotel met DRG of retinale explantaten is zorgvuldig verwijderd uit de incubator en de volgende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. </li><li> Alle wijzigingen van de oplossingen moeten zorgvuldig worden gedaan. De pipetpunt moet worden geplaatst aan de rand van het dekglaasje, en oplossingen moeten worden verwijderd en toegevoegd langzaam en met minimale kracht. </li><li> Het kweekmedium wordt verwijderd met een pipet voorzichtig, maar gestaag, en genoeg permeabilisatie buffer om cellen te dekken is toegevoegd voor een min (voor 18mm x 18mm dekglaasje, ~ 60 pi). De cultuur is niet gespoeld met andere oplossingen voor het toevoegen van de permeabilisatie buffer, en het dekglaasje is niet toegestaan ​​om te drogen voordat u de permeabilisatie buffer. </li><li> De permeabilisatie buffer wordt voorzichtig verwijderd met een pipet en vervangen door de permeabilisatie buffer met 0,45 uM rhodamine non-muscle actine voor 4 minuten. </li><li> De rhodamine-actine-bevattende buffer wordt voorzichtig verwijderd met een pipet, en de neuronen worden vastgesteld door het toevoegen van een oplossing van 4% paraformaldehyde (laboratorium kwaliteit, gemaakt met fosfaatbuffer, pH 7,3), 0,05% glutaaraldehyde en 10% sucrose. Na 5 minuten fixatie de dekglaasjes zijn voorzichtig gespoeld met PBS, en gemonteerd in Slowfade op 3-inch glazen dia's. </li><li> Een alternatieve benadering op veranderende oplossingen is het gebruik van een flow cel. Dit kan een commercieel verkrijgbaar flow cel, of een simpele flow cel kan worden gemaakt door het plaatsen van kleine stukjes plastic (≤ 1 mm dik) als afstandhouders op de hoeken van het dekglaasje, en dan monteren een gelijke grootte dekglaasje op de top van de dekglaasje aan. Oplossingen kunnen worden uitgewisseld door het plaatsen van de pipet aan de ene kant van de stroom cel en intrekking van oplossingen met een lont (katoen of een Kimwipe), aan de andere kant. </li><li> De integratie van rhodamine-actine op F-actine prikkeldraad eindigt en tl-phalloidin etikettering van F-actine in de groei kegels wordt gevisualiseerd met epi-fluorescentie optiek door middel van een 60X olie-immersie objectief, en de beelden worden verzameld met behulp van een gekoelde CCD-camera. Een confocale microscoop kan zorgen voor een betere beeldvorming. </li><li> Voor de beste kwantificering van rhodamine-actine incorporatie alle afbeeldingen moet worden verzameld in een enkele sessie, met dezelfde gain en belichtingsinstellingen van de digitale camera de gevoeligheid voor elk beeld. Analyse van de etikettering moeten worden gemaakt van equivalente regio's van elk beeld, Metamorph, Image J of soortgelijke geautomatiseerde tools voor beeldanalyse kunnen worden gebruikt. </li></ol> Variaties op dit PROCEDURE 5. Variatie One: Verzamel Live Cell beelden Voorafgaand aan Rhodamine-actine Etikettering <ol><li> Video gerechten zijn geplaatst op een verwarmde microscoop podium, en live groeikegel beelden zijn verzameld. Gerasterde coverslips kan worden gebruikt, of etsen en / of pen markeringen op het dekglaasje kan worden gemaakt om gemakkelijker specifieke cellen te vinden nadat de etikettering, of de video gerecht kan worden bevestigd op zijn plaats op de microscoop podium voor de duur van de procedure. </li><li> Permeabilisatie, integratie van rhodamine-actine, en cel fixatie worden uitgevoerd in de video schotel, op of buiten de microscoop podium. Na de vaststelling wordt PBS toegevoegd aan de video-gerechten voor directe beeldvorming. Voor het behoud van de steekproef voor latere beeldvorming, is slowfade montage medium toegevoegd aan het dekglaasje en een dekglaasje van gelijke grootte is voorzichtig bovenaan geplaatst (het vermijden van luchtbellen), en de randen worden vervolgens afgedicht met heldere nagellak. </li></ol> 6. Variatie Twee: Immunochemie naar Co-label Extra eiwitten <ol><li> Rhodamine-actine oprichting en fixatie kan worden uitgevoerd op de neuronen gekweekt op dekglaasjes of in video gerechten, zoals hierboven beschreven (4,2 tot 4,4). </li><li> Na fixatie, en spoelen in PBS, worden de cellen behandeld 15 min met 0,1 M glycine in PBS en daarna geëxtraheerd met 0,1% Triton X-100 (TX-100) in PBS met 2% geit serum en 1% BSA gedurende 1 uur Coverslipsworden geïncubeerd met het primaire antilichamen verdund in PBS dat 1% BSA gedurende 1 uur De dekglaasjes worden vervolgens gespoeld en geïncubeerd in 0,1% TX-100 in PBS met 2% geit serum en 1% BSA gedurende 1 uur, voor het aanbrengen van fluorescente secundaire antilichamen bij 1:1000 verdunning in PBS met 1% BSA gedurende 1 uur Na het spoelen, zijn de dekglaasjes opnieuw geïncubeerd in 0,1% TX-100 in PBS met 2% geit serum en 1% BSA gedurende 30 minuten, gespoeld, en gemonteerd in anti-fading medium. De lokalisatie van sommige eiwitten wordt verstoord door de eerste permeabilisatie stap (4,3). Te behouden deze eiwitten voor de lokalisatie met antilichamen, 0,05% en 0,05% paraformaldehyde glutaaraldehyde kunnen worden toegevoegd aan de permeabilisatie buffer gedurende 1 min (dus vóór het toevoegen van de rhodamine-actine) zonder dat het prikkeldraad einde etiket door rhodamine-actine. </li><li> Foto's van triple-gelabeld groei kegels zijn verzameld door fluorescentie of confocale microscopie. </li></ol> 7. Variatie Drie: Beoordeling van de effecten van Guidance Cues op F-actine Gratis Barbed Ends <ol><li> Een groeifactor of begeleiding cue wordt toegevoegd aan de cultuur gerechten in de couveuse bij concentraties van verschillende ng / ml voor een paar minuten (of een passende behandeling tijd) voordat u de schotel uit de incubator en het begin van de permeabilisatie procedure. Dit maakt de beoordeling van de korte-termijn effecten van groeifactoren of begeleiding aanwijzingen op de F-actine vrij prikkeldraad eindigt. </li><li> Een video schotel met neuronale culturen kunnen worden geplaatst op een verwarmde microscoop podium, en groeifactoren of begeleiding signalen kunnen worden vrijgesteld van een micropipet in een gradiënt in de buurt van een groei kegel voor het begin van de permeabilisatie en rhodamine-actine oprichting. Kan bijvoorbeeld NGF worden vrijgegeven voor DRG neuronen of netrine voor neurale retinale ganglioncellen. De pipet kan worden ingevoerd voor zo kort 1-2 minuten voor het begin van het permeabilisatie procedure. Dit maakt de beoordeling van de lokale effecten van een begeleiding cue gradiënt op de vorming van de F-actine vrij weerhaken eindigt in groeikegel de grootste winstmarges (zie referentie citation 10 voor afbeeldingen). </li><li> Deze variaties kunnen worden gecombineerd met antilichaam-gemedieerde etikettering van andere neuronale componenten, zoals beschreven in 6.2. </li></ol> 8. Variatie Vier: F-actine Gratis Prikkeldraad End Etikettering op Getransfecteerde Neuronen <ol><li> Het gebruik van constitutief actieve of dominante-negatief bouwt of proteïne knockdown met behulp van RNAi (met een fluorescerende identificeren marker) kan gebruikt worden om een ​​eiwit betrokken bij het reguleren van F-actine vrij prikkeldraad eindigt beoordelen. Afhankelijk van het eiwit, de lokalisatie in de groei kegel, en als het is gefuseerd aan een fluorescerend label, het fluorescerende proteïne uitgedrukt in getransfecteerde cellen verloren kunnen gaan bij permeabilisatie. Als dit het geval is, kan video schotels worden gebruikt om een ​​getransfecteerde cel te identificeren microscopisch voor permeabilisatie, en de permeabilisatie kan worden uitgevoerd op de microscoop podium, na het markeren van de positie van de getransfecteerde cellen. Als alternatief kan een GFP-actine construct als co-getransfecteerd met een GFP-construct van belang. In dit geval zal GFP-actine worden opgenomen in de F-actine, en zal niet verloren gaan door permeabilisatie, waardoor de identificatie van de getransfecteerde cellen na permeabilisatie. </li><li> Deze variatie kan worden gecombineerd met de toevoeging van begeleiding signalen, zoals beschreven in 7.1-7.3 hierboven. </li></ol> 9. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Global toevoeging van NGF verhoogt de totale F-actine en F-actine prikkeldraad eindigt bij de groei kegel toonaangevende marge. Wanneer een DRG groeikegel wordt gestimuleerd met een zenuw groeifactor (NGF) gedurende 5 minuten, actine polymerisatie wordt gestimuleerd op de voorste rand, en een heldere band van rhodamine-actine-etikettering is gezien rond de groeikegel periferie. Figuur 1 vergelijkt rhodamine-actine-opname in een gestimuleerde DRG groeikegel en een NGF-gestimuleerde DRG groei kegel. De groene fluorescentie in de gefuseerde beelden is phalloidin etikettering voor F-actine in de groei kegel en de rode is rhodamine-actine-labeling. Een goede controle voor het prikkeldraad einde etikettering is tot 10-6 M of hoger cytochalasine B of D toe te voegen in de permeabilisatie buffer in stappen 4.2 en 4.3. Cytochalasins cap F-actine prikkeldraad eindigt en de remmen rhodamine-actine binden aan prikkeldraad eindigt. Dit moet drastisch verminderen of te elimineren integratie van rhodamine-actine in de cel. Schaal van bars, 10 urn. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een NGF gradiënt verhoogt lokaal F-actine prikkeldraad eindigt. Een micropipet die releases NGF is gebracht aan een kant van een DRG groeikegel gedurende 2 minuten, gevolgd door de etikettering van F-actine vrij prikkeldraad eindigt. De beelden hieronder laten zien dat blootstelling aan een helling van de NGF lokaal stimuleert een verhoging van de F-actine vrij weerhaken eindigt in de groei kegel regio dichter bij de pipet. De gefuseerde beeld toont phalloidin in het groenen rhodamine-actine in het rood. Schaalbalk, 10 urn. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Geactiveerde ERM eiwitten zich ophopen aan de groei kegel toonaangevende marge. Immunocytochemische etikettering van phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM) met F-actine vrij prikkeldraad eindigt. Gluteraldehyde (0,05%) en paraformaldehyde (0,05%) werden toegevoegd aan de eerste permeabilisatie buffer voor een min om ERM lokalisatie te behouden. Rhodamine-actine, rood, PERM, groen; phalloidin, blauw. Schaalbalk, 10 urn. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Stimulatie van actine polymerisatie vereist een actieve ERM eiwitten. Gedissocieerd DRG's waren co-getransfecteerd met GFP-actine en een GFP controle plasmide of een dominant-negatief Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) te bouwen. Het gebruik van GFP-actine maakt de identificatie van de getransfecteerde cellen na permeabilisatie. Hier werd NGF toegevoegd 5 minuten voorafgaand aan de etikettering van F-actine prikkeldraad eindigt. Let op de groei kegel getransfecteerd met DN ERM heeft prikkeldraad einde niveaus gereduceerd aan de groei kegel toonaangevende marge (lagere middenklasse panel), die in schril contrast met een nabijgelegen ongetransfecteerde groeikegel (onderste panelen), of met de GFP controle (bovenste middelste paneel). Rhodamine-actine, rood; GFP-actine, groen. Schaal van bars, 10 urn.

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+Understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Letourneau, P. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+P+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Oxford. 1139-1145 (2008).</li>
<li>Kalil, K., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Touch+and+go%3A+Guidance+cues+signal+to+the+growth+cone+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobio%22%5BJournal%5D)">Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton.</a> Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40, 209-227 (2003).</li>
<li>Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins+take+the+reins+in+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins take the reins in growth cones.</a> Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).</li>
<li>Guan, K. L., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+mediating+neuronal+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).</li>
<li>Gallo, G., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+growth+cone+actin+filaments+by+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues.</a> J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).</li>
<li>Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+filopodial+dynamics+through+actin-depolymerizing+factor%2Fcofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Sci+Inter%22%5BJournal%5D)">Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin.</a> Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).</li>
<li>Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin%3A+A+functional+node+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin: A functional node in cell biology.</a> Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).</li>
<li>Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ADF%2Fcofilin+mediates+attractive+growth+cone+turning+toward+nerve+growth+factor+and+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1.</a> Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).</li>
<li>Symons, M. H., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+polymerization+in+live+and+permeabilized+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts.</a> J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).</li>
<li>Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+stimulates+an+increase+in+actin+nucleation+and+filament+number+at+the+leading+edge+of+the+lamellipod+in+mammary+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.</a> J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).</li>
</ol>

De methoden die hier staat temporele en ruimtelijke resolutie van cellulaire componenten die in de dynamische verbouwing van het actine cytoskelet betrokken bij de toonaangevende marge van het migreren van de groei kegels. De actie van de lokstof moleculen, zoals NGF of netrine, om snel te stimuleren actine filament polymerisatie wordt onthuld als een lokale toename van de actine prikkeldraad eindigt, gecreëerd door actine filament verbreken door de activering van ADF / cofilin 10, zoals getoond in de figuren...

<table><tbody><tr><td>18x18 mm dekglas</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>35mm Petrischalen</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Aquariumkit</td><td></td><td>DAP 100% silicone aquariumkit</td><td>Elke bouwmarkt</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (mw &amp;gt; 300,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>Natuurlijke muis-laminine</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor 350 phalloïdine</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine niet-spieractine</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>F12 kweekmedium</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade </td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

labeling f-actine prikkeldraad eindigt op rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

De beweeglijke uiteinden van de groeiende axonen worden genoemd groei kegels. Groei kegels leiden navigeren axonen door het ontwikkelen van weefsels door interactie met lokaal uitgedrukt moleculaire begeleiding signalen dat de groei kegel-receptoren binden en reguleren van de dynamiek en de organisatie van de groei kegel cytoskelet 3-6. Het voornaamste doel van deze navigatie-signalen is het actine filament meshwork dat de groei kegel periferie en dat drijft de groei conus beweeglijkheid door middel van voortdurende actine polymerisatie en dynamische remodeling 7 vult. Positief of aantrekkelijk begeleiding signalen veroorzaken de groei kegel te draaien door het stimuleren van actine filament (F-actine) polymerisatie in de regio van de groei kegel periferie, dat is dichter bij de bron van de lokstof cue. Deze actine polymerisatie drijft lokale groeikegel uitsteken, hechting van de toonaangevende marge en axonale rek in de richting van de lokstof. Actinefilamenten polymerisatie is afhankelijk van de beschikbaarheid van voldoende actine monomeer en op de polymerisatie kernen of actine filament prikkeldraad eindigt voor de toevoeging van monomeer. Actine monomeer is overvloedig aanwezig in de kuiken het netvlies en de dorsale wortel ganglion (DRG) groei kegels. Bijgevolg, polymerisatie neemt snel toe als free F-actine prikkeldraad eindigt beschikbaar komen voor monomeer toevoeging. Dit gebeurt in het kuiken DRG en retinale groei kegels via de lokale activering van de F-actine verbreken eiwit actine depolymerizing factor (ADF / cofilin) ​​in de groeikegel regio dichter bij een attractant 8-10. Deze verhoogde ADF / cofilin activiteit Severs actine filamenten het creëren van nieuwe F-actine weerhaken uiteinden voor polymerisatie. De volgende methode demonstreert dit mechanisme. Totale gehalte aan F-actine wordt gevisualiseerd door kleuring met fluorescerende phalloidin. F-actine weerhaken uiteinden zijn gevisualiseerd door de incorporatie van rhodamine-actine in groei kegels die gepermeabiliseerd met de procedure beschreven in het volgende, dat is een bewerking van eerdere studies van andere beweeglijke cellen 11, 12. Wanneer rhodamine-actine wordt toegevoegd bij een concentratie boven de kritische concentratie voor actine monomeer naast prikkeldraad eindigt, rhodamine-actine monteert op gratis prikkeldraad eindigt. Als de aantrekkelijke cue wordt gepresenteerd in een verloop, zoals het vrijkomen van een micropipet geplaatst aan een kant van een groei kegel, zal de integratie van rhodamine-actine op F-actine prikkeldraad eindigt groter zijn in de groei kegel kant in de richting van de micropipet 10 . De groei kegels zijn klein en delicaat celstructuren. De procedures van permeabilisatie, rhodamine-actine oprichting, fixatie en fluorescentie visualisatie zijn allemaal zorgvuldig gebeuren en kan worden uitgevoerd op het podium van een omgekeerde microscoop. Deze methoden kunnen worden toegepast op het bestuderen van de lokale actine polymerisatie bij het migreren van neuronen, andere primaire weefsels cellen of cellijnen.

Een methode om te visualiseren en te kwantificeren F-actine weerhaken eindigt in neuronale groei kegels wordt beschreven. Na het kweken neuronen op glas dekglaasjes worden cellen gepermeabiliseerd met een saponine-bevattende oplossing. Dan, een korte incubatie met de saponine buffer met rhodamine-actine bevat fluorescerende actine op gratis actine prikkeldraad eindigt.

Labeling F-actine Prikkeldraad Eindigt op Rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei Cones

De beweeglijke uiteinden van groeiende axonen worden groeikegels genoemd. Groeikegels leiden navigerende axonen door ontwikkelende weefsels door interactie met lokale ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de locatie en het aantal vrije f-actine-barbed ends te visualiseren die beschikbaar zijn voor actinepolymerisatie in neuronale groeikegels die zijn blootgesteld aan axonale sturingssignalen. Dit wordt bereikt door neuronen, gekweekt op dekglasplaatjes, eerst te baden in een saponine-bevattende buffer om de groeikegels permeabel te maken. Vervolgens worden de cellen gedurende vier minuten blootgesteld aan een buffer met rhodamine-actine, zodat het rhodamine-actine de groeikegels kan binnendringen en kan polymeriseren op de vrije f-actine-barbed ends.Ten slotte worden de cellen chemisch gefixeerd en gespoeld om de distributie van F-actine te behouden. Gebarbed ends die rumine-actine hebben ingebouwd. Op basis van fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse worden resultaten verkregen die aantonen dat attractieve begeleidingssignalen het aantal vrije f-effectine verhogen.Barbed ends aan de voorzijde van migrerende groeikegels. Hallo, ik ben Paul Erno van de afdeling Neurowetenschappen van de University of Minnesota Medical School. Vandaag gaan we laten zien hoe je culturen van groeikegels van neuronen van kippen bereidt.We demonstriëren een methode om de barbed ends van actinefilamenten in groeikegels te visualiseren, de dynamische cytoskeletale componenten die axonen voorwaarts drijven terwijl ze door embryo's naar hun synaptische doelgebieden navigeren. Hoewel we deze methode gebruiken om actinedynamiek en zenuwgroeikegels te onderzoeken, kan deze worden toegepast op andere beweeglijke neurale cellen, zoals glia, neurale kamcellen of migrerende neuronen. We demonstreeren de procedures.Vandaag zullen laboratoriumleden Bonnie Marek, een postdoctoral fellow, en Jose San Miguel Ruiz, een MD PhD-student, de glazen dekglasjes van 18 millimeter vierkant of 24 millimeter rond, die worden gebruikt voor het labelen van neuronale actine, voorbereiden. Spoel deze met gedestilleerd water en bak ze gedurende drie maanden of langer in een droge hitteoven. Andere methoden voor het reinigen van dekglasjes kunnen in de plaats komen van het bakken in de oven. Boor met een kurkenboor of een ander instrument gaten van de juiste diameter in de bodems van plastic Petri- of weefselkweekschalen van 35 of 50 millimeter. Schraap vervolgens de randen van de geboorde gaten met een schaar om aan beide zijden een glad oppervlak te creëren.Vervolgens wordt een schoon dekglas met siliconen aquariumkit over het gat in elke petrischaal geplakt en worden de schalen meerdere malen gespoeld met steriel gedestilleerd water. De schalen zijn nu klaar voor het coaten van het substraat. Breng een oplossing van 100 micrograms per milliliter PDL en PBS aan op de dekglazen of videopetrischalen en incubeer deze gedurende twee tot vier uur in een bevochtigde incubator op 38 degrees Celsius.Zuig de PDL-oplossing af en spoel de dekglasjes drie keer met steriel gedestilleerd water en laat ze aan de lucht drogen. Maak vervolgens een 1% nitrocellulose-oplossing door vijf milligram nitrocellulose op te lossen in vijf milliliter amylacetaat. Breng 10 µL van deze oplossing aan op de bovenkant van een dekglasje en kantel dit om de vloeistof over het oppervlak te verspreiden; laat dit ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen.Smeer ten slotte 250 µL laminine van 25 µg/mL, of 4 µg/mL L1 cam en PBS, uit over het nitrocellulose-oppervlak. Incubeer zes tot acht uur in een bevochtigde incubator bij 38 °C. Aspireer vervolgens in een celkweekkap het substraat en voeg onmiddellijk kweekmedium toe, waarbij u ervoor zorgt dat het substraat niet uitdroogt.Explan.Culturen van dorsale wortelganglia of DRG's of neuronaal retinaal weefsel worden geprepareerd door dissectie van embryo's van zeven dagen oude kuikens. DRG-implantaten bestaan uit een half ganglion en retinale explantaten hebben een diameter van één millimeter of minder.Plaats de explan met een pincet op het dekglas onder een dissectiemicroscoop. Druk het vervolgens voorzichtig in het midden van het dekglas om beweging te voorkomen tijdens het transport naar de incubator. De schaaltjes met dekglas worden voorzichtig verplaatst en in een warme, bevochtigde incubator geplaatst voor een nacht of gedurende 18 uur.Gedurende deze periode groeien axonen van enkele honderden microns uit vanuit de explan. Bereid de rumine actine-permeatiebuffer voor gebruik door de volgende componenten toe te voegen: saponine A TP en LOR drie 50 fein. De samenstelling van deze buffer is beschreven in het schriftelijke protocol.Bereid een aparte oplossing voor met dezelfde componenten plus 0,45 micromolar ermine non-muscle actin T rate en vortex deze om te mengen om de neurale cellen te permeabiliseren en te labelen. Haal voorzichtig een kweekschaal met DRG- of retina-implantaten uit de incubator en voer de volgende stappen uit bij kamertemperatuur. Verwijder met een pipet voorzichtig het kweekmedium en voeg voldoende permeabilisatiebuffer toe om de cellen te bedekken; laat dit één minuut incuberen.Verwijder voorzichtig de permeabilisatiebuffer en vervang deze door de buffer die 0,45 micromolar rumine non-muscle actin bevat; laat dit vier minuten incuberen. Verwijder tot slot de buffer met rumine actine en fixeer de neuronen gedurende vijf minuten met 4%paraform aldehyde en 0,05%glutaraldehyde. Spoel voorzichtig met PBS en monteer met slow fade op glazen objectglazen van drie inch.Gebruik een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een 60 x olie-immersie objectief om de incorporatie van R-domine actine in f-actine, barbed ends, en de fluorescerende labeling van f-actine in groeikegels te visualiseren voor de beste kwantificering van de R-domine actine-incorporatie. Alle beelden moeten in één sessie worden verzameld, waarbij voor elk beeld dezelfde instellingen voor de digitale camerasensitiviteit, gain en belichting worden gebruikt. Analyseer de labeling van equivalente regio's met behulp van Metamorph Image J of een soortgelijke software voor beeldanalyse.Er kunnen ook verschillende variaties op deze procedure worden uitgevoerd. Eén variatie maakt gebruik van immunochemie om andere eiwitten te lokaliseren naast F-actine en barbed ends. Na het fixeren van het ingebouwde rumine actine en het spoelen met PBS kunnen antilichamen tegen een ander onderdeel van de groeikegel worden toegevoegd, gevolgd door spoelen, blokkeren en incubatie met een fluorescent secundair antilichaam dat geschikt is voor triple labeling met r domine actine en fluorescent falline.Een derde variatie beoordeelt de effecten van guidance-signalen op F-actine en vrije barbed ends door kweekschalen met een groeifactor of guidance-signaal gedurende vijf tot 15 minuten in de incubator te plaatsen, voordat de schaal uit de incubator wordt gehaald en de permeabilisatieprocedure wordt gestart. Dit maakt het mogelijk om de korte-termijneffecten van groeifactoren of guidance-signalen op actine en vrije barbed ends te beoordelen. Plaats alternatief een videoschotel met neuronale culturen op een verwarmde microscoopplaat en gebruik een micropipet om groeifactoren of guidance-signalen in een gradiënt bij de neuronale groeikegel vrij te laten voordat de permeabilisatie en de incorporatie van rhodamine-actine worden gestart.De groeifactoren kunnen gedurende slechts één tot twee minuten worden toegevoegd voordat de permeabilisatieprocedure wordt gestart. De permeabilisatie en fixatie kunnen worden uitgevoerd terwijl de videeschaal op de objecttafel van de microscoop blijft staan. Dit maakt het mogelijk om de lokale effecten van een gradiënt van sturingssignalen op de vorming van F ACT en vrije barbed ends in groeikegels te beoordelen.Deze video toont de snelle expansie van de rand van de modale groeikegel als reactie op de globale toevoeging van NGF. Wanneer een groeikegel van een DRG gedurende vijf minuten globaal wordt behandeld met nerve growth factor, wordt actinpolymerisatie gestimuleerd aan de voorste rand en is er een heldere band van rhumine actin-incorporatie zichtbaar rond de periferie van de groeikegel. Deze video toont een groeikegel die naar een micropipet buigt die NGF afgeeft en een NGF-gradiënt creëert, zoals hier getoond.Wanneer één zijde van een DRG-groeikegel gedurende twee minuten wordt blootgesteld aan een NGF-gradiënt, stimuleert dit lokaal een toename van de incorporatie van actine in F-actine en vrije barbed ends. In dit voorbeeld wordt de distributie van fosfo-ezrine onthuld via immunochemie. Naast het labelen van F-actine en vrije barbed ends door actine-incorporatie wanneer NGF hier globaal wordt toegevoegd, werden de DRG-neuronen co-getransfecteerd met GFP-actine en een dominant-negatief ezrine-construct. NGF werd vijf minuten vóór de labeling van de F-actine barbed ends toegevoegd.Merk op dat de groeikegel die is getransfecteerd met het dominant-negatieve ERM-construct weinig f-actine-barbed ends heeft aan de voorste rand van de groeikegel, wat contrasteert met een nabijgelegen niet-getransfecteerde groeikegel. Door deze procedure te combineren met immunochemie kan de lokalisatie van f-actine en barbed ends worden gerelateerd aan de distributie van andere eiwitten die de actine-dynamiek en -organisatie reguleren. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn om de delicate structuur van de axonale groeikegels niet te verstoren.

labeling-f-actin-barbed-ends-with-rhodamine-actin-permeabilized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en...

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

This video demonstrates the procedure for fluorescently staining rat cortical neurons for microscopy. It targets F-actin and dendritic proteins to analyze structural integrity and calculate F-actin density, which is crucial for studying neuronal function and health.

Quantification of Filamentous Actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Source: Alluri, H., et al. Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the fluorescent localization of tight junction proteins and stress fibers in rat brain microvascular endothelial cells (RBMECs). In the stressed monolayer, fluorescently labeled antibodies are used to tag the tight junction proteins, while fluorophore-tagged phalloidin labels the stress...

Fluorescence Localization of Tight Junction Proteins and Stress Fibers in Endothelial Cells

Filameuze actin (F-actin) speelt een belangrijke rol bij spinogenese, synaptische plasticiteit en synaptische stabiliteit. Kwantificering van F-actin punten is daarom een nuttig hulpmiddel om de integriteit van synaptische structuren te bestuderen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het kwantificeren van F-actin punten gelabeld met Phalloidin in primaire corticale neuronale culturen met lage dichtheid.

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

Axon-geleidingsmoleculen reguleren neuronale migratie en gerichte groei-kegel navigatie. We presenteren een krachtige methode, de stripe assay, om het vermogen van geleidingsmoleculen om neuronen aan te trekken of af te stoten te beoordelen. In dit protocol demonstreren we de stripe assay door de capaciteit van FLRT2 te laten zien om gekweekte hippocampale neuronen af te stoten.

Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Leer F-actine barbed ends visualiseren in neuronale groeikegels met rhodamine-actine en saponine-permeabilisatie. Deze methode kwantificeert actine-polymerisatie onder invloed van axonale geleidingsignalen.

Labeling F-actine Prikkeldraad Eindigt op Rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei Cones

Meer video's verkennen