Evaluating Mutation Frequency in Bacteria Using the Beta-Glucosidase Assay
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 4:00 min • October 30th, 2025
Take a culture of genetically modified bacteria.
The bacteria are induced to express a mutant variant of DNA polymerase with defective proofreading activity, which increases the chances of replication error.
These errors can lead to spontaneous mutations in the regulatory region, which derepress the beta-glucosidase gene and trigger the expression of the beta-glucosidase enzyme.
Collect samples at regular time intervals and evaluate the number of bacterial generations in each culture. Centrifuge the samples and discard the supernatant.
Resuspend the pellet in a buffer.
Add a permeabilizing solution and mix to permeabilize the bacterial membrane.
Transfer the permeabilized bacterial samples to a multi-well plate.
Add a substrate that enters the bacteria and reacts with the beta-glucosidase enzyme, producing a colored product.
Measure the color intensity to determine the beta-glucosidase activity.
Analyze the beta-glucosidase activity in the bacterial cultures to determine mutation frequency across generations.
Transfer a single colony of E. coli TOP10 containing the pBAD-ε and the pGOOD1-εD12A11 vectors to one milliliter of LB media treated with antibiotics.
Incubate the culture overnight at 37 degrees Celsius. The next morning, dilute the pre-culture 1 to 250 in three flasks containing 10 milliliters of fresh media. Add the inducers one millimolar each of arabinose, IPTG or arabinose and IPTG, and incubate the induced culture at 37 degrees Celsius for eight hours.
Prepare non-induced cultures in parallel. Collect one milliliter aliquots and dilute them one to 500 in new flasks containing 10 milliliters of fresh media, supplemented or not supplemented with inducers. Then incubate the mixture overnight at 37 degrees Celsius.
The next day, repeat the steps beginning with the dilution of the pre-culture and collect one milliliter aliquots. The aliquots are then placed in the freezer.
Next, determine the number of generations that have occurred in each culture. Transfer 100 microliters of appropriate serial dilutions of inoculum and culture on LB plates.
Incubate the plates overnight at 37 degrees Celsius. The following morning, count the colonies on the LB plates.
Calculate the log of the number of cells present in the inoculum or log I and in the culture at the end of growth or log C, and determine the number of generations.
Then centrifuge the culture at 5,000 gs for 20 minutes and resuspend the cells in one milliliter of 50 millimolar tris HCL, pH 7.6, 50 millimolar NaCl.
To permeabilize the cells, add two to three drops of chloroform and vortex for 20 seconds.
Finally, determine the glucosidase activity of each aliquot in a 96-well microplate.
Add 100 microliters of permeabilized cells and 100 microliters of using p-nitrophenyl-D-glucopyranoside substrate to each well, while avoiding the creation of air bubbles in the wells.
Read the absorbance at 420 nanometers using a microplate reader and filter.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de effecten van een mutante variant van DNA-polymerase in genetisch gemodificeerde bacteriën, waarbij de nadruk ligt op de resulterende mutaties en hun impact op de expressie van beta-glucosidase. Door bacteriële culturen over meerdere generaties te analyseren, beoogt het onderzoek de mutatiefrequentie en enzymactiviteit te kwantificeren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Genetische modificatie
- Enzymactiviteitsanalyse
Achtergrond
- Genetisch gemodificeerde bacteriën kunnen veranderde mutatiesnelheden vertonen.
- DNA-polymerasevarianten kunnen de replicatiegetrouwheid beïnvloeden.
- Beta-glucosidase is een belangrijk enzym in metabole processen.
- Inzicht in de mutatiefrequentie kan leiden tot nieuwe inzichten in de bacteriële evolutie.
Doel van de studie
- Om de mutatiefrequentie in bacteriële culturen te evalueren.
- Om de impact van mutaties op de expressie van bèta-glucosidase te beoordelen.
- Om een methode te ontwikkelen voor het meten van enzymactiviteit in permeabiliseerde cellen.
Gebruikte methoden
- Inductie van de expressie van mutant DNA-polymerase in bacteriële culturen.
- Regelmatige bemonstering en evaluatie van bacteriële generaties.
- Gebruik van permeabiliserende oplossingen om de enzymactiviteit te analyseren.
- Colorimetrische meting van de bèta-glucosidaseactiviteit met behulp van een substraat.
Belangrijkste resultaten
- Verhoogde mutatiesnelheden werden waargenomen in culturen die de mutante polymerase tot expressie brachten.
- De bètaglucosidase-activiteit correleerde met de mutatiefrequentie over de generaties heen.
- De ontwikkelde methode kwantificeerde effectief de enzymactiviteit in bacteriële monsters.
Conclusies
- De studie demonstreert de link tussen de getrouwheid van DNA-polymerase en mutatiesnelheden.
- Beta-glucosidase-expressie kan dienen als marker voor genetische veranderingen in bacteriën.
- Deze benadering kan worden toegepast om microbiële evolutie verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode maakt een kwantitatieve beoordeling van genetische instabiliteit in bacteriële systemen mogelijk, wat targetvalidatie ondersteunt door polymerase-getrouwheid te koppelen aan fenotypische read-outs. Het biedt een schaalbare, colorimetrische read-out voor het monitoren van mutatieaccumulatie over generaties heen, wat strategieën voor lead-identificatie informeert waarbij genetische stabiliteit van invloed is op de productconsistentie. De assay ondersteunt mechanistische risicoreductie in preklinische modellen door DNA-reparatiedefecten te correleren met functionele veranderingen in genexpressie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de getrouwheid van DNA-polymerase te koppelen aan de derepressie van reportergenen zoals bètaglucosidase.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via colorimetrische meting van enzymactiviteit als proxy voor mutatiefrequentie.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfolio-triage door genetische drift in productiestammen over tijd te kwantificeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt permeabiliseerde bacteriële lysaten voor op gestandaardiseerde, reproduceerbare screening in multi-well formaten.
- Kwantitatieve output: Genereert colorimetrische signalen die proportioneel zijn aan de beta-glucosidase-activiteit, wat dosis-respons- of tijdcourse-analyses mogelijk maakt.
- Herbruikbaarheid van platform: Ondersteunt screeningworkflows die read-outs van genetische stabiliteit vereisen in microbiële expressiesystemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt mutatiescreening in de ontdekkingsfase met preklinische evaluatie van de genetische stabiliteit in therapeutische bacteriële vectoren.
- Afstemming van biomarkers: Positioneert bèta-glucosidase-activiteit als een translationele biomarker voor de accumulatie van replicatiefouten in ziekterelevante systemen.
- Risicogebaseerde besluitvorming: Informeert go/no-go-criteria door de mutatiefrequentie te meten in geïnduceerde en niet-geïnduceerde kweekcondities.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen workflows van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waarbij genetische stabiliteit invloed heeft op het vertrouwen in het target en de consistentie van de productie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van DNA-reparatiemechanismen via induceerbare mutagenese en reportergenactivatie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve readouts van enzymactiviteit die compatibel zijn met 96-well-plaatformaten voor evaluatie met een medium doorvoer.
- Analytica: Maakt statistische vergelijking van de mutatiefrequentie over generaties heen mogelijk met behulp van absorbantiemetingen bij 420 nm.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug van screening op genetische instabiliteit naar preklinische vectorvalidatie door polymerase-defecten te koppelen aan functionele genexpressie.
- Bedrijfbrede hergebruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het monitoren van genetische drift in induceerbare microbiële systemen over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door polymerase-proofreadingdefecten te koppelen aan meetbare fenotypische output.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde stappen voor permeabilisatie, substraattoevoeging en kinetische meting.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige waarschuwingssignalen van genetische instabiliteit in expressie-hosts te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van stammen mogelijk op basis van gekwantificeerde mutatieaccumulatie over seriële passages.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van bacteriële culturen, induceerbare expressiesystemen en het ontwerp van spectrophotometrische assays.
- Afhankelijk van toegang tot microplate-readers die in staat zijn tot absorbentiemeting bij 420 nm en standaard microbiologische instrumentatie.
- Vereist cross-team standaardisatie van de inductietijd, bemonsteringsintervallen en permeabilisatieprotocollen voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het overdragen van de assay naar verschillende bacteriële stammen of reportersystemen anders dan bèta-glucosidase.
- Bevat praktische beperkingen zoals potentiële substraattoxiciteit, effecten van chloroform op de membraanintegriteit en signaallineariteit afhankelijk van de celdichtheid.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Meten van microbiële mutatie snelheden met de fluctuatie test
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Transgene knaagdieren Assay voor het kwantificeren van Male Germ Cell Mutant Frequency
Gerelateerde video's
0 Bekeken
De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Transformatie van probiotische gist en hun herstel van gastro-intestinale Immune Tissues Na orale sondevoeding in Muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Geregisseerd Evolution Method in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026