Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:26 min • July 1st, 2026
Begin with a tube of macrophage protein extract containing host immune receptors.
Add inactivated pathogenic bacteria to provide surface antigens specific to pathogenic strains.
Incubate with rotation to enable immune receptors to bind bacterial antigens, forming receptor–antigen complexes.
Add a crosslinking agent and incubate with shaking to stabilize receptor–antigen complexes.
Introduce a quenching agent to stop the crosslinking reaction.
Add buffer and centrifuge to pellet the complexes.
Remove excess reagents, then resuspend the pellet in a second crosslinking agent to further stabilize the complexes.
Centrifuge and wash the pellet with buffer.
Add fluorescently labeled antibodies and vortex.
Incubate under cold, dark conditions to allow antibodies to bind receptor–antigen complexes.
Resuspend the cells in buffer containing serum.
Finally, analyze receptor–antigen complexes using flow cytometry.
As complexes pass through the laser, they emit fluorescence signals that correlate with receptor-antigen binding, highlighting host-pathogen recognition.
Incubate one times 10 to the power of six whole inactivated Mycobacterium tuberculosis cells with 50 microliters of protein extract from one times ten to the power of six macrophages overnight at 4 degrees Celsius in a rotating microtube holder.
The next day, to stain the protein bacteria complex, add the anti-human SLAMF1 antibody to the microtube, vortex the mixture, and incubate overnight for 30 minutes at 4 degrees Celsius in the dark. After washing the protein bacteria complexes with FACS, resuspend them in FACS buffer and acquire the sample on a flow cytometer.
Overzicht
Dit artikel presenteert een fluorescentie-gebaseerde assay om de interactie tussen Mycobacterium tuberculosis en de immuunreceptor SLAMF1 te bestuderen. Het protocol maakt de detectie en kwantificering van receptor-antigeenbindingsgebeurtenissen mogelijk met behulp van flowcytometrie, wat inzicht biedt in de mechanismen van gastheer-pathogeenherkenning.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Microbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van hoe immuunreceptoren van de gastheer bacteriële pathogenen herkennen, is essentieel voor het ontrafelen van immuunafweermechanismen.
- SLAMF1 is een immuunreceptor die betrokken is bij de herkenning van pathogenen.
- Fluorescentie-assays maken een gevoelige detectie van moleculaire interacties mogelijk.
- Flowcytometrie maakt kwantitatieve analyse van fluorescentielabelcomplexen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een fluorescentie-assay te ontwikkelen en te demonstreren voor het detecteren van interacties tussen immuunreceptoren van de gastheer en oppervlakteantigenen van M. tuberculosis.
- Om kwantificering van receptor-antigeenbinding via flowcytometrie mogelijk te maken.
- Om een reproduceerbaar protocol te bieden voor het bestuderen van gastheer-pathogeeninteracties.
Gebruikte methoden
- Bereiding van macrofaageiwitextracten die immuunreceptoren bevatten.
- Incubatie met geïnactiveerde M. tuberculosis-cellen om receptor-antigeenbinding mogelijk te maken.
- Stabilisatie van complexen met behulp van crosslinking-middelen en quenching-stappen.
- Labeling van complexen met fluorescent gelabelde anti-humane SLAMF1-antilichamen.
- Analyse van fluorescentiesignalen via flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Vorming van stabiele receptor-antigeencomplexen tussen macrofaagextracten en bacteriële antigenen.
- Succesvolle fluorescente markering van SLAMF1-gebonden complexen.
- Detectie en kwantificering van receptor-antigeeninteracties via flowcytometrie.
- De fluorescentie-intensiteit correleert met de mate van gastheer-pathogeenherkenning.
Conclusies
- De beschreven fluorescentie-assay maakt gevoelige detectie van interacties tussen immuunreceptoren en M. tuberculosis-antigenen mogelijk.
- Flowcytometrie biedt een kwantitatieve analyse van deze interacties.
- Dit protocol kan worden aangepast voor het bestuderen van andere herkenningsevents tussen gastheer en pathogeen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Kwantitatieve analyse van interacties tussen macrofaagreceptoren en pathogene bacteriën is essentieel voor het verminderen van risico's bij vroege immunologische targets en voor het verduidelijken van herkenningsmechanismen tussen gastheer en pathogeen. Detectie van receptor-antigeencomplexen via flowcytometrie maakt voorspellend vertrouwen in targetvalidatie mogelijk en biedt input voor beslissingen over portfoliotriage in onderzoek naar infectieziekten. Deze aanpak ondersteunt de translationele continuïteit van de ontdekking tot de preklinische evaluatie van immuunmodulerende strategieën.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse mogelijk van de interactie tussen immuunreceptoren en bacteriële antigenen.
- Ondersteunt mechanische risico-reductie door receptor-pathogeen bindingsgebeurtenissen te kwantificeren.
- Faciliteert functionele validatie van immunologische targets in gastheer-pathogeensystemen.
- Levert gegevens op om immuunreceptor-targets te prioriteren of deprioriteren op basis van bindingsprofielen.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbare, kwantitatieve assay vast voor interacties tussen immuunreceptoren en bacteriën.
- Levert gestandaardiseerde fluorescentie-uitlezingen die geschikt zijn voor vergelijkende screening.
- Maakt schaalbaarheid mogelijk voor het evalueren van meerdere receptor-antigeenparen of condities.
- Ondersteunt downstream screening van modulatoren die de binding tussen receptor en pathogeen beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro receptor-antigeenbindingsgegevens aan ziekterelevante immuunmechanismen.
- Biedt continuïteit van moleculaire ontdekking tot preklinische modellering van de immuunrespons.
- Informeert de risicogecorrigeerde voortgang van immunomodulerende kandidaten gericht op gastheer-pathogeenherkenning.
- Ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers voor translationele studies indien relevant.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op flowcytometrie gebaseerde assay is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot prekliniek door kwantitatieve validatie van immuunreceptoren mogelijk te maken en mechanistische studies naar gastheer-pathogeeninteracties te ondersteunen.
- Discovery Biology: Kwantificeert receptor-antigeenbinding om immuunherkenningspaden te verduidelijken.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare fluorescentie-outputs voor assay-ontwikkeling.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen voor het vergelijken van receptorinteracties onder verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen moleculaire bevindingen en preklinische immuunresponstmodellen wanneer dit door gegevens wordt ondersteund.
- Enterprise Reuse: Biedt een modulair assayplatform dat aanpasbaar is aan diverse immuunreceptoren en pathogenen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van immuun-targets en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert receptor-antigeenbindingsassays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt onderbouwde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk binnen R&D voor infectieziekten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van immuunmodulerende strategieën die gericht zijn op gastheer-pathogeeninteracties.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immunologie, flowcytometrie en eiwitlabelingstechnieken.
- Toegang tot flowcytometrie-instrumentatie en gevalideerde fluorescente antilichamen is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van assaycondities en data-analyseprotocollen over teams heen.
- Aanpassing voor verschillende immuunreceptoren of bacteriële stammen kan vereist zijn.
- Afhankelijk van de kwaliteit van eiwitextracten en de specificiteit van antilichaamreagentia.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd Mycobacterium tuberculosis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Polarisatie van M1 en M2 humane monocyt-afgeleide cellen en analyse met flowcytometrie bij mycobacterium tuberculosis-infectie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Voorspelling van de significantie van antilichamen tegen rode bloedcellen met behulp van de monocyt-macrofaagtest
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Fluorescence-Based Assay for Investigating Macrophage Receptor Interactions with Bacterial Antigens
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Flow Cytometry Staining of Mycobacterium tuberculosis Infected Macrophage Subpopulations
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026