PCR-Based Detection of Foodborne Pathogens from Enriched Fly Samples
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:25 min • March 31st, 2026
Place the polymerase chain reaction or PCR tubes containing PCR-ready tablets specific to the target foodborne pathogens onto a chilled PCR tube rack.
Each tablet includes target-specific primers, DNA polymerase, dNTPs, and a fluorescent dye used in the PCR reaction.
Add enriched fly lysate containing a high amount of DNA from pathogenic bacteria to form the reaction mixture.
Seal the tubes with optical caps to prevent evaporation.
Load the PCR tubes into the thermal cycler and perform separate PCR runs using pathogen-specific programs for each target pathogen.
During PCR, the DNA denatures, primers bind to the target sequence, and amplification produces double-stranded DNA that binds the dye and emits fluorescence.
Repeated cycles result in exponential DNA amplification and increased fluorescence.
The instrument tracks fluorescence in real time to detect the presence of the target foodborne pathogens in the sample.
To begin PCR-based detection, first, chill a PCR tube rack on a cooling block. Then, place the corresponding PCR tubes containing PCR-ready tablets for the target foodborne pathogen into the holder.
Carefully remove the caps from the PCR tubes using the decapping tool and discard them. Verify that each tube contains a tablet. Then, transfer 50 microliters of lysate to the appropriate PCR tubes.
Secure new optical caps onto the PCR tubes using the capping tool. After assembling the reactions, load the PCR tubes into the PCR cycler detection system. Then, run the program and view the results as described in the manufacturer's protocol.
Overzicht
Dit protocol demonstreert het gebruik van PCR voor het detecteren van voedselgebonden pathogenen uit verrijkte vliegenmonsters. Dit is van groot belang voor het verbeteren van de voedselveiligheid door het mogelijk maken van een snelle identificatie van pathogenen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Voedselveiligheid
- Pathogeendetectie
Achtergrond
- Voedselgerelateerde pathogenen vormen een aanzienlijk gezondheidsrisico.
- Traditionele detectiemethoden kunnen tijdrovend zijn.
- PCR biedt een snel en gevoelig alternatief voor detectie.
- Verrijkte vliegenmonsters kunnen dienen als bron van pathogeen DNA.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een op PCR gebaseerde methode voor het detecteren van door voedsel overdraagbare pathogenen.
- Het gebruiken van verrijkte vliegenmonsters voor de identificatie van pathogenen.
- Het verbeteren van de snelheid van pathogeendetectie in de context van voedselveiligheid.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van PCR-buisjes met specifieke tabletten voor doelpathogenen.
- Toevoeging van verrijkt vliegenlysaat aan PCR-reacties.
- Gebruik van een thermocycler voor amplificatie van DNA.
- Real-time monitoring van fluorescentie om pathogenen te detecteren.
Belangrijkste resultaten
- Dit protocol demonstreert de opzet en uitvoering van PCR voor de detectie van pathogenen.
- Fluorescentie geeft de aanwezigheid van doelpathogenen tijdens de PCR aan.
- Voor verschillende pathogenen zijn afzonderlijke PCR-runs vereist.
- Resultaten kunnen in real-time worden bekeken volgens het protocol van de fabrikant.
Conclusies
- PCR is een effectieve methode voor het detecteren van door voedsel overgedragen pathogenen.
- Verrijkte vliegensamples zijn een levensvatbare bron voor pathogeen-DNA.
- Deze methode kan de monitoring van voedselveiligheid verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze op PCR gebaseerde methode maakt snelle en gevoelige detectie van voedselgerelateerde pathogenen uit verrijkte vliegenmonsters mogelijk, wat bijdraagt aan risicobeoordelingen in een vroeg stadium binnen workflows voor voedselveiligheid. Door real-time fluorescentie-uitlezingen en pathogeen-specifieke amplificatie te bieden, wordt de voorspellende betrouwbaarheid bij het identificeren van contaminatiebronnen verhoogd. De benadering ondersteunt mechanische risicoreductie door milieusurveillance te koppelen aan de aanwezigheid van pathogenen, wat ten grondslag ligt aan go/no-go-beslissingen in preklinisch en translationeel onderzoek naar voedselveiligheid.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de aanwezigheid van pathogeen DNA in omgevingsvectoren te bevestigen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe detectie van pathogene biomarkers in fly-lysaten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door het verstrekken van kwantitatieve real-time gegevens over de pathogene lading voor risicomodellering.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door pathogeenverrijking te bevestigen.
- Operationele waarde: Garandeert assay-standaardisatie via pathogeenspecifieke tabletten die primers, polymerase, dNTP's en fluorescente kleurstof bevatten.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform door modulaire PCR-runs voor meerdere targets met behulp van gestandaardiseerde thermische cyclingsprotocollen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt omgevingssurveillance met preklinische validatie door het detecteren van pathogeen-DNA dat relevant is voor modellen van door voedsel overdraagbare ziekten.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt de besluitvorming via meetbare fluorescentiedrempels die wijzen op de aanwezigheid van pathogenen.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit in de analyse van transmissieroutes door vliegen-gebonden DNA te koppelen aan contaminatiegebeurtenissen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fasen van vroege ontdekking tot identificatie van leads, waarbij de detectie van omgevingspathogenen bijdraagt aan de validatie van targets en de gereedheid van assays voor downstream screeningcampagnes.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door de aanwezigheid van pathogenen in verrijkte vliegmonsters te bevestigen als proxy voor milieuverontreiniging.
- Screening: Levert assay-klare resultaten via real-time fluorescentie en smeltcurve-analyse voor reproduceerbare detectie van pathogenen.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve fluorescentiegegevens die vergelijking van de pathogeenbelasting tussen monsters en condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen fundamentele ontdekkingen en preklinisch werk door bewijs van pathogeen-DNA te leveren uit ecologisch relevante bemonsteringsmatrices.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Fungeert als een modulair detectieplatform dat aanpasbaar is aan meerdere pathogenen door middel van tablet-gebaseerde standaardisatie van reagentia.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij pathogeendetectie, vermindering van fout-negatieven bij milieumonitoring.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gevriesdroogde pathogeen-specifieke tabletten en gedefinieerde thermische protocollen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen in voedselveiligheidsprogramma's, kapitaalefficiëntie via multiplex-geschikte workflows, verminderd biologisch risico in een laat stadium bij de beoordeling van productveiligheid.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van interventiestrategieën op basis van bevestigde pathogeenaanwezigheid in surveillancesamples.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie en het opzetten van PCR-assays voor pathogeen-specifieke detectie.
- Vereist een thermocycler met real-time fluorescentiedetectie en compatibiliteit met optische buisjes.
- Vereist standaardisatie tussen teams van monsterverrijking- en lysisprotocollen voor een consistente lysatekwaliteit.
- Omvat aanpassingen bij uitbreiding naar verschillende vliegensoorten of omgevingsmatrices.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van pathogeen-specifieke primers en de noodzaak van afzonderlijke runs per target, zoals ondersteund door het bronmateriaal.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Verrijking en detectie van Clostridium perfringens toxinotypes in Retail Food monsters
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie en isolatie van Campylobacter spp. uit rauw vlees
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle en specifieke detectie van Acinetobacter baumannii-infecties met behulp van een op recombinasepolymeraseamplificatie/Cas12a gebaseerd systeem
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Oral Infection of Drosophila melanogaster with Pathogenic Bacteria
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Detectie van Foodborne bacteriële pathogenen uit Individuele Filth Flies
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het combineren van kwantitatieve voedselinname-Assays en onder dwang activeren neuronen om te bestuderen van eetlust in Drosophila
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Quasi-metagenomic analyses van Salmonella uit voedsel en milieu voorbeelden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een snelle voedselvoorkeurtest in Drosophila
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026