Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:32 min • July 1st, 2026
Take a soil extract containing bacteriophages, including Arthrobacter phages, pre-mixed with a growth medium.
Add Arthrobacter bacteria and incubate under agitation.
Arthrobacter phages attach to the bacterial surface and inject their DNA to produce new phages.
The host cells lyse to release progeny phages, enriching the medium with Arthrobacter phages.
Dilute this medium to reduce the phage concentration.
Add fresh Arthrobacter cells and calcium ions, which aid in phage infection.
Mix with a soft agar and pour onto a nutrient agar plate. The solidifying soft agar immobilizes the bacteria and restricts the phage spread.
Upon incubation, each phage infects a nearby host cell. It then produces progeny phages that infect neighboring bacteria, allowing localized infection.
The uninfected bacterial cells grow, while the infected bacterial cells lyse, detected as clear zones called plaques over a bacterial lawn.
These plaques contain progeny phages, ready for downstream use.
Begin this procedure by adding 1 to 2.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture to each of the flasks containing filter sterilized LB soil extract mixture. If the OD 600 of the culture is 0.5 to 0.7, use 1 milliliter. If the OD600 is higher than 0.7, use 2.5 milliliters.
Shake the flasks at 250 RPM at 30 degrees Celsius for approximately 24 hours in a shaking incubator. After the 24 hour incubation period, remove the enrichment flasks from the shaking incubator. Dilute the enrichment samples tenfold in phage buffer.
Set up culture tubes with 0.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture. Add various amounts from 5 microliters to 500 microliters of the diluted enrichment culture to the culture tubes.
Add calcium chloride to the culture tubes to make a final concentration in 5 milliliters equal to the concentration present in the original enrichment flask. Use a range of different calcium chloride concentrations to select for many phages with varying calcium chloride dependencies. Add 4.5 milliliters of LB top agar to each culture tube, and pour the mixture onto an LB agar plate.
Swirl gently to distribute evenly across the plate and allow the top agar to solidify for approximately 15 minutes. Invert the plates and incubate at 30 degrees Celsius overnight to 48 hours. Vary the incubation times to optimize for the phages present.
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde verrijkingstechniek voor het isoleren van Arthrobacter-bacteriofaagspecies uit bodemmonsters. Het protocol combineert verrijkingscultuur- en plaque-assaymethoden om fagen te amplificeren, te detecteren en te isoleren, waarbij deze zichtbaar worden als heldere lysiszones op een bacterieel gazon.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Bacteriofaagonderzoek
- Milieuvirologie
Achtergrond
- Bacteriofagen zijn virussen die bacteriën infecteren en een sleutelrol spelen in de microbiële ecologie.
- Arthrobacter-soorten zijn veelvoorkomende bodembacteriën en zijn belangrijk voor milieuonderzoeken.
- Het isoleren van fagen uit milieu-monsters vereist efficiënte verrijkings- en detectietechnieken.
- Plaque-assays zijn de standaard voor het visualiseren en kwantificeren van fagenactiviteit.
Doel van de studie
- Om de verrijking en isolatie van Arthrobacter-fagen uit bodemmonsters te optimaliseren.
- Om een reproduceerbaar protocol aan te tonen voor het amplificeren en detecteren van fagen met behulp van plaque-assays.
- Om downstream-toepassingen met geïsoleerde fagen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van bodemextract met bacteriofagen en mengen met groeimedium.
- Toevoeging van Arthrobacter-bacteriën en incubatie onder agitatie bij 30°C gedurende 24 uur.
- Verdunning van het verrijkte medium en toevoeging van verse bacteriële cellen en calciumchloride.
- Mengen met zachte agar en uitplaten op nutrient agar-platen voor plaque-assay.
- Incubatie van de platen om fageninfectie en plaquevorming mogelijk te maken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verrijking en amplificatie van Arthrobacter-fagen uit bodemmonsters.
- Vorming van heldere plaques op bacteriële lawns, wat duidt op gelokaliseerde faag-geïnduceerde lysis.
- Optimalisatie van calciumchlorideconcentraties om te selecteren op fagen met verschillende afhankelijkheden.
- Isolatie van nakomelingen-fagen uit plaques voor verder onderzoek.
Conclusies
- Het geoptimaliseerde verrijkings- en plaque-assayprotocol isoleert effectief Arthrobacter-fagen uit bodem.
- Het aanpassen van de dichtheid van de bacteriële cultuur en de concentratie calciumchloride verbetert het herstel van fagen.
- Deze methode ondersteunt downstream-toepassingen in de fagenbiologie en milieumicrobiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Efficiënte isolatie van Arthrobacter-bacteriofagen uit milieu monsters maakt de ontwikkeling van robuuste biologische instrumenten mogelijk voor microbiologisch onderzoek en biotechnologische toepassingen. De workflow voor verrijking en plaque-assay biedt een reproduceerbare basis voor het genereren van goed gekarakteriseerde faagvoorraden, wat de vroege ontdekking en assay-ontwikkeling in biofarmaceutische R&D ondersteunt. Deze capaciteit is essentieel voor het verder ontwikkelen van technologieën op basis van bacteriofagen en voor het verminderen van risico's in pijplijnen voor de validatie van microbiële targets.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om bacteriofaag-gastheerinteracties te onderzoeken voor de validatie van microbiële targets.
- Ondersteunt het biologische risicobeheer door fagen met een gedefinieerde gastheerspecificiteit te isoleren.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van daaropvolgende studies naar faagbiologie.
Screening & assayontwikkeling
- Genereert gevalideerde faagvoorraden voor gestandaardiseerde plaque-assays.
- Biedt reproduceerbare, kwantitatieve plaque-uitlezingen voor de optimalisatie van assays.
- Ondersteunt schaalbare workflows voor het screenen van faag-bacterie-interacties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt continuïteit mogelijk van de isolatie van omgevingsfagen tot de ontwikkeling van preklinische modellen wanneer dit relevant is.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van faagkandidaten voor verdere karakterisering.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en assay-ontwikkeling en levert fundamentele faagvoorraden en kwantitatieve resultaten voor daaropvolgende screening en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten met betrekking tot faag-gastheerspecificiteit en infectiedynamiek.
- Screening: Levert reproduceerbare plaque-assays voor de vergelijkende evaluatie van faagactiviteit.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van lysiszones mogelijk om de infectiviteit van fagen te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Legt de basis voor het verder brengen van faagkandidaten naar preklinische evaluatie wanneer dit wordt ondersteund door aanvullende gegevens.
- Enterprise Hergebruik: Stelt een gestandaardiseerd protocol vast voor de herhaalde isolatie en karakterisering van milieufagen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van fagen en de validatie van doelwitten.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor verrijking en plaque-assays voor een betere reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-beslissingen voor de verdere ontwikkeling van faagkandidaten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van onderzoeksinitiatieven op basis van fagen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microbiologie en faagbiologie.
- Toegang tot schudincubatoren, spectrofotometers en infrastructuur voor steriele techniek is noodzakelijk.
- Cross-team standaardisatie van plaque-assaycondities is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassing van verrijkingsparameters kan nodig zijn voor verschillende milieu-monsters of bacteriële gastheren.
- Afhankelijk van de optimalisatie van calciumchlorideconcentraties en incubatietijden voor een maximaal faagherstel.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Inzicht in de impact van gematigde bacteriofagen op hun lysogenen door middel van transcriptomics
Gerelateerde video's
0 Bekeken
T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bacteriofaagverwijdering uit geïnfecteerde Salmonellaculturen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Antibiotic-Resistant Bacteria from a Water Sample for Molecular Analysis
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Preparing a Soil Bacterial Culture for Bacteriophage Infection
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bioprospectie van extremofiele micro-organismen om milieuvervuiling aan te pakken
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en identificatie van watergedragen antibioticaresistente bacteriën en moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026