Transfection of an Inducible Gene Expression System into Cells Expressing a Bacterial Effector Protein
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:43 min • November 28th, 2025
Take test human cells expressing CaeB, an anti-apoptotic bacterial protein.
Use cells lacking CaeB as the control.
Introduce a transfection reagent complexed with a tetracycline-inducible gene expression system containing both regulator and response plasmids.
The regulator plasmid encodes a transcriptional activator and silencer, while the response plasmid encodes a pro-apoptotic protein controlled by TRE.
Incubate the cells to facilitate plasmid uptake and regulatory protein expression.
Without tetracycline, the activator remains inactive, and the silencer represses TRE-driven transcription.
Add a tetracycline analog and incubate.
The analog enables activator–TRE binding, initiating pro-apoptotic protein expression.
In control cells, this triggers apoptotic signaling, activating an apoptotic marker.
In CaeB-expressing cells, CaeB inhibits apoptotic signaling, reducing the marker activation.
A reduced marker activation in CaeB-expressing cells suggests that CaeB inhibits apoptosis.
Begin this procedure by seeding HEK293 cells stably expressing GFP or GFP-CaeB in a 12 well plate at a density of 100,000 cells per well.
Next, prepare DNA and polyethylenimine transfection reagent separately in 75 microliters of Opti-MEM medium, and incubate for five minutes at room temperature. For complex formation, incubate both mixtures together for 15 minutes at room temperature. After that, add the polyethylenimine DNA solution dropwise to the cells and incubate at 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide.
Five hours after transfection induce expression of the pro apoptotic proteins by adding one microgram per milliliter of doxycycline to the culture medium. Then, incubate the cells for 18 hours at 37 degrees Celsius in 5% carbon dioxide.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van CaeB, een anti-apoptotisch bacterieel eiwit, bij het moduleren van apoptose in menselijke cellen. Door gebruik te maken van een tetracycline-induceerbaar genexpressiesysteem worden de effecten van CaeB op pro-apoptotische signalering onderzocht.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Apoptose
- Genexpressie
Achtergrond
- Het is bekend dat CaeB apoptose remt in diverse cellulaire contexten.
- Het begrijpen van de mechanismen van apoptose is cruciaal voor therapeutische interventies.
- Transfectietechnieken maken het mogelijk om de genfunctie in levende cellen te bestuderen.
- Tetracycline-induceerbare systemen maken een gecontroleerde expressie van doelgenen mogelijk.
Doel van de studie
- Om het effect van CaeB op de expressie van pro-apoptotische eiwitten te bepalen.
- Om de rol van CaeB in apoptotische signaleringspaden te beoordelen.
- Om een gecontroleerd genexpressiesysteem te gebruiken voor nauwkeurige experimentele resultaten.
Gebruikte methoden
- Menselijke HEK293-cellen die CaeB tot expressie brachten, werden gebruikt samen met controlecellen.
- Er werd gebruikgemaakt van een tetracycline-induceerbaar genexpressiesysteem.
- Cellen werden getransfecteerd met plasmiden die coderen voor pro-apoptotische eiwitten.
- Apoptotische signalering werd beoordeeld via markeractivatie.
Belangrijkste resultaten
- CaeB-expresserende cellen vertoonden een verminderde activering van apoptotische markers.
- Controlecellen vertoonden typische apoptotische signalering na inductie.
- De aanwezigheid van CaeB remde de pro-apoptotische signalering significant.
- De resultaten suggereren dat CaeB een beschermende rol speelt tegen apoptose.
Conclusies
- CaeB remt effectief apoptose in menselijke cellen.
- Deze studie benadrukt het potentieel van CaeB voor therapeutische toepassingen.
- Verder onderzoek is nodig om de werkingsmechanismen van CaeB te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Induceerbare genexpressiesystemen maken een nauwkeurige analyse van gastheer-pathogeeninteracties en mechanische risicoanalyse in de vroege ontdekkingsfase mogelijk. Deze aanpak stelt biofarmaceutische teams in staat om precies vast te stellen waar bacteriële effectoren, zoals CaeB, kritieke signaleringsroutes zoals apoptose verstoren. Dergelijke mechanische duidelijkheid ondersteunt het voorspellende vertrouwen en informeert beslissingen over targetvalidatie in de gehele ontdekkingspijplijn.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele dissectie mogelijk van de impact van effector-eiwitten op signaleringsroutes van de gastheer.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door het punt van verstoring van de signaalroute te isoleren.
- Faciliteert robuuste targetvalidatie via gecontroleerde geninductie en kwantitatieve read-outs.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde cellulaire systemen voor voor downstream screening van modulatoren of inhibitoren.
- Standaardiseert assay-condities door middel van induceerbare expressie voor reproduceerbare resultaten.
- Maakt kwantitatieve meting van pathway-activiteit mogelijk via activatie van apoptotische markers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt mechanistische bevindingen uit met ziekterelelevante pathways voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door de impact van effectoren op beslissingen over het cellot te verduidelijken.
- Biedt een platform voor het evalueren van kandidaat-interventies in een gecontroleerde genetische context.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit induceerbare systeem integreert op het grensvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, ter ondersteuning van hypothese-gestuurde onderzoeken naar signaalpaden en de gereedheid van assays voor screeningscampagnes.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt het testen van nulhypothesen mogelijk om effector-eiwitmechanismen in gastheercellen te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gegevens over apoptotische markers voor comparatieve analyse.
- Analyses: Biedt heldere statistische resultaten om pathway-modulatie door effectoren te onderscheiden.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische inzichten en de selectie van preklinische modellen wanneer de relevantie van de pathway is vastgesteld.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Biedt een modulair, induceerbaar platform dat aanpasbaar is voor diverse effector-targetstudies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in relaties tussen target en pathway en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standardiseert experimentele condities voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over teams heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door biologische risico's vroeg in de pipeline te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en mechanismen voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in mammalian celkweek en transfectietechnieken.
- Toegang tot induceerbare genexpressievectoren en compatibele analytische assays is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van inductieprotocollen en markerkwantificering tussen teams.
- Aanpassing voor verschillende cellijnen of effectorproteïnen kan vereist zijn.
- Afhankelijk van een robuuste statistische analyse voor de interpretatie van kwantitatieve markergegevens.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door Coxiella burnetii Tijdens siRNA Silencing
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in E. coli Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Inducible Expression of Histidine-Tagged Ricin Toxin A Chain in E. coli
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Introduction of Bacterial Effector Proteins into Mammalian Cells by Electroporation
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Transiënte expressie en cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten in gekweekte insectencellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026