JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 2:54 min. • August 31st, 2026
Neem een oog geoogst van een muismodel met een verstoorde retinale barrière, vooraf geïnjecteerd met adeno-geassocieerd virus dat het gen voor het groen fluorescerende eiwit draagt.
De verstoorde retinale barrière stelt AAV in staat om fotoreceptorcellen binnen te dringen, waar het virale genoom wordt tot expressie gebracht om GFP te produceren, waardoor de cellen fluorescent worden.
Dissekeer het oog om het hoornvlies en de lens te verwijderen, waarbij de oogkom intact blijft.
Dompel de oogkom onder in een fixeeroplossing om de retinale structuur te behouden.
Breng de oogkom opeenvolgend over naar oplossingen met een toenemende concentratie cryoprotectant. Incubeer deze vervolgens in de uiteindelijke concentratie om de vorming van ijskristallen te voorkomen.
Bed the oogkom in cryo-medium en vries deze in.
Snijd de oogcup met een cryostaat in dunne plakjes.
Monteer de sectie op een objectglas. Voeg een buffer toe die detergentia bevat om het weefsel te permeabiliseren, zodat antilichamen tijdens de daaropvolgende immunokleuring toegang hebben.
Spoel de sectie af. Behandel deze met een blokkeringsoplossing om aspecifieke antilichaaminteracties tijdens de immunostaining te voorkomen.
De cryossectie van het netvlies is klaar voor verdere immunokleuringen en fluorescentie-imaging. GFP-positieve fluorescerende cellen tonen een succesvolle virale transductie aan, wat duidt op de permeabiliteit van het netvlies.
Na het oogsten van de ogen van een geëuthanaseerd, geïnjecteerd dier, worden de ogen gedissecteerd om de lens en het hoornvlies te verwijderen. Fixeer daarna het gedissecteerde oog door immersie in 4% paraformaldehyde gedurende een uur. Na een uur worden de ogen cryoprotectief behandeld in 10% sucrose gedurende nog een uur bij kamertemperatuur. Week de ogen vervolgens gedurende twintig minuten in 20% sucrose bij kamertemperatuur.
Laat de ogen tot slot een nacht in een 30% sucrose-oplossing bij 4 °C staan. Inbed en bevries de volgende dag de oogcups in een inbedhars zoals cryo matrix. Maak vervolgens met de cryostaat coupes van 10 µm en monteer deze op glaasjes die geschikt zijn voor bevroren weefsel.
Permeabilise nu de secties op de objectglazen gedurende vijf minuten met detergent. Volg dit met twee korte wasbeurten in PBS. Blok daarna de ogen gedurende een uur bij kamertemperatuur.