Extraction of Apoplastic Bacteria Using a Syringe-Based Pressure Method
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:28 min • November 28th, 2025
Take an Arabidopsis plant with leaves pre-inoculated with bacteria to study plant-microbe interactions.
These bacteria proliferate in the apoplast, the intercellular space between plant cells, forming microcolonies.
Once apoplastic colonization is established, excise the leaves and place them into a needleless syringe.
Add distilled water to cover the tissue.
Insert the plunger, then hold the syringe upright, tap it, and adjust the plunger to release any trapped air.
Seal the tip with parafilm to create a closed chamber for apoplast extraction.
Apply positive pressure by pushing the plunger until the tissue turns dark, indicating compression and water entry into the intercellular spaces to dislodge bacteria.
Next, apply negative pressure by pulling the plunger to expand the tissue matrix and draw out fluid and bacteria.
Repeat the pressure cycles to generate shear forces that disrupt microcolonies, releasing bacteria without damaging the plant tissue.
Unseal the syringe and collect the apoplastic fluid containing dispersed bacteria for further analysis.
Four days after inoculation, cut either the aerial part of the Arabidopsis plant or the inoculated leaf from the bean plant and place it into a 20-milliliter syringe without a needle.
For bean leaves, roll the leaf on itself, leaving the abaxial face outward. Add enough volume of distilled water to cover the tissue. Then, insert the plunger holding the syringe in an upright position and remove the excess air and air bubbles inside the syringe by gently tapping the barrel until all the air is located near the tip, and, after removing the air, cover the tip of the syringe barrel with paraffin film.
Now carefully press the plunger to generate positive pressure until the tissue turns darker. Then, pull the plunger to generate negative pressure. Remove the paraffin film and the plunger and collect the fluid containing the apoplast-extracted bacteria.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het extraheren van apoplastische vloeistof uit Arabidopsis- en bonenplanten om plant-microbe-interacties te bestuderen. Het proces omvat het creëren van een gesloten kamer om positieve en negatieve druk toe te passen, wat het losmaken van bacteriën uit plantenweefsels vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Plantbiologie
- Microbiologie
- Plant-microbe interacties
Achtergrond
- Het begrijpen van interacties tussen planten en microben is cruciaal voor landbouwkundige vooruitgang.
- Apoplastisch vocht bevat belangrijke informatie over microbiële kolonisatie.
- Arabidopsis en boonplanten dienen als modelorganismen in plantonderzoek.
- Effectieve extractiemethoden zijn noodzakelijk voor het analyseren van microbiële gemeenschappen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het extraheren van apoplastische vloeistof uit planteweefsels.
- Het onderzoeken van de dynamiek van bacteriële kolonisatie in planten.
- Het faciliteren van verdere analyse van de geëxtraheerde vloeistof op microbieel gehalte.
Gebruikte methoden
- Pre-inoculatie van Arabidopsis-bladeren met bacteriën.
- Gebruik van een naaldloze spuit voor vloeistofextractie.
- Toepassing van positieve en negatieve druk om bacteriën los te maken.
- Verzameling van apoplastische vloeistof voor daaropvolgende analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van apoplastisch vocht met daarin bacteriën.
- Demonstratie van de effectiviteit van drukcycli bij het losmaken van microkolonies.
- Vestiging van een protocol voor het bestuderen van interacties tussen planten en microben.
- Inzicht in het gedrag van bacteriën in de apoplast.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die plant-microbe-interacties bestuderen.
- Verdere studies kunnen de geëxtraheerde vloeistof gebruiken voor microbiële analyse.
- Het begrijpen van deze interacties kan leiden tot verbeterde landbouwpraktijken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode maakt een betrouwbare extractie van apoplastische bacteriën uit plantenweefsels mogelijk, wat mechanistische studies naar gastheer-pathogeeninteracties ondersteunt die relevant zijn voor de validatie van agrochemische targets. Door debris-vrije monsters op te leveren die geschikt zijn voor single-cell-analyse, wordt de voorspellende betrouwbaarheid in vroege ontdekkingspijplijnen gericht op plantbeschermingsmiddelen vergroot. De aanpak lost een belangrijke technische bottleneck op bij het bestuderen van intracellulair microbieel gedrag zonder weefselschade, wat de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische evaluatie faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de bacteriële genexpressie in de apoplast te onderzoeken om targets die betrokken zijn bij plantkolonisatie te valideren.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare toegang tot microbiële populaties in hun natuurlijke intercellulaire niche voor functionele screening.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde bacteriële monsters voor voor downstream fenotypische of omics-gebaseerde screeningsassays.
- Operationele waarde: Waarborgt monsterconsistentie en vermindert variabiliteit in high-throughput workflows voor de analyse van apoplastische microben.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelateerde systeemmodellering door het apoplastische micro-milieu tijdens extractie te behouden.
- Operationele waarde: Faciliteert longitudinale bemonstering om microbiële dynamiek over verschillende infectiestadia te volgen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege ontdekkingsworkflows waarbij inzicht in het gedrag van apoplastische bacteriën bijdraagt aan de selectie van targets en lead-optimalisatie voor oplossingen voor plantgezondheid.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot bacteriële adaptatie en microkolonievorming in planta.
- Screening: Maakt de bereiding van gestandaardiseerde inocula mogelijk voor het testen van de effectiviteit van verbindingen tegen apoplastische pathogenen.
- Analytics: Levert kwantificeerbare bacteriële outputs op die geschikt zijn voor single-cell RNA-seq of metabolietprofilering.
- Translational Research: Verbindt apoplastische kolonisatiefenotypes met preklinische effectiviteitsmodellen in plant-microbe-systemen.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbaar platform voor het extraheren van microben uit diverse plantenweefsels over meerdere projecten heen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door directe analyse van bacteriën in het apoplastische compartiment mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van apoplastische bemonstering in vergelijking met vacuüminfiltratie- of centrifugatiemethoden.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door betrouwbare gegevens te verschaffen over target-engagement binnen de intercellulaire ruimte van de plant.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van bewijzen voor apoplastische effectiviteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in plant-microbe co-cultuur en steriele weefselbehandeling.
- Toegang tot drukapparatuur op basis van spuiten en paraffinefolie voor afdichting.
- Standaardisatie van drukcycli en weefselvoorbereiding tussen laboratoria.
- Overwegingen voor aanpassingen bij variërende blad dikte en apoplastisch volume tussen plantensoorten.
- Beperking: Methode is geoptimaliseerd voor apoplastische kolonisatoren; endofytische of epifytische populaties worden mogelijk niet in gelijke mate geëxtraheerd.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Op Applast gebaseerde methode om de zuiverheid van plantaardig geproduceerd recombinant eiwit te verbeteren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Extraction and Purification of Plastoglobules from Photosynthetic Bacteria
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Mouse Bladder Epithelial Cells Containing Intracellular Bacterial Communities
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Intracellular Pathogenic Bacteria from Infected Host Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Inoculating a Bacterial Pathogen into Arabidopsis Leaves via Vacuum Infiltration
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Single-Cell Analysis of Gene Expression from Plant-Extracted Pathogens
Gerelateerde video's
0 Bekeken
De Infiltratie-centrifugeren Techniek voor de extractie van apoplastische Fluid uit bladeren van de planten met behulp van Phaseolus vulgaris Als een voorbeeld
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026