Detection of Bacterial Antibiotic Susceptibility Using a Stimulated Raman Scattering Microscope
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:46 min • March 31st, 2026
Begin with bacterial samples pretreated with increasing concentrations of an antibiotic that eliminates susceptible bacteria.
Add a growth medium containing deuterium oxide and the same antibiotic concentration to the corresponding tubes.
Incubate the tubes under shaking conditions.
Deuterium oxide enters bacterial cells, where deuterium is incorporated into newly synthesized biomolecules, forming carbon–deuterium bonds.
Spin down the bacteria, discard the supernatant, and wash.
Add a fixative to preserve the bacterial structure.
Add water, centrifuge, and remove the supernatant.
Resuspend the bacteria and transfer the suspension onto a poly-L-lysine-coated coverglass, then seal it.
Place the sample on the stage of a pre-calibrated stimulated Raman scattering or SRS microscope. Add water and lower the objective.
Acquire images of multiple fields to assess the carbon–deuterium vibrational frequency.
At higher antibiotic concentrations, the carbon–deuterium signal decreases, indicating reduced bacterial viability.
This enables rapid assessment of antibiotic susceptibility by correlating the SRS signal intensity with bacterial viability.
After 1 hour of incubation, add 700 microliters of antibiotic serially diluted with 100% deuterium containing MHB medium to the 300 microliters of antibiotic pre-treated bacteria in the same antibiotic concentration. Homogenize the mixture by pipetting up and down several times. Add 700 microliters of antibiotic-free 100% deuterium containing MHB medium to 300 microliters of antibiotic-free bacteria as a positive control.
Add 700 microliters of antibiotic-free 0% deuterium containing MHB medium to 300 microliters of antibiotic-free bacteria as a negative control. Incubate all the microtubes at 37 degrees Celsius and 200 rotations per minute for 30 minutes. After incubation, centrifuge the 1 milliliter of antibiotic and deuterium-treated bacterial sample at 6,200 times g for 5 minutes at 4 degrees Celsius. Then, wash the pellet twice with purified water. Fix the samples in 10% volume by volume formalin solution, and store them at 4 degrees Celsius.
For the sample preparation, wash 1 milliliter of fixed bacteria solution with purified water, and centrifuge the washed bacteria solution at 6,200 times g for 5 minutes at 4 degrees Celsius.
Remove the supernatant and enrich the bacterial solution to about 20 microliters with sterilized water. Deposit the bacterial solution on a poly-L-lysine coated cover glass, sandwich with another cover glass, and seal the sample. Put the bacterial sample on the sample stage under the 60x water immersion objective. Start the SRS imaging of bacterial samples. Image at least three fields of view for each sample.
Overzicht
Dit protocol demonstreert het gebruik van gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie om de antibioticagevoeligheid van bacteriën te evalueren. Door koolstof-deuterium-vibratiefrequenties te meten, kunnen onderzoekers snel de bacteriële levensvatbaarheid in reactie op antibioticabehandelingen beoordelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Antibioticagevoeligheidstesten
- Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie
Achtergrond
- Inzicht in bacteriële resistentie tegen antibiotica is cruciaal voor een effectieve behandeling.
- Traditionele methoden voor het beoordelen van antibioticagevoeligheid kunnen tijdrovend zijn.
- Stimulated Raman scattering microscopie biedt een snel alternatief voor het evalueren van de bacteriële levensvatbaarheid.
- Deuteriumoxide wordt gebruikt om de bacteriële metabole activiteit te volgen.
Doel van de studie
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor het beoordelen van de antibioticagevoeligheid van bacteriën.
- Om de SRS-signaalintensiteit te correleren met de bacteriële levensvatbaarheid.
- Om deuteriumincorporatie te gebruiken als marker voor de metabole activiteit in bacteriën.
Gebruikte methoden
- Bacteriële monsters worden behandeld met antibiotica en deuteriumoxide.
- Monsters worden geïncubeerd en voorbehandeld voor beeldvorming.
- Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie wordt gebruikt om beelden te verkrijgen.
- De signaalintensiteit wordt geanalyseerd om de bacteriële levensvatbaarheid te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Hogere antibioticaconcentraties correleren met afgenomen koolstof-deuteriumsignalen.
- De methode maakt een snelle beoordeling van de bacteriële levensvatbaarheid mogelijk.
- De resultaten kunnen behulpzaam zijn bij behandelbeslissingen voor bacteriële infecties.
- Het protocol demonstreert een nieuwe toepassing van SRS-microscopie in de microbiologie.
Conclusies
- Dit protocol biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die antibioticagevoeligheid bestuderen.
- Stimulated Raman scattering-microscopie kan de snelheid van beoordelingen van de bacteriële levensvatbaarheid verhogen.
- Verder onderzoek kan de toepassingen ervan in de klinische microbiologie uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Snelle detectie van de antibioticagevoeligheid van bacteriën is cruciaal voor translationeel onderzoek en de vroege fase van de ontdekking van anti-infectieve middelen. Stimulated Raman scattering (SRS)-microscopie maakt kwantitatieve beoordeling van de bacteriële levensvatbaarheid op enkelcelniveau mogelijk door deuterium-gelabelde metabole activiteit te meten, wat de voorspellende betrouwbaarheid bij antimicrobiële screening ondersteunt. Deze aanpak versnelt de besluitvorming op cruciale overgangspunten bij de ontwikkeling van een anti-infectieve portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van de bacteriële metabole respons op kandidaat-antibiotica mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van antimicrobiële targets door verschuivingen in levensvatbaarheid te kwantificeren.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie via metabole read-outs op single-cell niveau.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen bij triage van verbindingen in een vroeg stadium.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een snelle, kwantitatieve analyse voor het testen van antibioticaresistentie.
- Levert reproduceerbare, gestandaardiseerde resultaten die geschikt zijn voor high-throughput workflows.
- Maakt een robuuste vergelijking van de effectiviteit van verbindingen over bacteriële populaties heen mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van de analyse en het hergebruik van het platform in anti-infectieve pijplijnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt metrische metingen van metabole levensvatbaarheid met translationele biomarkerstrategieën.
- Borgt continuïteit van de ontdekkingsfase tot aan de preklinische validatie van antimicrobiële effectiviteit.
- Vermindert het biologische risico door vroegtijdig kwantitatief bewijs van de werking van verbindingen te leveren.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van anti-infectieuze kandidaten.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze op SRS gebaseerde methode integreert in het continuüm voor de ontdekking van anti-infectiemiddelen, van vroege targetvalidatie tot lead-identificatie en preklinische beoordeling.
- Discovery Biology: Kwantificeert de metabolische activiteit om therapeutische hypothesen te testen en bacteriële responspaden te verduidelijken.
- Screening: Biedt snelle, reproduceerbare resultaten van gevoeligheid voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van koolstof-deuteriumsignalen voor de vergelijking van condities.
- Translational Research: Slaat de brug tussen de ontdekkingsfase en preklinische stadia met levensvatbaarheidsgegevens die zijn afgestemd op biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor diverse antimicrobiële screeningcampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de ontdekking van antimicrobiële middelen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare gevoeligheidstests.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en verbetert de kapitaalefficiëntie in anti-infectieve portfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van kandidaat-antibiotica.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in SRS-microscopie en bacteriële metabolische assays.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde beeldvormingsinstrumentatie en analytische infrastructuur.
- Vraagt om standaardisatie van monsterpreparatie en beeldvormingsprotocollen tussen teams.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende bacteriële soorten of resistentiemechanismen.
- Afhankelijk van kwantitatieve signaalanalyse voor een robuuste beoordeling van de gevoeligheid.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Antimicrobiële synergie testen door de Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord matrix en de handmatige methode van de tijd-kill
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Verwerping van Fluorescentie Achtergrond in Resonance en spontane Raman Microspectroscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
A-filter op basis Surface Enhanced Raman spectroscopische test voor snelle opsporing van chemische verontreinigingen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026