JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 2:22 min. • August 31st, 2026
Begin met een kweekfles met menselijke embryonale niercellen in een voedingsrijk medium.
Vervang het medium door vers medium dat chloroquine bevat om de afgifte van plasmiden in de cellen te bevorderen.
Neem een mengsel van plasmiden die influenza-oppervlakte-eiwitten, lentivirale kernproteïnen en het lentivirale genoom coderen, samen met calciumfosfaat. Incubeer dit om calciumfosfaat-DNA-complexen te vormen.
Voeg het mengsel toe aan de cellen en meng voorzichtig. Incubeer om het complex via endocytose de cellen in te laten treden. Chloroquine bevordert de endosomale ontsnapping van plasmid DNA.
Binnen in de cel stimuleert het plasmiden-DNA de expressie van zowel influenza- als lentivirale componenten.
Vervang het medium om overtollige complexen te verwijderen.
Incubeer om de virale componenten te laten assembleren en uitstoten als pseudovirussen, die vrijkomen in het cultuurmedium.
Oogst het medium dat de pseudovirussen bevat en centrifugeer dit om celresten neer te slaan.
Verzamel het pseudovirus-bevattende supernatant en bewaar dit bij lage temperaturen voor downstream assays.
Begin met het maken van een enkelcel-suspensie van HEK 293FT-cellen in een compleet DMEM-medium. Voeg tien milliliter van de enkelcel-suspensie toe aan een T75-fles, gevolgd door incubatie bij 37 °C.
Vervang twee uur voor de transfectie het oude medium door tien milliliter vers compleet medium met chloroquine. Meng de reagentia en het plasmid-DNA zoals beschreven in het manuscript. Breng dit mengsel vervolgens over in het medium boven de cellen en schud voorzichtig.
Vervang na incubatie het medium door vijftien milliliters vers compleet DMEM-medium. Oogst na zestigvijf uur het supernatant door middel van centrifugatie. Verzamel het supernatant en verdeel dit in aliquoten.