Name: Mitochondriale Isolatie van skeletspieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer mitochondriën isoleren uit skeletspierweefsel en ademhaling meten via polygrafie. Deze methode beoordeelt zuurstofverbruik in verschillende ademhalingsstaten voor metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het National Eye Institute (R01 EY12998) naar FH Andrade.

1. Voorbereiding van de Buffers <ol><li> Zet de centrifuge 5804R en ingesteld op 4 ° C. Zet Isotemp 3006D waterbad en ingesteld op 37 ° C. </li><li> Bereid de volgende oplossingen voor spier isolatie: <ul><li> PBS: Los fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten in gedestilleerd water (5 tabletten / liter). Meng goed. </li><li> PBS plus 10 mM EDTA: te bereiden een 100 ml oplossing, 2 ml van 500 mM EDTA toe te voegen aan 98 ml PBS. </li><li> 8X Mitochondriën buffer: 10,28 g sucrose voor een uiteindelijke concentratie van 0,6 M, 400 mg van free-vetzuur bovine serum albumine (BSA) voor een uiteindelijke concentratie van 0,8%, 2,08 g HEPES voor een uiteindelijke concentratie van 160 mM, pH naar 7,4 en QS op 50 ml met gedestilleerd water. </li><li> Isolatie Buffer 1 (IB1): Voeg 200 ui van 500 mM EDTA voor een uiteindelijke concentratie van 10 mM, 0,392 g aan D-mannitol voor een uiteindelijke concentratie van 215 mM, 1,25 ml van 8X mitochondria buffer, pH tot 7,4 en QS tot 10 ml met gedestilleerd water. </li><li> Isolatie Buffer 2 (IB2): Voeg 60 pi 500 mM EGTA voor een uiteindelijke concentratie van 3 mM, 0,392 g aan D-mannitol voor een uiteindelijke concentratie van 215 mM, 1,25 ml van 8X mitochondria buffer, pH tot 7,4 en QS tot 10 ml met gedestilleerd water. </li><li> Experimentele Buffer (EB): Voeg 100 ul van 500 mM MgCl 2 voor een uiteindelijke concentratie van 5 mM, 0,392 g aan D-mannitol voor een uiteindelijke concentratie van 215 mM, 25 pl van 2,5 mM KH 2 PO 4 voor een uiteindelijke concentratie van 6,25 uM, 2 pi van 100 mM EGTA voor een uiteindelijke concentratie van 20 uM, 1,25 ml van mitochondriale buffer, pH tot 7,4 en QS tot 10 ml met gedestilleerd water. </li></ul></li></ol> 2. Muscle Isolatie <ol><li> In een ijsemmer, zet drie 10 ml bekers, Potter-Elvehjem weefsel slijpmachines en alle andere benodigde instrumenten / supplies op ijs. Alles moet ijskoud blijven gedurende het experiment. </li><li> Plaats IB1 en IB2 in ijsemmer en EB in warm water bad als u klaar bent. </li><li> In de drie 10 ml bekers, moeten de volgende oplossingen toegevoegd: <ul><li> Beker 1: 10 ml PBS </li><li> Beker 2: 10 ml PBS / EDTA </li><li> Beker 3: 3 ml IB1 </li></ul></li><li> Dood een rat humane manier, zoals goedgekeurd door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite. </li><li> Snel isoleren 250-500 mg van de skeletspieren, spoelen in een beker, vervolgens transfer naar Beaker 2. </li></ol> 3. Homogenisering / Mitochondriale Isolation <ol><li> Overdracht spier Beaker 3 en fijn de spier gehakt met een schaar. </li><li> Breng de oplossing aan de Potter-Elvehjem homogenisator. Homogeniseren van de spier met behulp van een gemotoriseerd stamper (een kolomboormachine zal het werk te doen) die 10 maal het bijhouden van de buis in het ijs te allen tijde. </li><li> Overdracht homogenaat vooraf gekoelde 2 ml microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 700 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis. Gooi pellet. </li><li> Centrifugeer supernatant bij 10.500 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis en label SN1 (supernatant nummer 1) en spieren type. </li><li> Re-schorten pellet in 500 ui IB2. </li><li> Centrifugeer bij 10.500 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis en label SN2 (supernatant nummer 2) en spieren type. </li><li> Schorten laatste mitochondriale pellet in 100 ui IB2. </li><li> Re-spin finale mitochondriale suspensie in minifuge voor een paar seconden. Als er een pellet, transfer supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis en gooi de pellet. </li><li> Bepaal eiwitconcentratie het gebruik van de Bradford assay 8. </li></ol> 4. Electrode Kalibratie LET OP: Complete elektrode kalibratie tijdens het mitochondriale isolatie. <ol><li> Voeg 100 ml gedestilleerd water tot 250 ml kolf. Roer krachtig gedurende 20 minuten aan het water met atmosferische gas evenwicht. </li><li> Voeg een paar druppels van 50% KCl aan de Oxygraph elektrode. </li><li> Leg een klein stukje van Blue Rizla vloei op de top van de elektrode. </li><li> Leg een stuk van PTFE membraan op de top van de vloei. </li><li> Breng de binnenring met behulp van de ring applicator en dan de buitenste ring plaats in de elektrode groef. </li><li> Sluit de elektroden en de montage van de rest van de apparatuur: grote plastic ring basis, mitochondriale kamer, en waterslangen. </li><li> Zet Oxygraph dozen en start Oxygraph software. </li><li> Voeg het water evenwicht tot mitochondriale kamer. </li><li> Voeg roer bar en op een snelheid van 60 beurt. </li><li> Begin een nieuw experiment. </li><li> Klik op kalibreren en vervolgens vloeibare fase kalibratie voor Box 1. Verandering temperatuur tot 37 ° C en klik op "OK" twee keer. </li><li> Wanneer "Override" verandert in "OK" klik hierop en open de stikstof gas tank. </li><li> Plaats tip verbonden met stikstof tank in de kamer en stellen nul zuurstof. Clikken "OK" voor het omschakelen van "Override". </li><li> Aspireren water en voeg 500 ul van EB buffer tot mitochondriale kamers. </li><li> Afdichtingskamer met zuiger. </li><li> Bij gebruik van meerdere dozen, herhaalt u de stappen 11-15 voor de kalibratie van Box 2. </li></ol> 5. Mitochondriale ademhaling <ol><li> Start een nieuw experiment, laat het uit te voeren gedurende ongeveer 1 minuut om het signaal te stabiliseren. </li><li> Voeg noodzakelijke volume van de mitochondriale suspensie (stap 3,11) voor 150 mg in elke kamer, Mark evenement, en laat het uit te voeren gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg 10 ul van warm 250 mM/125 mM glutamaat / malaat voor een uiteindelijke concentratie van 5 mM mM/2.5. Mark en laten lopen gedurende 1 minuut. Dit wordt gedefinieerd als twee staat. </li><li> Voeg 7,5 pi van 10 mM ADP voor een uiteindelijke concentratie van 150 uM, merk, en laat draaien voor 30 seconden. Dit wordt gedefinieerd als staatssteun 3. </li><li> Voeg nog een 7,5 pl van 10 mM ADP, merk, en laat draaien 1,5 minuten. </li><li> Voeg 0,5 pi van koude 10 mM oligomycin voor een uiteindelijke concentratie van 1 uM, merk, en laat lopen gedurende 3 minuten. Dit wordt gedefinieerd als staatssteun 4. </li><li> Voeg 1 ui van koude 0,1 mM FCCP voor een uiteindelijke concentratie van 0,2 uM, merk, en laat lopen gedurende 3 minuten. Dit wordt gedefinieerd als staatssteun 5. </li><li> Wanneer u klaar bent, eind experiment en op te slaan. </li><li> Verwerven ademhaling met behulp van Oxygraph software. </li><li> Vul normalisatie factor: als het toevoegen van 150 ug van mitochondriale eiwit, de normalisatie factor wordt 0.15. </li><li> Bereken genormaliseerd ademhaling tarieven voor de verschillende toestanden ademhaling. </li><li> Bereken de Respiratory Controle Ratio (RCR) wordt berekend door Staat drie door de staat 4. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Toont een vertegenwoordiger opsporen van zuurstofverbruik door skeletspieren mitochondriën. Nadat de elektrode signaal is gestabiliseerd, is de mitochondriën monster toegevoegd aan de Oxygraph kamer. Staat twee ademhaling begint met toevoeging van glutamaat en malaat. Toevoeging van ADP verhoogt de zuurstof consumptie, het definiëren van de staat 3 ademhaling. ATP synthase wordt geblokkeerd door de toevoeging van oligomycin naar toestand 4 ademhaling te verkrijgen. Tot slot wordt FCCP toegevoegd aan mitochondriale ademhaling (staat 5) los te koppelen. Tabel 1 geeft representatieve zuurstofverbruik voor staten 2, 3, 4 en 5. De respiratoire controle ratio (RCR) wordt berekend voor elk experiment. RCR ≥ 4 wordt beschouwd als bewijs van een levensvatbare mitochondria voorbereiding. <table border="1"><tbody><tr><td> Staten </td><td> Genormaliseerd Tarieven </td></tr><tr><td> Toestand 2 </td><td> 34,74 </td></tr><tr><td> Staat 3 </td><td> 153,40 </td></tr><tr><td> Toestand 4 </td><td> 16,49 </td></tr><tr><td> Toestand 5 </td><td> 143,70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Mitochondriale ademhaling. Representativeoxygen consumptie prijzen van skeletspieren mitochondriën. De waarden zijn genormaliseerd om de hoeveelheid van de mitochondriën toegevoegd aan de kamer. De respiratoire controle ratio (RCR) wordt bepaald door de staat drie door de staat 4. Een RCR ≥ 4 vertegenwoordigt een levensvatbare mitochondria voorbereiding.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

We presenteren een protocol om levensvatbare mitochondria isoleren van skeletspieren. Wanneer de opbrengst een probleem is, kan het protocol worden gewijzigd door het incuberen van de geïsoleerde spier in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine gedurende 30 minuten in het ijs. Te garanderen een volledige spier spijsvertering met trypsine, de spier volledig moet worden gehakt. Nadat de 30-minuten incubatie, moet de PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine-oplossing volledig worden vervangen door 3 ml van isolatie buffer 1 (IB1). Daarnaast...

<table><tbody><tr><td>95% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; mengsel</td><td>Lokale gasleverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#8242;-difosfaat natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Blauw Rizla-papier</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-proteïneassay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanide p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Samengeperste stikstof</td><td>Lokale gasleverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis-(tetraacetic acid) (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetra-azijnzuur (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Vrij vetzuur runder-serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Mannelijke Sprague Dawley-ratten</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500g</td><td></td></tr><tr><td>Maleïnezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstofelektrode schijf</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus V1.01 Software</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem homogenisatoren</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0,0125mm &amp;#215; 25mm) membraan</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>SKIL 3320 kolomboormachine</td><td>IJswinkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriale isolatie van skeletspieren

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriën zijn organellen beheersen het leven en de dood van de cel. Ze nemen deel aan de belangrijkste metabolische reacties, synthetiseren het grootste deel van de ATP, en regelen een aantal signaaltransductiecascades 2,3. Vroegere en huidige onderzoekers hebben geïsoleerd mitochondriën van ratten en muizen weefsels, zoals lever, hersenen en hart 4,5. In de afgelopen jaren, hebben veel onderzoekers zich op het bestuderen van de mitochondriale functie van de skeletspieren. Hier beschrijven we een methode die wij met succes hebben gebruikt voor de isolatie van de mitochondriën van skeletspieren 6. Onze procedure schrijft voor dat alle buffers en reagentia zijn vers gemaakt en moet ongeveer 250-500 mg van de skeletspieren. We bestudeerden mitochondria geïsoleerd van rat en muis gastrocnemius en diafragma, en de rat extraoculaire spieren. Mitochondriale eiwit concentratie wordt gemeten met de Bradford assay. Het is belangrijk dat mitochondriale monsters worden bewaard ijskoud tijdens de voorbereiding en dat de functionele studies worden uitgevoerd binnen een relatief korte tijd (~ 1 uur). Mitochondriale ademhaling wordt gemeten met behulp van polarografie met een Clark-type elektrode (Oxygraph systeem) bij 37 ° C 7. Ijking van de zuurstof elektrode is een belangrijke stap in dit protocol en moet dagelijks worden uitgevoerd. Geïsoleerde mitochondria (150 ug) worden toegevoegd aan 0,5 ml van de experimentele buffer (EB). Staat twee ademhaling begint met toevoeging van glutamaat (5mm) en malaat (2,5 mm). Vervolgens wordt adenosine difosfaat (ADP) (150 uM) toegevoegd aan de staat 3 te starten. Oligomycin (1 uM), een ATPase synthase blocker, wordt gebruikt om de toestand 4 schatten. Ten slotte carbonyl cyanide p-[trifluormethoxy]-fenyl-hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wordt toegevoegd aan 5 measurestate, of afgekoppeld ademhaling 6. De respiratoire controle ratio (RCR), de verhouding van toestand 3 naar toestand 4, wordt berekend na elk experiment. Een RCR ≥ 4 wordt beschouwd als bewijs van een levensvatbare mitochondria voorbereiding. Kortom, presenteren we een methode voor de isolatie van levensvatbare mitochondria van de skeletspieren die kunnen worden gebruikt in de biochemische (bijvoorbeeld enzymactiviteit, immunodetectie, proteomics) en functionele studies (mitochondriale ademhaling).

Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van Scorrano<em&gt; Et al..</em&gt; (2007). Het mitochondriale isolatie procedure vereist ongeveer 2 uur. De mitochondriale ademhaling kan worden voltooid in ongeveer 1 uur.

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Mitochondriën zijn organellen die het leven en de dood van de cel beheersen. Ze nemen deel aan cruciale metabole reacties, synthetiseren het grootste deel van het ATP en ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van mitochondriën en het uitvoeren van mitochondriale respiratie. Dit wordt bereikt door eerst skeletspieren te isoleren van Sprague-Dawley ratten. Vervolgens wordt de spier gehomogeniseerd en worden de mitochondriën geïsoleerd door middel van centrifugatie.De proteïneconcentratie wordt vervolgens bepaald met behulp van de Bradford-assay. Ten slotte wordt de mitochondriale respiratie gemeten via polygrafie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die het zuurstofverbruik tijdens de verschillende toestanden van de mitochondriale respiratie laten zien.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de skeletspieren, zoals het effect van verschillende interventies op de mitochondriële functie. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het metabolisme van skeletspieren, kan ze ook worden toegepast op andere organen zoals de lever, hersenen, nieren of vrijwel elk ander weefsel. Bereid vóór aanvang van de procedure de volgende oplossingen voor om skeletspieren te isoleren: PBS, PBS plus 10 millimolar EDTA, mitochondriaal isolatiebuffer 8x, isolatiebuffer 1 of IB1, isolatiebuffer 2 of IB2 en experimentele buffer of EB.Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor instructies. Zet vervolgens de centrifuge aan en stel deze in op 4 °C. Zet een waterbad aan en stel dit in op 37 °C.Plaats drie bekerglazen van 10 milliliter, een potter-homogenisator, weefselmalers, een kleine chirurgische schaar en 10 microcentrifugebuisjes in een geschikte bak op ijs. Alles moet gedurende het gehele experiment ijskoud blijven. Plaats IB één en IB twee op ijs en EB in een warm waterbad.Voeg vervolgens de volgende oplossingen toe aan de drie bekerglazen op ijs: beker één 10 milliliters PBS, beker twee 10 milliliters PBSEDTAs, beker drie 3 milliliters ib. 1. Euthanaseer een rat volgens de procedures die zijn goedgekeurd door uw lokale institutionele commissie voor dierenzorg en -gebruik.Isoleer vervolgens snel 250 tot 500 milligram skeletspier met een pincet en Mayo-scharen. Spoel dit in beker één en breng het daarna over naar beker twee om de spier te homogeniseren. Breng het vervolgens over naar beker drie en hak het tot slot fijn met de schaar.Overbreng de oplossing naar de Potter-Elva gem homogenisator en homogeniseer het spierweefsel 10 keer met een gemotoriseerde stamper, waarbij de buis constant in ijs wordt bewaard. Overbreng vervolgens het homogenaat naar vooraf gekoelde microcentrifugebuisjes van 2 mL en centrifugeer 10 minuten bij 700 Gs en 4 °C. Overbreng de supernatant naar een nieuw, vooraf gekoeld microcentrifugebuisje en discard het pellet.Centrifugeer de S-supernatans bij 10.500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, breng de SNAT over naar een nieuwe, vooraf gevulde microcentrifugebuis en label deze als SN één en spiertype Reese. Suspendeer de pellet in 500 µL IB twee en centrifugeer vervolgens bij 10.500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over naar een nieuwe, vooraf gevulde microcentrifugebuis en label deze als SN twee en spiertype.Resuspendeer het uiteindelijke mitochondriële pellet in 100 µL IB twee. Centrifugeer dit enkele seconden in een minicentrifuge. Indien er een pellet aanwezig is, breng dan het supernatant over naar een nieuwe, vooraf gevulde microcentrifugebuis en gooi het pellet weg. De kalibratie van de zuurstofelektrode is een cruciale stap in dit protocol en moet dagelijks worden uitgevoerd.De kalibratie van de elektrode kan worden voltooid tijdens de isolatie van de mitochondriën. Begin met het toevoegen van 100 milliliters gedestilleerd water aan een 250 milliliter kolf en roer krachtig gedurende 20 minuten. Om het water te equilibreren met atmosferisch gas, bedek de GRAT-elektrode met een paar druppels 50% kaliumchloride.Plaats vervolgens een klein stukje blauw rizla-rolpapier op de elektrode. Leg daarna een stukje PTFE-membraan bovenop het rolpapier.Breng de binnenring aan met de ringapplicator en plaats vervolgens de buitenring in de elektrodegroef. Sluit de elektroden aan en assembleer de grotere plastic ringbasis, de mitochondriële kamer en de waterslangen. Zet de GRAT-dozen aan en start de GRAS-software.Voeg het geëquilibreerde water toe aan de mitochondriale kamer. Voeg vervolgens een roerstaf toe om het roeren in te schakelen. Klik op hardware.Roer vervolgens op een bepaalde snelheid. Stel de snelheid in op 60 en klik op aan. Begin daarna een nieuw experiment.Klik op kalibreren en vervolgens op kalibratie van de vloeibare fase. Wijzig voor vak één de temperatuur naar 37 °C en klik twee keer op oké. Wanneer 'override' verandert in oké, klik hierop en open de stikstoftank.Plaats de tip die verbonden is met de stikstoftank in de kamer en creëer een zuurstofvrije omgeving. Klik op oké zodra er wordt overgeschakeld van de override-modus. Aspireer het water en voeg 500 µL EB toe aan de mitochondriale kamers.Sluit de kamer af met een zuiger. Als er meerdere boxen worden gebruikt, herhaal dan de stappen vanaf de kalibratiestap voor elke box. Start een nieuw experiment en laat dit ongeveer één minuut lopen.Om het signaal te stabiliseren, voegt u het benodigde volume mitochondriën-suspensie toe om op 150 micrograms per kamer uit te komen. Markeer de gebeurtenis en laat de meting lopen. Voeg gedurende één minuut 10 microliters warme 250 millimolar glutamaat en 125 millimolar malaat toe voor een eindconcentratie van vijf millimolar glutamaat en 2.5 millimolar malaat; markeer dit en laat de meting één minuut lopen.Dit wordt gedefinieerd als toestand twee. Voeg vervolgens 7,5 µL van 10 mM a DP toe voor een eindconcentratie van 150 µM. Markeer dit vervolgens en laat het 30 seconden lopen.Dit wordt gedefinieerd als staat drie. Voeg nog eens 7,5 µL van 10 mM ADP toe en laat het 1,5 minuut lopen. Voeg 0,5 µL koude 10 mM oligomycine toe voor een eindconcentratie van 1 µM en laat het drie minuten lopen.Dit wordt gedefinieerd als toestand vier. Voeg één µL koude, 0,1 mM FCCP toe voor een eindconcentratie van 0,2 µM, en laat de RUM gedurende drie minuten lopen. Dit wordt gedefinieerd als toestand vijf.Beëindig het experiment zodra dit is voltooid en sla het op. Bepaal de respiratiesnelheden met behulp van de raft-software. Voer de normalisatiefactor in.Bij het toevoegen van 150 microgram mitochondrieel eiwit is de normalisatiefactor 0,15. Bereken de genormaliseerde respiratiesnelheden voor de verschillende respiratietoestanden. Bereken de respiratory control ratio of RCR door toestand drie te delen door toestand vier.Deze figuur toont een representatieve registratie van het zuurstofverbruik door skeletspier-mitochondriën. Nadat het electrodesignaal is gestabiliseerd, wordt het mitochondriënmonster aan de GRAT-kamer toegevoegd. In staat twee begint de respiratie met de toevoeging van glutamaat en malaat.Toevoeging van ADP verhoogt het zuurstofverbruik. Definiëren van status drie. Respiratie ATP-syntase wordt geblokkeerd door de toevoeging van oligomycine om status vier respiratie te verkrijgen.Ten slotte wordt FCCP toegevoegd om de mitochondriale respiratie te ontkoppelen. Dit diagram toont representatieve zuurstofconsumptiesnelheden voor status 2, 3, 4 en vijf. De respiratoire controle ratio of RCR wordt voor elk experiment berekend.Een RCR van meer dan vier wordt beschouwd als bewijs voor een levensvatbare mitochondriaal preparaat. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de mitochondriale monsters te allen tijde op ijs te bewaren. Volg deze procedure.Andere methoden, zoals Western blots, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de inhoud van mitochondriale eiwitten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe mitochondriën uit skeletspieren kunnen worden geïsoleerd, evenals van de mitochondriale respiratie.

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Hier wordt een quadricepsspiermonster genomen van een geanesthetiseerd varken en mitochondriën worden geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Vervolgens worden de ademhalingssnelheden van mitochondriale ademhalingsketencomplexen I, II en IV bepaald met behulp van hoogwaardige respirometrie.

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Mitochondriën zijn belangrijke metabole organellen die een hoog niveau van fenotypische plasticiteit in de skeletspieren vertonen. De import van eiwitten uit het cytosol is een kritieke route voor organelbiogenese, essentieel voor de uitbreiding van het reticulum en het behoud van de mitochondriale functie.  Daarom dient eiwitimport als een barometer van cellulaire gezondheid.

Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Methode voor de enzymatische dissociatie, oppervlakte-etikettering en de zuivering door flowcytometrie van fibro / adipogenic en myogene voorlopercellen uit muizen skeletspieren.

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Leer mitochondriën isoleren uit skeletspierweefsel en ademhaling meten via polygrafie. Deze methode beoordeelt zuurstofverbruik in verschillende ademhalingsstaten voor metabool onderzoek.

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Meer video's verkennen