Isolation of Mouse Bladder Epithelial Cells Containing Intracellular Bacterial Communities
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:56 min • February 2nd, 2026
Begin with bladder epithelial cells scraped from a mouse bladder infected with fluorescently labeled uropathogenic E. coli.
During infection, these bacteria invade epithelial cells and form intracellular bacterial communities, or IBCs—biofilm-like structures that protect them from host immune defenses.
Under a dissecting microscope, identify IBCs as large fluorescent aggregates confined within individual epithelial cells.
Assemble a mouth micropipetting setup using a pulled glass capillary connected to an aspirating pipette to isolate single IBC-containing epithelial cells.
Briefly dip the capillary tip into PBS to reduce capillary-driven fluid uptake.
Position the capillary near the selected fluorescent epithelial cell and apply gentle suction to draw in a single IBC-containing cell, avoiding uninfected cells and extracellular bacteria.
Expel the cell into a sterile microcentrifuge tube using slight positive pressure, preserving bacterial viability.
This method enables the isolation of epithelial cells harboring IBCs for single-cell analysis.
When all of the cells have been scraped, insert the unpulled end of a pulled glass capillary into the rubber plug of an aspirator tube and tightly fit the narrow end of a 1 milliliter pipette tip into the other open end of the tube.
Tightly fit the narrow end of a 2 milliliter aspirating pipette into the open, wider end of the 1 milliliter pipette tip and place the scraped cell suspension under a dissecting microscope. Using a 20 to 40X magnification, identify the IBCs as large fluorescent aggregates and dip the fine end of the glass capillary into a fresh tube of PBS for 1 second to reduce the uptake of unwanted volume through capillary action.
When an IBC of interest has been located, slowly bring the open end of the capillary tube toward the IBC and apply a very small suction force to the aspirating pipette to guide the IBC into the glass capillary. Then, move the capillary to an empty 1.5 milliliter centrifuge tube and apply a slight positive pressure to expel the droplet and the IBC into the tube.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van intracellulaire bacteriële gemeenschappen (IBC's) uit blasepitheelcellen die geïnfecteerd zijn met uropathogene E. coli. Deze techniek maakt de analyse van individuele IBC-bevattende cellen mogelijk, wat inzicht geeft in het gedrag van bacteriën binnen gastheercellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Infectieziekten
Achtergrond
- Uropathogene E. coli kunnen blaas-epitheelcellen binnendringen.
- IBC's zijn biofilm-achtige structuren die bacteriën beschermen tegen immuunresponsen.
- Inzicht in IBC's kan helpen bij de ontwikkeling van behandelingen voor urineweginfecties.
- Single-cell analyse is essentieel voor het bestuderen van bacteriële interacties binnen gastheercellen.
Doel van de studie
- Om epitheelcellen die IBC's bevatten te isoleren voor gedetailleerde analyse.
- Om de dynamiek van bacteriële gemeenschappen binnen gastheercellen te begrijpen.
- Om de kennis over bacteriële overlevingsmechanismen in de urinewegen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Afschrapen van blasepitheelcellen van geïnfecteerde muizen.
- Gebruik van een dissectiemicroscoop om fluorescerende IBC's te identificeren.
- Gebruik van een micropipetteeropstelling om individuele cellen die IBC's bevatten te isoleren.
- Behoud van de bacteriële levensvatbaarheid tijdens het isolatieproces.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van epitheelcellen die IBC's bevatten.
- Identificatie van IBC's als grote fluorescerende aggregaten.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor enkelcelanalyse.
- Inzichten in de beschermingsmechanismen van IBC's tegen de afweer van de gastheer.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare benadering om IBC's in blaas-epitheelcellen te bestuderen.
- Geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek naar bacteriële pathogenese.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van urineweginfecties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het isoleren van intracellulaire bacteriële gemeenschappen (IBC's) uit epitheelcellen van de gastheer maakt het mogelijk om mechanistische risico's van antimicrobiële targets in modellen voor urineweginfecties te verminderen. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door bacteriële overlevingsmechanismen binnen fysiologisch relevante gasthecelomgevingen te onthullen. De methode biedt voorspellende zekerheid voor de identificatie van lead-compounds door intracellulaire persistentie te koppelen aan therapeutische effectiviteit.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door levensvatige IBC-bevattende epitheelcellen te isoleren voor functionele beoordeling van targets.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe observatie van antibiotica-beschermde bacteriële populaties.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door intracellulaire persistentiemechanismen te koppelen aan behandelingsuitkomsten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde gastheer-pathogeensystemen voor voor downstream compound-screening tegen intracellulaire reservoirs.
- Kwantitatieve output: Genereert enkelcel-isolaten die fluorescentiegebaseerde read-outs of sequencing mogelijk maken voor high-content analyse.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert isolatie via handmatige micropipettering om een consistente terugwinning van IBC-bevattende cellen over experimenten heen te garanderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Maakt gebruik van een muismodel voor urineweginfecties om translationele continuïteit te waarborgen van ontdekking tot preklinische validatie.
- Mechanistische risicoreductie: Richt zich op intracellulaire overlevingspaden om onduidelijkheid bij de selectie van targets te verminderen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door targets te valideren binnen beschermde bacteriële niches.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen workflows voor vroege ontdekking, waardoor hypothesetestings mogelijk is vóór de identificatie van lead-verbindingen en de preklinische continuïteit wordt ondersteund door mechanistisch inzicht.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van pathways door het isoleren van cellen die biofilm-achtige IBC's bevatten voor targetinterrogatie.
- Screening: Levert assay-klare individuele cellen voor het evalueren van de penetratie van verbindingen in intracellulaire compartimenten.
- Analytica: Levert levensvatbare isolaten voor fluorescentiekwantificatie of RNA-seq om behandelingseffecten te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanismen van intracellulaire persistentie met preklinische werkzaamheidsmodellen bij urineweginfecties.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform voor het bestuderen van intracellulaire pathogenen in verschillende infectiemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door intracellulaire lokalisatie te koppelen aan fenotypische resistentie.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde micropipetteerparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door targets in een vroeg stadium van de discovery-pipeline te de-risken.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van antibiotica met intracellulaire activiteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microscopie- en micropipetteertechnieken voor isolatie van individuele cellen.
- Is afhankelijk van fluorescentielabeling en de infrastructuur van een dissectiemicroscoop voor de detectie van IBC.
- Vereist standaardisatie tussen operators om consistentie in celherstel en levensvatbaarheid te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende epitheliale celtypen of pathogeenmodellen.
- Wordt beperkt door de handmatige doorvoersnelheid, wat de schaalbaarheid voor grote screeningcampagnes kan beperken.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Preparation of Mouse Bladder Tissue for Visualization of Bacterial Infection
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualizing Intracellular Bacterial Communities in an Infected Mouse Bladder
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Transurethral Catheterization and Bacterial Inoculation to Generate a Urinary Tract Infection Model in Male Mice
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Establishment of a Urinary Tract Infection Model in Female Mice
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van darmen gliale cellen uit de Submucosa en de Lamina Propria van de volwassen muis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie van weefsel-Resident bacteriën in blaas biopsies door 16S rRNA fluorescentie in situ hybridisatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026