A Procedure for the Purification of a Polyhistidine-Tagged Protein from Streptococcus mutans
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 4:28 min • October 30th, 2025
Take a culture of Streptococcus mutans expressing a polyhistidine-tagged protein secreted into the medium.
Centrifuge the culture and collect the protein-rich supernatant.
Add ammonium sulfate and incubate with stirring to precipitate proteins by reducing their solubility.
Transfer the solution to a tube, centrifuge, and discard the supernatant.
Resuspend the pellet in binding buffer containing salts and low imidazole to stabilize the protein.
Dialyze the solution against fresh binding buffer to remove excess salts.
Centrifuge the dialyzed solution to pellet insoluble debris, then filter the supernatant.
Mix the filtrate with nickel-charged affinity resin and incubate to allow selective binding of the polyhistidine-tagged protein to the nickel ions.
Load the mixture onto the chromatography column and wash with binding buffer to remove unbound proteins.
Next, add an elution buffer with high imidazole to displace histidine from nickel ions and release the polyhistidine-tagged protein.
Collect this eluate containing the purified proteins.
Centrifuge the bacterial culture suspension for 20 minutes at 10,000 times g at four degrees Celsius.
Transfer the culture supernatant into a three-liter glass beaker. To concentrate the proteins from the culture supernatant, place the two-liter supernatant on a magnetic stirrer and start vigorous stirring. Add 1,122 grams of ammonium sulfate and allow the precipitate to form with vigorous stirring at four degrees Celsius over a 4 hour period or overnight.
Next, centrifuge the ammonium sulfate precipitated solution at 15,000 times g for 20 minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant. With a spatula, collect the precipitate and transfer it into a 200-milliliter glass beaker.
Resuspend the pellets in 35 milliliters of binding buffer. Then, transfer each approximately 25 milliliters of the suspension into a regenerated cellulose dialysis tubing. Place the dialysis tubing into 2.5 liters of the stirring binding buffer on a stirrer at four degrees Celsius to dialyze the suspension.
Replace the dialysis solution after two hours and continue dialysis overnight. Next, transfer the dialyzed suspension from the tubing to centrifuge tubes and place the tubes in the centrifuge at 20,000 times g for 10 minutes at four degrees Celsius. With suction filtration equipment, pour the supernatant over a 0.2-micrometer membrane filter to filter.
Transfer the filtrate to a 75-milliliter flask.
To fractionate the polyhistidine-tagged gtfSI from the filtrated suspension, first prepare an immobilized metal affinity chromatography. After equilibrating the resin according to the manuscript, close the Hoffman pinch cock.
Add five milliliters of the filtered suspension into the column to make a slurry. Then, transfer all the slurry to the remaining filtered suspension and swirl the mixture gently for 30 minutes at four degrees Celsius. Load the mixture back into the column.
Open the Hoffman pinch cock to remove the suspension by the gravity flow. Wash the IMAC resin with 20 milliliters of binding buffer and then, elute 20 milliliters of elution buffer to obtain the recombinant gtfSI.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de zuivering van een polyhistidine-getagd eiwit uit Streptococcus mutans culturen. Het proces omvat ammoniumsulfaatprecipitatie, dialyse en geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC) om een hoge zuiverheid van het doeleiwit te bereiken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Microbiologie
- Eiwitzuivering
Achtergrond
- Streptococcus mutans is een belangrijke bacterie bij tandbederf.
- Polyhistidine-getagde eiwitten worden veelvuldig gebruikt bij eiwitzuivering.
- Affiniteitschromatografie is een krachtige techniek voor het isoleren van eiwitten.
- Kennis van eiwitzuiveringsmethoden is cruciaal voor biochemisch onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het zuiveren van polyhistidine-getagde eiwitten.
- Om de opbrengst en zuiverheid van het doeleiwit uit bacteriële culturen te verbeteren.
- Om een stapsgewijs protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie om het eiwitrijke supernatant van de bacteriële cellen te scheiden.
- Ammoniumsulfaatprecipitatie om eiwitten te concentreren.
- Dialyse om overtollige zouten uit de eiwitoplossing te verwijderen.
- Geïmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie voor selectieve eiwitbinding en elutie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle concentratie van polyhistidine-gelabelde eiwitten uit cultuursupernatant.
- Hoge zuiverheid van het doeleiwit bereikt via IMAC.
- Protocol toonde reproduceerbaarheid en efficiëntie aan bij eiwitzuivering.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het zuiveren van polyhistidine-getagde eiwitten.
- Het biedt een waardevolle bron voor onderzoekers die werken met Streptococcus mutans.
- Toekomstige toepassingen kunnen het bestuderen van de functionele eigenschappen van de gezuiverde eiwitten omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt een betrouwbare zuivering van gesecreteerde polyhistidine-getagde eiwitten uit bacteriële supernatten mogelijk, wat doelwitvalidatie bij de ontdekking van antimicrobiële middelen ondersteunt. De methode biedt een schaalbare aanpak om eiwitten van hoge zuiverheid te verkrijgen voor functionele en structurele studies die relevant zijn voor virulentiefactoren van Streptococcus mutans. Het faciliteert mechanische risicoreductie door reproduceerbare eiwitopbrengsten te leveren voor de ontwikkeling van downstream-assays.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om uitgescheiden virulentiefactoren zoals glucosyltransferasen te onderzoeken voor het testen van therapeutische hypothesen.
- Operationele waarde: Levert gezuiverd eiwit om target-engagement en het werkingsmechanisme in de vroege ontdekkingsfase te bevestigen.
Screening en assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert antigenisch zuiver eiwit dat geschikt is voor het ontwikkelen van bindings- of inhibitie-assays.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door een consistente eiwitkwaliteit en -concentratie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt structuur-functieanalyse van gezuiverde targets mogelijk om het ontwerp van inhibitoren te informeren.
- Operationele waarde: Levert materiaal voor preklinische validatie van targetmodulatie in ziekterelevante modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetidentificatie tot lead-optimalisatie door gezuiverde eiwitten te leveren voor biochemische karakterisering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing via functionele assays met gezuiverde gesecreteerde eiwitten.
- Screening: Maakt kwantitatieve read-outs mogelijk in bindings- of enzymatische assays waarvoor eiwitten van hoge zuiverheid vereist zijn.
- Analytics: Genereert meetbare resultaten zoals opbrengst, zuiverheid en activiteit voor go/no-go beslissingen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt targetvalidatie met preklinische evaluatie door middel van een consistente eiwitvoorziening.
- Bedrijfbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het zuiveren van gesecreteerde histidine-getagde eiwitten uit Gram-positieve bacteriën.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie door eiwitvariabiliteit te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde stappen voor precipitatie, dialyse en chromatografie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door betrouwbare eiwitproductie voor meerdere projecten mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten op basis van functionele eiwitgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering en chromatografie-technieken.
- Toegang tot centrifuges, dialyseapparatuur en IMAC-systemen is noodzakelijk.
- Standaardisatie van buffercondities tussen teams is vereist voor reproduceerbare resultaten.
- Er moet rekening worden gehouden met variabiliteit in secretieniveaus bij aanpassing aan verschillende eiwitdoelen.
- Beperkt tot eiwitten die oplosbaar en functioneel blijven na ammoniumsulfaatprecipitatie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag
Gerelateerde video's
0 Bekeken
High-throughput Zuivering van Affinity gemerkte recombinante eiwitten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
An Affinity Chromatography Technique for the Purification of a Recombinant Bacterial Protein
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Nickel Affinity Chromatography-Based Protein Purification: A Technique to Purify Polyhistidine-Tagged Recombinant Proteins from Bacterial Cell Lysate
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Residu-specifieke Opneming van noncanonical aminozuren in Eiwitten Model behulp van een
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026