Protocol voor Recombinant RBD-based SARS Vaccins: Eiwit Voorbereiding, vaccinatie van dieren en het onschadelijk maken Detectie

In deze procedure wordt een recombinant vaccin geproduceerd dat het SARS COV RBD-eiwit tot expressie brengt, waarna de capaciteit om neutraliserende activiteit tegen een SARS-pseudovirus op te wekken wordt geëvalueerd. Eerst wordt het RBD-eiwit in gezuiverde vorm tot expressie gebracht vanuit het cultuursupernatant van getransfecteerde 2 9 3 T-cellen. Het gezuiverde eiwit wordt vervolgens gebruikt voor immunisatie.

Muizen en sera worden verzameld van de gevaccineerde muizen op verschillende tijdstippen na immunisatie om het neutralisatiepotentieel van de immuunsera te kwantificeren. Er wordt een pseudovirus-neutralisatieassay uitgevoerd, waarbij recombinant geproduceerd luciferase-expresserend SARS-pseudovirus wordt geproduceerd en geïncubeerd met getitreerd muizenserum. Vervolgens wordt het vermogen van deze geneutraliseerde virussen om cellen te infecteren die de SARS-coreceptor ACE tot expressie brengen, beoordeeld door de relatieve luciferase-activiteit in geïnfecteerde cellen te meten.

De 50% neutraliserende antilichaamtiter kan vervolgens worden berekend. Mijn naam is Tu. Ik ben momenteel postdoc in het laboratorium.

Het belangrijkste voordeel van de pseudovirus-neutralisatiewet boven bestaande technieken, zoals neutralisatiewetten op basis van levend virus, is dat deze techniek relatief veilig is. Er is geen infectieus SAR-virus vereist en de procedure kan worden uitgevoerd in een laboratorium dat niet voldoet aan veiligheidsniveau drie. De demonstratie van deze procedure zal worden gegeven door DU; DU is een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium die zich richt op de ontwikkeling van vaccins tegen opkomende infectieziekten zoals SARS en influenza. Ontdooi aliquoten van steriele 2X HBSS-buffer pH 7,2, 2,5 molar calciumchloride en RBD-plasmid bij kamertemperatuur.

Zodra de oplossingen zijn ontdooid, brengt u twee milliliter 2X HBS over in een conische buis van 50 milliliter. Meng in een buis van 15 milliliter 200 µL calciumchloride met 40 µg RBD-plasmide. Vul het volume aan tot twee milliliter met steriel gedestilleerd water op kamertemperatuur met behulp van een steriele pipet van vijf milliliter. Voeg de plasmide-oplossing druppelsgewijs toe aan de 2X HBS, terwijl het mengsel constant maar voorzichtig wordt gevortext.

Het is essentieel om deze vortex langzaam en continu te houden om een precipitaat met een adequate consistentie te verkrijgen voor een hoge transfectie-efficiëntie. Bewaar dit gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na deze incubatie het mengsel druppelgewijs toe aan een kolf met 50 tot 70% confluente 2 9 3 T-cellen.

In een volume van 40 milliliters celcultuurmedium is het belangrijk om de transfectie-oplossing gelijkmatig te verspreiden. Meng het medium direct na het toevoegen van de transfectiemix. Plaats de cellen bij 37 °C in een incubator met 5% carbon dioxide.

Na acht tot 10 uur incubatie wordt het complete celmedium verwijderd en vervangen door 50 milliliters vers serumvrij optimum, one medium om elke interferentie van serum bij de daaropvolgende eiwitzuivering te voorkomen, waarna de cellen teruggeplaatst worden in de 37 degree Celsius incubator. Verzamel twee dagen later het supernatant, dat het tot expressie gebrachte RBD-eiwit bevat, en centrifugeer dit gedurende 15 minuten op 6.000 RPM om celresten te verwijderen. Zodra de cellen zijn gepelletteerd, wordt het supernatant overgebracht naar een nieuwe buis en wordt er protease-remmermix toegevoegd.

Om proteïnedegradatie te voorkomen, gebruikt u nickel NTA super flow volgens de instructies van de fabrikant om het RBD-recombinant proteïne uit het geoogste supernatant te zuiveren. ELUTEER het RBD-proteïne met een buffer die 250 millimol ole bevat. Concentreer vervolgens het gezuiverde proteïne met OLE met behulp van Emon Ultra 15-buizen door centrifugatie bij 3000 RPM op vier graden Celsius gedurende ongeveer 15 minuten. Verwijder de doorstroom.

Voeg PBS toe aan de buisjes met de RBD-concentratie en centrifugeer opnieuw bij 3000 RPM bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Herhaal de wasstap tweemaal. Om volledige verwijdering van ole te waarborgen, wordt het gezuiverde eiwit nu opgelost in PBS; pipetteer het eiwit over naar een schoon Eppendorf-buisje van 1,5 milliliter.

Bereken ten slotte de concentratie van het gezuiverde eiwit met een NanoDrop, waarbij PBS als blanco wordt gebruikt, en bewaar het monster bij -80 °C. Voeg eerst 1 mL steriele PBS toe aan één vial van het Sigma-adjuvantensysteem. Voorverwarm in een waterbad bij 40 tot 45 °C en vortex de vial grondig gedurende twee tot drie minuten.

Bereid vervolgens de eiwitadjuvante emulsie voor in een einor-buisje van 1,5 milliliter. Meng de gewenste hoeveelheid ontdooid gezuiverd eiwit, verdund in PBS, met een gelijk volume adjuvante systeem en vortex dit krachtig gedurende twee tot drie minuten. Bereid daarnaast controle-emulsies door het adjuvans enkel met PBS te mengen. Subcutaan.

Injecteer ten minste vijf BC-muizen van vier tot zes weken oud subcutaan met elk 200 µL van het initiële immunisatiemengsel dat 20 µg proteïne per dosis bevat, of met de controle-emulsie, 21 dagen na de initiële inoculatie. Injecteer boosterdoses die 10 µg proteïne bevatten in een eindvolume van elk 200 µL. Neem bloedmonsters van elke muis vóór de initiële immunisatie en 10 dagen na elke vaccinatie en bewaar het geïsoleerde serum na het verwarmen bij -20 °C.

Inactivering van complement bij 56 °C gedurende 30 minuten. 16 uur vóór transfectie worden 2 9 3 T-cellen geplaatst in 100 millimeter weefselkweekschalen bij een dichtheid van 2 miljoen cellen per schaal. Bereid het transfectiereagens voor zoals eerder beschreven en cotransfecteer de cellen met een plasmide dat het SARS-CoV-S-eiwit codeert en een ander plasmide dat het ENV-defecte luciferase-expresserende HIV-1-genoom codeert. Acht tot 10 uur na transfectie.

Vervang het medium door 10 milliliters vers DMEM-medium met 10% serum en plaats de cellen vervolgens terug in de incubator. Oogst twee dagen later het supernatant dat het SARS-pseudovirus bevat. Filter het supernatant door een spuitfilter van 0,45 micron om celresten te verwijderen en verdeel het virus in aliquoten.

Gebruik het onmiddellijk of vries het voor later gebruik in bij -80 °C met behulp van een multichannel pipetplaat. Zaai 293T-cellen die de SARS-CoV-receptor ACE2 tot expressie brengen in de 96-well weefselkweekplaat in een concentratie van 10.000 cellen per 100 µL per well en incubeer de cellen 16 uur bij 37 °C. Gebruik een aparte 96-well plaat om het recombinant luciferase-expresserende SARS-pseudovirus te titreren en bepaal de juiste virusconcentratie voor de neutralisatie-assay in rijen A en B van de eerste plaat.

150 µL per well van 10% F-B-S-D-M-E-M. Voeg vervolgens 150 µL onverdund virus toe aan rij A1 en B1 en voer een dubbele seriële tweevoudige verdunning uit door 150 µL van de wells in rij 1 over te brengen naar de wells in de volgende rij, enzovoort tot rij 11. Verwijder de laatste 150 µL en voeg geen virus toe aan rij 12.

Zodra de seriële verdunning is uitgevoerd en de ACE 2 93 T-cellen gedurende 16 uur zijn geïncubeerd, worden de cellen geïnfecteerd door 100 µL uit elke put van de virusplaat over te brengen naar de overeenkomstige put van de plaat met de cellen. Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 37 °C om de virussen de cellen te laten infecteren. Bepaal de mate van infectie in elke put door de plaat af te lezen in een ultra 3 84 luminometer.

De mate van infectie is proportioneel aan de intensiteit van de luciferase-activiteit. De virusconcentratie waarbij de relatieve luciferase-eenheid ongeveer duizend keer groter is dan de achtergrond-RLU van de cellen alleen in kolom 12, zal worden gebruikt in de neutralisatie-assay. Zet de neutralisatie eerst op in een aparte 96-well plaat met een meerkanaals pipet door 150 µL 10% F-B-S-D-M-E-M in de wells van kolom één te pipetteren en 120 µL in de wells van de overige kolommen.

Voeg vervolgens drie microliter van elk te testen muisserum toe aan dubbele wells in kolom één. In dit voorbeeld bevatten de eerste twee wells 50-voudig verdund serum van een RBD-geïmmuniseerde muis. De volgende twee bevatten serum van een tweede RBD-geïmmuniseerde muis en de laatste vier wells bevatten serum van twee controle-dieren die met PBS zijn geïmmuniseerd. Voer met een multichannelpipet een vijfvoudige seriële verdunning van het serum uit door 30 microliter uit alle wells in de eerste kolom over te brengen naar de wells van de tweede kolom, en herhaal dit tot aan kolom 11.

Verwijder de resterende 30 µL en laat de wells in kolom 12 zonder serum. Voeg vervolgens aan elke well 120 µL van een verdund SARS-pseudovirus toe. Incubeer de plaat één uur bij 37 °C om eventuele anti-RBD-antilichamen in het muïsserum de kans te geven om het SARS-pseudovirus te binden en te neutraliseren.

Breng na deze incubatie 100 µL geneutraliseerd virus vanuit elke put over naar de overeenkomstige putten van de 96-wellplaat die ACE2-expresserende 293T-cellen bevat. Incubeer de cellen 24 uur bij 37 °C om infectie mogelijk te maken. Zodra de cellen zijn geïnfecteerd, dient het supernatant met een multichannelpipet te worden verwijderd en vervangen door 100 µL vers medium per put.

Plaats de plaat na 72 uur bij 37 °C terug in de incubator. Verwijder vervolgens opnieuw het supernatant. Op dit punt zou elk pseudovirus dat niet is geneutraliseerd door het muisenserum in staat moeten zijn om cellen te infecteren. Voeg met een multichannelpipet 60 µL luciferase-celcultuurlysisreagens per well toe.

Plaats de plaat op een schudmachine bij kamertemperatuur en laat de cellen één tot twee uur lyseren. Zodra de cellen zijn gelyseerd, brengt u 50 µL van de cellysaten over naar een 96-wells luminometerplaat en voegt u per well 50 µL luciferase-substraat toe. Gebruik een Ultra 3 84 luminometer, ingesteld op luminescentie in de modus voor 96-wells platen, om de plaat uit te lezen en de relatieve luciferase-activiteit in de verschillende wells te beoordelen, waaruit het percentage geneutraliseerd virus kan worden afgeleid.

Deze gegevens tonen aan dat het percentage bereikte virusneutralisatie proportioneel is aan de concentratie serum van RBD-geïmmuniseerde muizen. Daarentegen slaagt serum van dieren die PBS hebben gekregen er volgens deze gegevens niet in om het virus te neutraliseren bij enige concentratie. De NT 50 of serumtiter waarbij 50% van het virus wordt geneutraliseerd, kan eenvoudig worden afgeleid.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat zelfvertrouwen en geduld essentieel zijn voor het succes van de experimenten. Na het bekijken van deze video's zou u een beter inzicht moeten hebben in hoe u recombinant SARS-vaccin kunt tot expressie brengen in maman-celculturen, en hoe u de capaciteit om een neutraliserende antilichaamrespons in muismodellen op te wekken, kunt bepalen.