Detectie van doelenzymexpressie in genetisch gemodificeerde bacteriecellen

Begin met buisjes die genetisch gemodificeerde bacteriecellen bevatten. Elke bacterie draagt fosmiden met een hoog aantal kopieën die verschillende enzymen coderen.

Incubeer de buisjes met schudden om de expressie van verschillende intracellulaire enzymen te vergemakkelijken.

Voeg een substraat toe dat specifiek is voor het doelenzym aan het testbuisje en voeg een gelijk volume buffer toe aan het controlebuisje.

Incubeer met schudden. Het substraat komt de cellen binnen, waar de doelenzym het splitsen, waardoor een fluorescerend product wordt gevormd.

Laad het controlebuisje in een vooraf gekalibreerd flowcytometer.

Terwijl elke cel door een laserstraal gaat, verspreidt deze licht. Genereer een spreidingsplot om enkele cellen te identificeren, die minder licht verspreiden dan klonten.

Sluit de celklonten uit en plot het fluorescentiesignaal van de enkele cellen om de baseline fluorescentie vast te stellen.

Plaats het met substraat behandelde buisje in de flowcytometer om het fluorescentiesignaal te meten.

Een verhoogd fluorescentiesignaal in met substraat behandelde cellen in vergelijking met de controlecellen bevestigt de expressie van het doelenzym.

Om de metagenomic enzymen van belang te screenen, incubeer de gesorteerd cellen bij 37 graden Celsius en 200 RPM tot de OD₆₀₀ 0,5 bereikt. Voeg vervolgens 1 microliter kopie-inductie-oplossing toe om het intracellulaire fosmid-kopienummer te versterken.

Na drie uur bij 37 graden Celsius en 250 RPM combineer 0,5 milliliter van de cellen met het geschikte substraat in een ronde 14 milliliter buis tot een eindconcentratie van 100 micromolar. Incubeer vervolgens de controle- en experimentele monsters bij 37 graden Celsius en 200 RPM nog eens drie uur.

Terwijl de monsters schudden, stel de FACS-machineparameters in zoals net gedemonstreerd. Voeg vervolgens 5 microliter cellen van elk monster toe aan individuele ronde 5 milliliter buisjes die 1 milliliter PBS bevatten. Laad vervolgens de monstercellen en stel de gebeurtenissnelheid in op 1000 tot 3000 gebeurtenissen per seconde.

Maak een log-geschaald voorwaarts verspreidingsgebied versus log-geschaald zijwaarts verspreidingsgebied spreidingsplot en pas de R1 spreidingspoort aan om de bacteriële cellen met enkele gebeurtenissen te omvatten. Maak vervolgens een log-geschaald voorwaarts verspreidingsgebied versus log-geschaald FITC-gebied spreidingsplot en stel een R2 sorteerpoort in zodat minder dan 0,1% van de negatieve cellen worden gedetecteerd. Laad nu het monsterbuisje en pas de gebeurtenissnelheid zo nodig opnieuw aan op 1000 tot 3000 gebeurtenissen per seconde.