High-Throughput Imaging of Intracellular Brucella abortus Infection in Host Epithelial Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:43 min • March 31st, 2026
Begin with epithelial cells in which expression of the interferon adaptor protein, a key mediator of innate immunity, has been reduced, making the cells more susceptible to Brucella infection.
Replace the medium with an infection medium containing green fluorescent protein–expressing Brucella abortus, a facultative intracellular pathogen, at the desired concentration.
Centrifuge the plate to promote contact between bacteria and host cells, then incubate to allow bacterial internalization.
Wash the cells with serum-containing medium, and treat them with an antibiotic to eliminate extracellular bacteria.
Incubate further to allow Brucella to multiply intracellularly.
Wash the cells with buffer and fix them with paraformaldehyde to preserve intracellular structures.
Rinse off the excess fixative. Then, add detergent-supplemented buffer to permeabilize the cells.
Wash away the residual detergent, then add DAPI to stain the nuclei, and perform a final wash.
Using an automated microscope, acquire high-throughput images of Brucella infection in the host epithelial cells.
Using an automated plate washer, exchange the transfection medium with 50 microliters of infection medium. Inside the hood, transfer the plate into the centrifuge cage and centrifuge the 384-well plate at 400 times g and four degrees Celsius for 20 minutes.
Then, use parafilm to seal the plate and incubate it on a prewarmed aluminum plate at 37 degrees Celsius and 5% CO2 for four hours. After the incubation with the automated plate washer, use DMEM with 10% FCS containing 100 micrograms per milliliter of Gentamicin or GM to wash the cells to inactivate extracellular bacteria. Then, use parafilm to seal the plate and place it back on the prewarmed aluminum plate in the incubator for another 40 hours for the endpoint assay.
To fix the cells, first use PBS to wash the wells. Then, exchange the PBS with 50 microliters of 3.7% PFA in 0.2 molar HEPES at pH 7.4 and incubate the cells at room temperature for 20 minutes.
After the incubation, use 50 microliters of PBS to exchange the fixation medium. To stain the samples with the automated plate washer, begin by using 50 microliters of 0.1% Triton X-100 in PBS for 10 minutes to permeabilize the cells.
After using PBS to wash the cells three times, add 50 microliters of PBS with one microgram per milliliter of DAPI and incubate at room temperature for 30 minutes. Then, use PBS to wash the cells three times before protecting them from light. Transfer the plate to the automated microscope.
Overzicht
Dit protocol demonstreert een methode voor high-throughput imaging van intracellulaire Brucella abortus-infectie in epitheelcellen van de gastheer. Het stelt onderzoekers in staat om het infectieproces te visualiseren en te analyseren, wat bijdraagt aan een beter begrip van de pathogenese van Brucella.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Interacties tussen pathogeen en gastheer
- Celbiologie
Achtergrond
- Brucella abortus is een facultatief intracellulair pathogeen.
- Inzicht in het infectiemechanisme is cruciaal voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- High-throughput imaging kan grootschalige studies naar infectiedynamiek faciliteren.
- De vatbaarheid van de gastheercel kan worden beïnvloed door factoren van de aangeboren immuniteit te reduceren.
Doel van de studie
- Om het intracellulaire infectieproces van Brucella abortus te visualiseren.
- Om de impact van gastcel-factoren op de vatbaarheid voor infectie te beoordelen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van bacteriële pathogenese.
Gebruikte methoden
- Infectie van epitheelcellen met GFP-expresserende Brucella abortus.
- Gebruik van antibiotica om extracellulaire bacteriën te elimineren.
- High-throughput imaging met geautomatiseerde microscopie.
- Fixatie en kleuring van cellen voor visualisatie van kernen.
Belangrijkste resultaten
- Dit protocol demonstreert de stappen voor het prepareren en afbeelden van geïnfecteerde cellen.
- Het beschrijft het gebruik van specifieke reagentia en condities voor optimale resultaten.
- High-throughput imaging maakt de gelijktijdige analyse van meerdere monsters mogelijk.
- De resultaten kunnen inzicht bieden in het intracellulaire gedrag van Brucella abortus.
Conclusies
- De methode maakt gedetailleerde observatie van Brucella-infectie in gastheercellen mogelijk.
- Het kan worden gebruikt om de effecten van diverse behandelingen op de infectiedynamiek te bestuderen.
- Deze aanpak kan bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit high-throughput imaging-protocol maakt systematische analyse van gastheer-pathogeeninteracties in intracellulaire bacteriële infectiemodellen mogelijk. Door de replicatie van Brucella abortus in epitheelcellen onder gedefinieerde genetische perturbaties te kwantificeren, ondersteunt het de validatie van targets en het mechanistisch verminderen van risico's in programma's voor de ontdekking van antimicrobiële middelen. Het assay-formaat biedt voorspellende zekerheid voor het prioriteren van gastheer-gerichte therapeutica en inspanningen voor lead-identificatie gericht op specifieke signaalpaden.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door cytosolische DNA-sensingpaden te koppelen aan intracellulaire bacteriële replicatiefenotypen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via siRNA-gemedieerde knockdown van mediatoren van de aangeboren immuniteit zoals STING.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfolio-triage door infectiedynamiek te kwantificeren onder gecontroleerde modulatie van gastheerfactoren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde epitheelcelsystemen voor op downstream compound- of genetische screeningscampagnes.
- Operationele waarde: Standardiseert infectie-read-outs via geautomatiseerde microscopie en kwantitatieve tracking van GFP-expresserende pathogenen.
- Schaalbaarheidswaarde: Faciliteert hergebruik van het platform in 384-wells formaten voor high-content screening van gastheerfactoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Behoudt de ziekterelevantie door het modelleren van Brucella-epitheelinfecties, een cruciale stap in de zoönotische pathogenese.
- Preklinische continuïteit: Verbindt vroege ontdekkingsmechanismen met validatie in fysiologisch relevante gastcelcontexten.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert de criteria voor verdere ontwikkeling door het onthullen van gastafhankelijkheden die kritiek zijn voor intracellulair overleven.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van hypothesen over targets via de identificatie van leads tot de preklinische validatie van mechanismen, in het bijzonder voor programma's gericht op intracellulaire pathogenen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van gastheerfactoren die de internalisatie en replicatie van pathogenen beïnvloeden.
- Screening: Maakt assays gereed voor gebruik via gestandaardiseerde workflows voor infectie, antibioticaselectie en fixatie.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van de intracellulaire pathogene last via GFP-signalen en nucleaire co-kleuring voor analyse op enkelcelniveau.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de modulatie van aangeboren immuunroutes met infectie-uitkomsten, ter ondersteuning van mechanismevalidatie op basis van biomarkers.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform dat toepasbaar is op andere intracellulaire bacteriën of virussen met fluorescente reporters.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de interactie tussen gastheer en pathogeen door specifieke bijdragen van de aangeboren immuniteit te isoleren.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door geautomatiseerde vloeistofbehandeling, gestandaardiseerde incubatie en imaging met vaste eindpunten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de target-validatie kwantitatieve infectie-fenotypes te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van gastheer-gerichte anti-infectiva mogelijk op basis van genetische afhankelijkheidsgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, transfectie en het werken met intracellulaire pathogenen onder BSL-2-condities.
- Afhankelijk van een geautomatiseerde microscopie-infrastructuur die in staat is tot GFP- en DAPI-signaalacquisitie in 384-wells formaat.
- Vereist cross-team standaardisatie van infectietiming, antibioticaselectie en fixatieprotocollen.
- Aanpassing aan primaire of gedifferentieerde epitheelmodellen kan optimalisatie van de infectie-efficiëntie en toxiciteitscontroles vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van fluorescente pathogene stammen en potentiële variabiliteit in de transfectie-efficiëntie tussen wells.
Biopharma Veelgestelde Vragen
High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Real-time beeldvorming van leukotriënen B 4 Mediated Cel Migratie en BLT1 Interacties met β-arrestine
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Monitoring immuuncellen Trafficking TL-Prion Rods uur na intraperitoneale infectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beeldvorming InlC Afscheiding to Cellular Infectie Onderzoek door de bacteriële pathogenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers
Gerelateerde video's
0 Bekeken
-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026