Mitochondriale Isolatie van skeletspieren
30 maart 2011
Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van Scorrano Et al.. (2007). Het mitochondriale isolatie procedure vereist ongeveer 2 uur. De mitochondriale ademhaling kan worden voltooid in ongeveer 1 uur.
Het algemene doel van deze procedure is om mitochondriën te isoleren en mitochondriale ademhaling uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst skeletspierweefsel te isoleren van met spray behandelde ratten. Vervolgens wordt de spier gehomogeniseerd en worden de mitochondriën geïsoleerd door centrifugatie.
De eiwitconcentratie wordt vervolgens bepaald met behulp van de Bradford-test. Ten slotte wordt mitochondriale ademhaling gemeten door polygrafie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die zuurstofverbruik tonen via de verschillende mitochondriale ademhalingstoestanden.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van skeletspier te beantwoorden, zoals het effect van verschillende interventies op de mitochondriale functie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de stofwisseling van skeletspieren, kan deze ook worden toegepast op andere organen zoals lever, hersenen, nieren of vrijwel elk weefsel. Voordat u met de procedure begint, bereidt u de volgende oplossingen voor: P-B-S-P-B-S plus 10 millimolair EDTA, acht maal mitochondriaal buffer isolatiebuffer één of IB één, isolatiebuffer twee of IB twee en experimentele buffer of eb.
Zie het bijbehorende schriftelijke protocol voor instructies. Zet vervolgens de centrifuge aan en stel deze in op vier graden Celsius. Zet een waterbad aan en stel deze in op 37 graden Celsius.
Leg in een mooie emmer drie bekers van 10 milliliter, Potter-elleboog, gem-weefselgrinders, kleine chirurgische schaar en 10 microcentrifugebuizen op ijs. Alles moet tijdens het experiment ijskoud blijven. Plaats IB één en IB twee op IJS en EB in een warm waterbad.
Voeg vervolgens de volgende oplossingen toe aan de drie bekers op ijs: beker één 10 milliliter PBS, beker twee 10 milliliter P-B-S-E-D-T-A. Beker drie. Drie milliliter van ib. Eén euthaniseer een rat volgens de procedures die zijn goedgekeurd door uw lokale institutionele commissie voor dierenwelzijn en -gebruik.
Isoleer vervolgens snel 250 tot 500 milligram skeletspier met behulp van een pincet en Mayo Clinic-schaar. Spoel het af in beca één, breng het vervolgens over naar beca twee om de spier te homogeniseren. Breng het eerst over naar beker drie en hak het tenslotte fijn met een schaar.
Breng de oplossing over naar de Potter Elva gem-homogenisator. Homogeniseer de spier met een gemotoriseerde stamper 10 keer, waarbij de buis altijd op ijs blijft. Breng vervolgens de homogenaat over naar voorgekoelde microcentrifugebuizen van twee milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 700 Gs bij vier graden Celsius. Breng de S-supernatant over naar een nieuwe voorgevulde microcentrifugebuis en gooi de pellet weg. Centrifugeer.
De S-supernatant bij 10.500 Gs gedurende 10 minuten Bij vier graden Celsius, breng de SNAT over naar een nieuwe voorgevulde microcentrifugebuis en label deze met SN één en spiertype Reese. Suspendoor de pellet in 500 microliter IB twee, centrifugeer vervolgens bij 10.500 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supinate over naar een nieuwe voorgevulde microcentrifugebuis en label deze met SN twee en spiertype.
Suspendoor de laatste mitochondriale pellet in 100 microliter IB twee. Draai het een paar seconden in een minifuge. Als er een pellet is, breng de supinate over naar een nieuwe voorgevulde microcentrifugebuis en gooi de pellet weg. Kalibratie van de zuurstofedode is een sleutelstap in dit protocol en moet dagelijks worden uitgevoerd.
Kalibratie van de elektrode kan worden voltooid tijdens de mitochondriale isolatie. Om te beginnen, voegt u 100 milliliter gedistilleerd water toe aan een 250 milliliter fles en roert u krachtig gedurende 20 minuten. Om het water in evenwicht te brengen met atmosferisch gas, bedekt u de GRAT-elektrode met een paar druppels 50% kaliumchloride.
Plaats vervolgens een klein stukje blauw rizla-rolpapier bovenop de elektrode. Dan een stukje PTFE-membraan. Bovenop het rolpapier.
Breng de binnenste ring aan met behulp van de ringapplicateur en plaats vervolgens de buitenste ring in de elektrodegroeve. Sluit de elektroden aan en monteer de grotere kunststof ringbasis, mitochondriale kamer en waterslangen. Zet de GRAT-boxen aan en start de GRAS-software.
Voeg het geëquilibreerde water toe aan de mitochondriale kamer. Voeg vervolgens een roerstaafje toe om de roerstaaf aan te zetten. Klik op hardware.
Roer vervolgens op snelheid. Stel de snelheid in op 60 en klik op. Begin vervolgens met een nieuw experiment.
Klik op kalibreren en vervolgens op vloeistofkalibratie. Voor doos één verandert u de temperatuur in 37 graden Celsius en klikt u twee keer op OK. Wanneer override verandert in OK, klikt u hierop en opent u de stikstofgastank.
Plaats de punt die is verbonden met de stikstoftank in de kamer en stel nul zuurstof in. Klik op OK wanneer deze van override verandert. Aspireer het water en voeg 500 microliter EB toe aan de mitochondriale kamers.
Versluit de kamer met een plunjer. Als u meerdere dozen gebruikt, herhaalt u vanaf de kalibratiestap voor elke doos. Start een nieuw experiment en laat het ongeveer een minuut lopen.
Om het signaal te stabiliseren, voegt u het benodigde volume van de mitochondriënsuspensie toe om 150 microgram in elke kamer aan te brengen. Markeer het evenement en laat het lopen. Voeg gedurende één minuut 10 microliter warme 250 millimolair glutamaat, 125 millimolair malaat toe voor een uiteindelijke concentratie van vijf millimolair glutamaat, 2,5 millimolair malaat. Markeer en laat het één minuut lopen.
Dit wordt gedefinieerd als toestand twee. Voeg vervolgens 7,5 microliter 10 millimolair a DP toe voor een uiteindelijke concentratie van 150 micromolair. Markeer vervolgens en laat het 30 seconden lopen.
Dit wordt gedefinieerd als toestand drie. Voeg nog eens 7,5 microliter 10 millimolair a DP toe
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een procedure om mitochondria te isoleren uit skeletspieren en hun respiratie te meten. De methode maakt het mogelijk om de mitochondriële functie te beoordelen via een analyse van het zuurstofverbruik.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Stofwisseling
Achtergrond
- Mitochondriën spelen een cruciale rol bij de energieproductie.
- Inzicht in de mitochondriale respiratie is essentieel voor het bestuderen van metabole stoornissen.
- Dit protocol is aangepast van gevestigde methodologieën.
- De isolatie van mitochondriën is kritiek voor een nauwkeurige meting van hun functie.
Doel van de studie
- Om mitochondriën te isoleren uit skeletspierweefsel.
- Om mitochondriële respiratiesnelheden te meten.
- Om het zuurstofverbruik in verschillende mitochondriële respiratietoestanden te analyseren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van skeletspieren van spray-dry ratten.
- Homogenisatie van spierweefsel.
- Centrifugatie om mitochondriën te isoleren.
- Bepaling van de proteïneconcentratie met behulp van de Bradford-assay.
- Meting van de mitochondriale respiratie via polygrafie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van mitochondriën uit skeletspierweefsel.
- Kwantitatieve beoordeling van de mitochondriale respiratie.
- Resultaten duiden op variërende zuurstofconsumptie over verschillende respiratietoestanden.
Conclusies
- Het protocol isoleert effectief mitochondriën voor respiratieonderzoek.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de mitochondriale functie in metabole processen.
- Deze methode kan worden toegepast in verder onderzoek naar spiermetabolisme.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het isoleren van functionele mitochondriën uit skeletspierweefsel maakt het mogelijk om mechanistische risico's van metabole targets in de preklinische fase van discovery te minimaliseren. Kwantitatieve respiratoire read-outs bieden voorspellende zekerheid voor targetvalidatie en de analyse van signaalpaden. Deze methode ondersteunt vroege go/no-go beslissingen door drempelwaarden voor mitochondriale levensvatbaarheid vast te stellen voorafgaand aan de screening van verbindingen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door mitochondriële functie te koppelen aan het metabolisme van skeletspieren en de energiehomeostase.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk via gestandaardiseerde isolatie van levensvatbare mitochondriën, met een RCR ≥4 als functionele benchmark.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het kwantificeren van respiratory control ratios die de mitochondriële integriteit en koppelingsefficiëntie weerspiegelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde mitochondriale systemen voor voor stroomafwaartse biochemische en functionele assays, waaronder enzymactiviteit en proteomics.
- Operationele waarde: Garandeert assay-standaardisatie via dagelijkse kalibratie van de zuurstofelektrode en consistente eiwitnormalisatie met behulp van de Bradford-assay.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door middel van reproduceerbare metingen van respiratie in status 2-5 onder gecontroleerde substraat- en remmercondities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor de ziekte door mitochondriale respiratie te bestuderen in skeletspierweefsel, een cruciaal weefsel bij metabole stoornissen.
- Operationele waarde: Biedt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via kwantitatieve zuurstofconsumptie over verschillende respiratietoestanden.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt besluitvorming door ontkoppelde (state 5) en ATP-gekoppelde (state 3) respiratie te meten om de bioenergetische gezondheid te beoordelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot lead-identificatie en ondersteunt programma's die gericht zijn op mitochondriën bij metabole ziekten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door mitochondriën te isoleren om pathways die betrokken zijn bij ATP-synthese en metabole signalering te verduidelijken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare respiratiemetingen die vergelijking van de effecten van verbindingen op het zuurstofverbruik mogelijk maken.
- Analytics: Genereert kwantitatieve read-outs (respiratie state 2-5, RCR) die teams helpen om condities te vergelijken en de mitochondriële functie te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door functionele mitochondriële data te leveren die relevant zijn voor spiermetabolisme en modellen voor energieverbruik.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar isolatie- en respiratieplatform dat toepasbaar is op verschillende typen skeletspieren en aanpasbaar is voor andere weefsels.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in mitochondriale levensvatbaarheid, vermindering van mechanische ambiguïteit in studies naar energiemetabolisme.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van mitochondriale isolatie en respiratie-assays.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij programma's voor metabole targets.
- Portfolio-impact: Risico-gecorrigeerde prioritisering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van respiratory control ratios en substraatspecifieke respiratieprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in technieken voor mitochondriële isolatie, centrifugatie en respiratiemeting.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder homogenisatoren, centrifuges ingesteld op 4°C, waterbaden op 37°C en polarografische zuurstofelektrodesystemen.
- vereist cross-team standaardisatie van bufferbereiding, dagelijkse kalibratie van de elektroden en strikte behandeling van monsters in ijskoud milieu.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijstellen van de hoeveelheid spierweefsel (250-500 mg) en de mitochondriële eiwitbelading (150 µg) voor verschillende typen skeletspieren.
- Praktische beperkingen omvatten de behoefte aan verse reagentia, een kort tijdvenster voor functionele studies (~1 uur na isolatie) en de dagelijkse kalibratie van zuurstofelektroden.
