Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:40 min • July 1st, 2026
Take epithelial cell monolayers. Add diluted supernatants from a virus-infected mouse tissue homogenate.
Incubate for viral adsorption, then wash.
Cover the cells with agar-containing medium, forming a semisolid overlay, and incubate.
The virus enters cells, replicates, and lyses them, releasing new viruses.
The solidified agar restricts viral spread, forming clear zones called plaques.
Remove the overlay. Treat with a fixative to inactivate viruses.
Add a permeabilization buffer to disrupt cell membranes.
Add a blocking buffer to prevent non-specific interactions.
Add primary antibodies. Incubate to allow their interactions with viral nucleocapsid proteins.
Wash and add biotin-conjugated secondary antibodies that bind to the primary antibodies.
Rinse and introduce avidin-biotin-peroxidase complexes, which bind to biotin on the secondary antibodies.
Add chromogenic substrates that react with peroxidase to produce brown precipitates, which stain the plaques.
Count the plaques at different dilutions to quantify the viral load in the tissue sample.
Utilizing the supernatant obtained from the tissue homogenates, perform tenfold serial dilution and infect confluent monolayers of Vero E6 cells with one milliliter of each supernatant dilution in triplicates.
Let the virus adsorb for one hour at 37 degrees Celsius in a humidified 5% carbon dioxide incubator. Once done, wash the cells with one milliliter of 1X PBS and then incubate the cells in two milliliters of post-infection media containing 1% agar in the humidified 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius for 72 hours. After the incubation, inactivate the plates in 10% neutral buffered formalin for 24 hours at four degrees Celsius, ensuring the entire plate is submerged.
Take plates out of biosafety level three and wash the cells three times with one milliliter of 0.5% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature. Next, block the permeabilized cells with one milliliter of 2.5 bovine serum albumin or BSA and PBS for one hour at 37 degrees Celsius, followed by incubation in one milliliter of one microgram per milliliter of the SARS-CoV nucleocapsid protein cross-reactive monoclonal antibody 1C7C7 diluted in 2.5 BSA for one hour at 37 degrees Celsius. Wash the cells three times with one milliliter of 1X PBS and develop the plaques using the ABC and diaminobenzene, or DAB, peroxidase substrate kits according to the manufacturer's instructions, then calculate the viral titers as plaque forming units per milliliter.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het kwantificeren van infectieuze SARS-CoV-2 virale ladingen in weefselmonsters van K18 hACE2 transgene muizen met behulp van een plaque-assay. De methode omvat het infecteren van monolagen van epitheelcellen met supernatanten van weefselhomogenaten, gevolgd door immunokleuring en het tellen van plaques om virale titers te bepalen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Onderzoek naar infectieziekten
- Kwantitatieve virale assays
Achtergrond
- Nauwkeurige kwantificering van infectieus virus in weefsels is essentieel voor het evalueren van virale pathogenese en therapeutische interventies.
- Plaque-assays zijn de gouden standaard voor het meten van infectieuze virusdeeltjes.
- K18 hACE2 transgene muizen zijn een veelgebruikt model voor SARS-CoV-2 infectiestudies.
- Immunokleuring verbetert de visualisatie en specificiteit van de plaques.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het kwantificeren van SARS-CoV-2-infecties in weefsels van muizen.
- Om reproduceerbare meting van virale titers mogelijk te maken met behulp van plaque-assays en immunokleuring.
- Om studies naar virale pathogenese en de effectiviteit van interventies in transgene muismodellen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van weefselhomogenaten van virus-geïnfecteerde muizen.
- Tienvoudige seriële verdunning van supernatanten en infectie van Vero E6-celmonolagen.
- Incubatie met een agar-bevattende overlay om virale verspreiding te beperken en plaques te vormen.
- Fixatie, permeabilisatie en blokkering van cellen.
- Immunokleuring met primaire en biotin-geconjugeerde secundaire antilichamen gericht tegen het virale nucleocapside-eiwit.
- Visualisatie met behulp van een avidine-biotine-peroxidasecomplex en een chromogeen substraat (DAB).
- Tellen van plaques en berekening van virale titers als plaque-vormende eenheden per milliliter.
Belangrijkste resultaten
- Er worden heldere, telbare plaques gevormd in geïnfecteerde cellagen.
- Immunokleuring met nucleocapside-specifieke antistoffen verbetert de detectie van plaques.
- Virale titers kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd uit weefselmonsters.
- Het protocol is reproduceerbaar en geschikt voor laboratoriuminstellingen met een hoog inperkingsniveau.
Conclusies
- Het beschreven plaque-assay-protocol maakt een nauwkeurige kwantificering van infectieus SARS-CoV-2 in muizenweefsels mogelijk.
- Immunokleuring verhoogt de specificiteit en duidelijkheid van de plaque-visualisatie.
- Deze methode ondersteunt een robuuste evaluatie van virale infectie- en interventiestudies in transgene muismodellen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantificering van de virale load in geïnfecteerd muisweefsel via een plaque assay biedt een gouden standaard, kwantitatieve read-out voor infectieus virus, wat bijdraagt aan een robuuste target-validatie en mechanistische risicoreductie in antivirale R&D. Deze methode maakt een nauwkeurige meting van virale replicatie en de effectiviteit van interventies mogelijk, wat essentieel is voor vroege ontdekking en preklinische beslispunten. De reproduceerbaarheid en specificiteit zijn cruciaal voor portfolio-triage en translationele continuïteit in pijplijnen voor infectieziekten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve toetsing van antivirale hypothesen in ziekterelateerde muismodellen mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van virale targets door het meten van de infectieuze output.
- Biedt mechanische risicoreductie door onderscheid te maken tussen infectieuze en niet-infectieuze virale particles.
- Vergroot het voorspellende vertrouwen in target engagement en interventie-effecten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gevalideerde, kwantitatieve read-outs van de virale load voor downstream screening-workflows.
- Standaardiseert assay-condities voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen studies.
- Maakt schaalbaarheid en hergebruik van het platform mogelijk voor de evaluatie van verbindingen in omgevingen met hoge inperking.
- Ondersteunt een robuuste assay-ontwikkeling met plaque-detectie verbeterd door immuunkleuring.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante in vivo-modellen voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Waarborgt continuïteit van de ontdekkingsfase tot de preklinische validatie van antivirale effectiviteit.
- Verlaagt het risico bij besluitvorming over verdere ontwikkeling door het bieden van kwantitatieve infectieuze read-outs.
- Ondersteunt het mechanistische begrip van virale pathogenese in modelsystemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit plaque-assay-protocol integreert stappen van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor hypothesetesten, screening en translationele validatie in pipelines voor infectieziekten mogelijk worden gemaakt.
- Discovery Biology: Kwantificeert de infectieuze virale output ter ondersteuning van hypothesetoetsing en biologische risicoreductie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve assay-resultaten voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van virale belastingen over verschillende experimentele condities en interventies mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen in vitro en in vivo bevindingen voor de afstemming van biomarkers en effectiviteit.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd, herbruikbaar platform voor de kwantificering van infectieuze virussen over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen en target-validatie via kwantitatieve infectieuze read-outs.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in laboratoria met hoge inperkingsniveaus.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen antivirale portfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van antivirale kandidaten.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in virologie en ervaring met procedures in hoogbeveiligingslaboratoria (BSL-3).
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor celkweek, immunokleuring en plaque-visualisatie.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende virale stammen of weefseltypen, zoals ondersteund door het protocol.
- Praktische beperkingen omvatten biosafety-vereisten en doorvoercapaciteitsbeperkingen die inherent zijn aan handmatig tellen van plaques.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Plaquing van Herpes Simplex Virussen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Gebruik van Kristalviolet om visueel cytopathisch effectgebaseerd lezen voor virale titratie te verbeteren met behulp van TCID50-testen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Meting van γHV68 infectie in Muizen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Plaque assay voor Murine Norovirus
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Virus Plaque Assay: A Technique to Measure Infectious Herpes Simplex Virus via Quantification of Plaques Formed in Monolayer of Virus-Infected Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026