Bereiding van cryosneden van de muisretina om de permeabiliteit van de retina voor adeno-geassocieerde virussen te beoordelen

Neem een oog geoogst van een muismodel met een verstoorde retinale barrière, vooraf geïnjecteerd met adeno-geassocieerd virus dat het gen voor het groen fluorescerende eiwit draagt.

De verstoorde retinale barrière stelt AAV in staat om fotoreceptorcellen binnen te dringen, waar het virale genoom wordt tot expressie gebracht om GFP te produceren, waardoor de cellen fluorescent worden.

Dissekeer het oog om het hoornvlies en de lens te verwijderen, waarbij de oogkom intact blijft.

Dompel de oogkom onder in een fixeeroplossing om de retinale structuur te behouden.

Breng de oogkom opeenvolgend over naar oplossingen met een toenemende concentratie cryoprotectant. Incubeer deze vervolgens in de uiteindelijke concentratie om de vorming van ijskristallen te voorkomen.

Bed the oogkom in cryo-medium en vries deze in.

Snijd de oogcup met een cryostaat in dunne plakjes.

Monteer de sectie op een objectglas. Voeg een buffer toe die detergentia bevat om het weefsel te permeabiliseren, zodat antilichamen tijdens de daaropvolgende immunokleuring toegang hebben.

Spoel de sectie af. Behandel deze met een blokkeringsoplossing om aspecifieke antilichaaminteracties tijdens de immunostaining te voorkomen.

De cryos