Waarom is het tellen van kolonies belangrijk voor targetvalidatie bij de ontdekking van antimicrobiële middelen?

Kolonietelling biedt een kwantitatieve maat voor de bacteriële last in de darm, waardoor een directe beoordeling van de pathogene last in geïnfecteerde zebravissen mogelijk is. Deze output ondersteunt de validatie van targets door onderzoekers in staat te stellen te evalueren of een verbinding de kolonisatie door Vibrio cholerae vermindert in een ziekterelevant systeem. De methode levert meetbare eindpunten die bijdragen aan beslissingen over lead-identificatie en mechanistische risicoreductie.

Hoe draagt het isoleren van het maag-darmstelsel bij aan een verbeterde meting van de afhankelijke variabele in infectiemodellen?

Het isoleren van het darmkanaal zorgt ervoor dat de bacteriële kwantificering de kolonisatie weerspiegelt in de primaire locatie van de Vibrio cholerae-infectie, waardoor verstorende signalen van andere weefsels worden geminimaliseerd. Deze isolatie van de onafhankelijke variabele verhoogt de specificiteit van de afhankelijke variabele — colony-forming units — als een ware indicator van de pathogenenlast. De procedure ondersteunt betrouwbare metingen van de afhankelijke variabele, die cruciaal zijn voor assayontwikkeling en screeningstoepassingen.

Wat maken kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabelen mogelijk bij de preklinische evaluatie van antimicrobiële middelen?

Kwantitatieve kolonietellingen maken een nauwkeurige vergelijking van de bacteriële belasting tussen behandelings- en controlegroepen mogelijk, wat dosis-responsanalyse en de effectiviteitsrangschikking van verbindingen vergemakkelijkt. Deze metingen ondersteunen statistische analyses die teams helpen om significante reducties in kolonisatie vast te stellen, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen. De gegenereerde gegevens helpen bij het vaststellen van voorspellende betrouwbaarheid voor lead-optimalisatiecampagnes.

Waarom zijn replicatie-eisen belangrijk voor cross-functionele samenwerking in studies naar infectiemodellen?

Replicatie-eisen waarborgen dat metingen van de bacteriële load consistent zijn over experimenten heen, waardoor een betrouwbare gegevensuitwisseling mogelijk wordt tussen discovery-, screening- en preklinische teams. Gestandaardiseerde replicatie ondersteunt de robuustheid van de assay en vermindert variabiliteit die werkelijke effecten van verbindingen zou kunnen maskeren. Deze consistentie is essentieel voor het afstemmen van cross-functionele inspanningen op go/no-go-criteria en de verdere ontwikkeling van de portfolio.

Welke statistische analysecapaciteiten zijn vereist voordat bacteriële ladingskwantificering in screeningsworkflows wordt geïmplementeerd?

De implementatie van deze methode vereist de mogelijkheid om statistische vergelijkingen van koloniengetallen uit te voeren, zoals t-toetsen of ANOVA, om significante verschillen tussen experimentele groepen te evalueren. Teams moeten in staat zijn om gemiddelden, standaarddeviaties en betrouwbaarheidsintervallen te berekenen uit replicate plaatjes tellingen om de effecten van verbindingen te beoordelen. Deze analytische mogelijkheden zijn noodzakelijk om ruwe koloniedata om te zetten in bruikbare inzichten voor targetvalidatie en lead-identificatie.

Quantifying Intestinal Bacterial Load in Zebrafish Infected with Vibrio cholerae

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiologie

0 weergaven • 3:48 min • February 26th, 2026

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begin with an adult zebrafish infected with an antibiotic-resistant strain of Vibrio cholerae. This pathogenic bacterium expresses β-galactosidase enzyme and colonizes the intestinal tract.

Collect the fish and transfer it into a solution containing an overdose of anesthetic to euthanize it.

Place the fish ventral side up and secure it with pins.

Disinfect the abdomen, make a longitudinal skin incision and two lateral incisions toward the head, then pin the skin to expose the intestinal tract.

Transfer the tract into a homogenization tube containing a cold buffer with glass beads.

Incubate with agitation, allowing the glass beads to disrupt the tissue and release the bacteria.

Serially dilute the homogenate, plate it onto the medium, and incubate. The medium contains a chromogenic β-galactosidase substrate and an antibiotic to eliminate contaminants.

The bacteria express β-galactosidase enzyme, which hydrolyzes the chromogenic substrate leading to formation of blue-pigmented colonies.

Count the colonies to estimate the intestinal bacterial load.

When the experiment has reached its desired endpoint, take a 15 milliliter sample of the infection water for diagnostic purposes. Then collect the fish and dispose of the infected water appropriately. Orient the ventral side up and secure the body with a pin through the lower jaw and another pin just posterior to the anus.

Angle both pins away from the body. Next, wipe off the ventral surface of the fish with 70% ethanol. Then, sterilize a scalpel and Vannas scissors by using 70% ethanol and a flame.

Now, using the scalpel, make a small lengthwise incision in the belly that penetrates the scales, but only cut as deep as the skin. Next, with the scissors, extend the incision carefully along the length of the body, cutting no deeper than skin level. Avoid cutting the anus.

Then make two lateral cuts towards the head to expand the opening. Then, pin the skin on each side of the lateral incisions to the dissecting surface, angling the pins out, away from the body. The intestinal tract should now be visible as a very thin, pale tube.

Now, use two pair of flame sterilized forceps to carefully remove the entire intestinal tract which can be quite fragile. Transfer the tissue into a homogenization tube containing glass beads and one milliliter of cold buffer. Next, homogenize the tissues as described in the text protocol and quantify the intestinal colonization levels.

Next, make serial dilutions of the intestinal homogenate and buffer. For each fish, prepare five or six ten fold dilutions in one milliliter volumes. Vortex the tubes for mixing.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026

Quantifying Intestinal Bacterial Load in Zebrafish Infected with Vibrio cholerae

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschappelijk gebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Industriële relevantie voor directie

Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van Pipeline & Workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen bij de implementatie

Veelgestelde vragen over biopharma

Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis

Mondelinge intubatie van volwassen Zebrafish: een Model voor de evaluatie van de intestinale opname van bioactieve stoffen

Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile

Infectie van zebravis embryo's met intracellulaire bacteriële pathogenen

Isolation and Cultivation of Bacteria from Zebrafish Embryos to Assess Infection Load

Intestinal Colonization and Diarrhea Induction by Vibrio cholerae in Adult Zebrafish

Quantification of Tissue Bacterial Load in a Mouse Model of Chronic Intestinal Infection

Modeling Intestinal Infection in Zebrafish Larvae Using Foodborne Bacteria

A Technique to Quantify Fungal Infection in Zebrafish Larvae

Gebruik van Shigella flexneri Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen