Waarom is het toetsen van de nulhypothese van belang voor target-validatie op basis van FISH?

Het testen van de nulhypothese in FISH-experimenten zorgt ervoor dat de waargenomen bacteriële lokalisatie statistisch significant is en niet het gevolg is van willekeurige sondebinding. Deze striktheid ondersteunt een betrouwbare validatie van het target en vermindert het risico op fout-positieven in microbiomeonderzoek. Betrouwbare statistische resultaten zijn essentieel voor het verder brengen van kandidaten in de discovery pipeline.

Hoe past de isolatie van de onafhankelijke variabele in de hybridisatie van FISH-probes?

Het isoleren van variabelen, zoals de sondeconcentratie en de incubatietemperatuur, stelt teams in staat om waargenomen hybridisatiesignalen specifiek toe te schrijven aan bacterieel 16S rRNA. Deze controle is essentieel voor de reproduceerbaarheid en voor het onderscheiden van werkelijke biologische effecten van technische artefacten in vroege discovery-workflows.

Wat maken kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen mogelijk bij confocale beeldvorming?

Kwantitatieve beeldvorming van FISH-gelabelde bacteriën maakt een nauwkeurige bepaling van de microbiële abundantie en ruimtelijke distributie binnen weefselcoupes mogelijk. Deze metingen ondersteunen vergelijkende analyses tussen experimentele groepen en dienen als basis voor de ontwikkeling van downstream assays en de selectie van modellen.

Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor cross-functionele FISH-studies?

Replicatie waarborgt dat FISH-gebaseerde bevindingen robuust en reproduceerbaar zijn tussen verschillende operators en experimentele runs. Deze betrouwbaarheid is essentieel voor cross-functionele samenwerking, waardoor data-integratie en besluitvorming mogelijk worden tussen discovery-, screening- en translationele teams.

Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist vóór de implementatie van FISH?

Teams moeten uitgerust zijn om kwantitatieve beeldanalyse uit te voeren, signaal-ruisverhoudingen te beoordelen en passende statistische tests toe te passen om de specificiteit en lokalisatie van de probes te valideren. Deze capaciteiten zijn noodzakelijk om de datakwaliteit te waarborgen en een betrouwde voortgang van microbiome-gerelateerde programma's te ondersteunen.

Fluorescence In Situ Hybridization of Gut Bacteria in Mouse Intestinal Sections

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiologie

0 weergaven • 3:42 min • January 30th, 2026

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begin by adding a solution containing bacterial 16S rRNA-specific Fluorescence in situ hybridization (FISH) probes to a slide containing the mouse intestinal sections colonized by bacteria.

Place a coverslip to spread the liquid containing probes and prevent evaporation.

Incubate the slide in a humidified chamber at an elevated temperature.

This unfolds the RNA secondary structure, facilitating hybridization of the probe with complementary sequences in bacterial 16S rRNA.

Remove the coverslip and incubate the slide in a pre-warmed washing buffer to remove unbound probes.

Rinse with a phosphate buffer to maintain physiological pH.

Apply a counterstain containing a mucus-specific dye and a nuclear dye, and incubate.

These dyes selectively bind to intestinal mucus and to the DNA of bacterial and host cells. Wash the slide with a buffer and mount coverslips onto the slide using mounting media.

Under a confocal microscope, observe distinct FISH-labeled bacteria, intestinal cells, and the mucus layer within the sections.

Create very close circles around each tissue section using a liquid blocker or PAP pen to limit the area of expansion needed to be covered by the hybridization solution, avoiding ink contact with the section.

Prepare the hybridization solution and add 0.5 micrograms of probe for every 50 microliters of the solution used. Pipette the solution onto the sections on the slide. Overlay the section with flexible plastic coverslips, ensuring that the volume of liquid used covers the entire section.

Create a humid chamber with a pipette tip box with wipes or paper towels that have been soaked with excess hybridization solution or PBS to provide humidity. Incubate the slide in the humid chamber at 45 to 50 degrees Celsius for at least three hours depending on the probe set to reduce evaporation. Remove the plastic coverslips, and incubate the slides in FISH washing buffer in a Coplin jar, both prewarmed to 50 degrees Celsius.

Place the Coplin jar back into the 50 degree Celsius oven for 10 to 20 minutes. Remove the FISH washing buffer and replace it with PBS in the Coplin jar. Immediately after refilling the Coplin jar with PBS, decant the PBS.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 15 augustus 2026

Fluorescence In Situ Hybridization of Gut Bacteria in Mouse Intestinal Sections

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschapsgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële relevantie voor directie

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele en Bedrijfsimpact

Overwegingen voor de implementatie

Biopharma Veelgestelde Vragen

Gebruik van Anti-phospho-girdin antilichamen te visualiseren van intestinale Tuft cellen in zwevende muis Jejunum cryosecties

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel

Using Fluorescence-Mediated Tomography to Assess Murine Intestinal Inflammation

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Detectie van weefsel-Resident bacteriën in blaas biopsies door 16S rRNA fluorescentie in situ hybridisatie

Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren